Tsistanosiid A vahendab P38/MAPK teed osteoklastide aktiivsuse pärssimiseks

Abstraktne

TAUST:Tsistanosiid Aonpõletikuvastase toimega, antioksüdatsioon,neerukahjustuse vähendamine ja osteoporoosivastane toime, kuid selle mõjuosteoklastide diferentseerumine, funktsioon ja aluseks olevad molekulaarsed mehhanismid jäävad ebaselgeks. EESMÄRK: uurida selle mõjuTsistanosiid Apealosteoklastdiferentseerimine jaluu resorptsioonindutseeritud tuumafaktori kappa-B ligandi (RANKL) aktivaatori poolt in vitro ja selle mehhanismi poolt.

MEETODID: Luuüdi makrofaagid saadi 4-6-nädala vanuste C57BL/6 hiirte reieluust ja sääreluust. Tsistanosiidi A (5, 10, 20, 40, 80 ja 160 μmol/L) tsütotoksilist toimet luuüdi makrofaagide elujõulisusele uuriti rakkude loenduskomplekti{10}} testikomplekti abil. Erinevate kontsentratsioonide mõju jälgimiseks viidi läbi tartraadiresistentne happefosfataasi värvimineTsistanosiid Amäärati osteoblastide diferentseerumise ja selle efektiivse sekkumise kontsentratsioon. Oli positiivne kontrollrühm, tsistanosiidi A madala, keskmise ja suure annuse rühmad (40, 80 ja 160 μmol/L). Pärast rakkude kinnitumist lisati 50 ng/ml RANKL-i, et indutseerida osteoblastide diferentseerumist, ja vastav tsistanosiidi A annus lisati vastavalt tsistanosiidi A madala, keskmise ja suure annuse rühmale. F-aktiinitsükli ja 2-(4-amidinofenüül)-6-indolekarbamidiindivesinikkloriidiga värvimine viidi läbi, et tuvastadaTsistanosiidi A toimedpealosteoklastide moodustumine. Tsistanosiidi A mõju jälgimiseks osteoklastide luu resorptsiooni funktsioonile kasutati luu abrasioonilõikude värvimist toluidiini sinisega. JNK / MAPK raja üles- ja allavoolu valkude ekspressioon tuvastati Western blot abil. Osteoklastide diferentseerumise ja luu resorptsiooni funktsiooniga seotud geenide, nagu tartraadiresistentne happeline fosfataas, DC-STAMP, Nfatc-1, Ctsk ja c-Fos, ekspressioon tuvastati RTqPCR abil. TULEMUSED JA KOKKUVÕTE: Tartraadiresistentne happefosfataasi värvimine, F-aktiini tsükli värvimine ja resorptsioonikaevude test näitas, et tsistanosiid A oluliseltpärssis RANKL-i indutseeritud osteoklastide diferentseerumistjaluu resorptsioonannusest sõltuval viisil võrreldes positiivse kontrollrühmaga. RT-qPCR tulemused näitasid, et võrreldes positiivse kontrollrühmaga võivad tsistanosiid A kõrge ja väikese annuse rühmad oluliselt vähendada tartraadiresistentse happelise fosfataasi, DC-STAMP, Nfatc-1, Ctsk ja mRNA ekspressiooni. c-Fos annusest sõltuval viisil. Western blot analüüsi tulemused näitasid, et tsistanosiidi A suure annusega rühm inhibeeris märkimisväärselt p-JNK valgu ekspressiooni 10, 20, 30 ja 60 minuti jooksul pärast sekkumist; võrreldes positiivse kontrollrühmaga inhibeeris tsistanosiid A oluliselt Nfatc1 ja c-Fos valkude ekspressiooni annusest sõltuval viisil. Kokkuvõtteks võib öelda, et tsistanosiid A võib inhibeerida osteoklastide moodustumist ja luu resorptsiooni, vähendades p-JNK valgu taset, inhibeerides MAPK raja aktiveerimist ja võtmegeenide ekspressiooni osteoklastides.

Märksõnad: Tsistanosiid A; osteoklast; MAPK; JNK; RANKL; KOHT;osteoporoos; fenüületanoidglükosiidid

CISTANCHE TÖÖTAMISEKS OSTEOKLASTIDE AKTIIVSUSE pidurdamiseks

0 Sissejuhatus Sissejuhatus

Epidemioloogilised uuringud on näidanud, et maailma elanikkonna kasvades ja vananedes suureneb osteolüütiliste haiguste, nagu osteoporoos ja osteoartriit, esinemissagedus veelgi [1]. Praegused uuringud näitavad, et osteolüütiliste haiguste patogeneesis põhjustab osteoklastide funktsiooni liigsest aktiveerumisest tingitud luu resorptsiooni ja luu taastamise tasakaalustamatus oluliselt luumahu, luutiheduse ja luu mikrostruktuuri vähenemist. Kahjulik halvenemine, suurendab luude haprust ja luumurdude riski [2-3]. Seetõttu on osteoklastid peamine rakuline sihtmärk osteoporoosi raviks tõhusate ainete tuvastamisel ja väljatöötamisel. Praegu sageli kasutatavatel osteoklaste inhibeerivatel ravimitel, nagu denosumab (RANKL-i vastane antikeha), bisfosfonaadid jne, on aga kõrvaltoimed, nagu nefrotoksilisus, osteonekroos, endomeetriumivähi risk ja lõualuu osteonekroos [4-5 ]. Seetõttu on suur kliiniline tähtsus leida uusi ravimeid, mis võivad inhibeerida osteoklastide aktiivsust.

Osteoklastide diferentseerumist ja luu resorptsiooni funktsiooni reguleerivad peamiselt kaks signaalmolekuli, makrofaagide kolooniaid stimuleeriv faktor ja tuumafaktori κB ligandi (RANKL) retseptori aktivaator [6]. Osteoklastide prekursorrakumembraanil asuv kolooniaid stimuleeriva faktori 1 retseptor (c-fms) seondub makrofaagide kolooniaid stimuleeriva faktoriga ja soodustab tuumafaktori kappa B (RANK) retseptori aktivaatori ekspressiooni. RANKL ja RANK seondumine raku pinnal aktiveerib transkriptsioonifaktoreid nagu tuumafaktor κB, JNK, p38 ja JNK, mis omakorda aktiveerib transkriptsioonifaktori c-Fos, aktiveeritud T-rakkude tuumafaktori c1 (Nfatc1) jne. tuum, aktiveerides luu prekursorrakkude hävitamise, moodustavad mitmetuumalised rakud ja diferentseeruvad lõpuks osteoklastideks [7-9].

Cistanche deserticolaon üks kliinilises praktikas kõige sagedamini kasutatavaid Hiina meditsiinilisi materjale. See on Orobanchiaceae taime Cistanche deserticola või Cistanche tuberosum ketendavate lehtedega kuivatatud lihakas vars [10]. Traditsiooniline meditsiin usub, et Cistanche deserticola on oma olemuselt soe, magusa ja soolase maitsega ning pöördub tagasi neerude ja jämesoole meridiaanidesse. Sellel on neeru yangi toitev, essentsi ja verd täiendav toime, soolestikku niisutav ja lahtistav toime ning seda kasutatakse impotentsuse, viljatuse, lihaste ja luude raviks, mis on põhjustatud ebapiisavast neeru yangist ja essentsist ning verepuudusest. Sellised haigused nagu nõrkus on kooskõlas traditsioonilises meditsiinis osteolüütiliste haiguste ravis kasutatavate maksa ja neerude toniseerivate ravimeetoditega. Farmakoloogilised uuringud on näidanud, et Cistanche deserticola peamine toimeaine on fenüületanoidglükosiidid, millel on hea ohutus ja ulatuslikud meditsiinilised funktsioonid [11]. Tsistanosiid A (molekulvalem: C36H48O20) on looduslik fenüületanoolglükosiidühend, mis on eraldatud ja puhastatud traditsioonilisest Hiina meditsiinist Cistanche deserticola. Sellel on põletikuvastane, antioksüdant ja kasvajavastane toime [12-14]. Uuringud on näidanud, et Cistanche deserticola A võib vähendada c-Fos taset etanoolist põhjustatud ägeda maksakahjustusega hiirte primaarsetes rakkudes [15]. Teised uuringud on näidanud, et Cistanche A võib RANKL/TNF retseptoriga seotud faktori 6 (TRAF6) raja kaudu parandada trabekulaarse luu struktuurseid parameetreid munasarjade eemaldatud osteoporoosiga hiirtel [16]. Siiski puuduvad täiendavad uuringud tsistanchesiid A mõju kohta osteoklastide diferentseerumisele ja potentsiaalsetele molekulaarsetele mehhanismidele. Selle uuringu eesmärk on uurida tsistanchesiid A mõju osteoklastide diferentseerumisele ja luu resorptsiooni funktsioonile in vitro ning võimalikke molekulaarseid mehhanisme, et leida uusi potentsiaalseid ravimeid osteoklastide diferentseerumise pärssimiseks.

1 Materjalid ja meetodid Materjalid ja meetodid

1.1 Disain

In vitro rakukatsete jaoks viidi läbi t-test ja ühesuunaline ANOVA.

1.2 Aeg ja koht

Lõpetatud 2022. aasta detsembrist 2023. aasta detsembrini Shanxi meditsiiniülikooli teise haigla luu- ja pehmete kudede vigastuste parandamise laboris.

1.3 Materjalid

1.3.1 Katseloomad

SPF klassi 4-nädalased C57BL/6 hiired, isased või emased, osteti Shanxi meditsiiniülikooli katseloomade keskusest, tootmislitsentsi number: SCXK (Jin) 2019-0004. Eksperimentaalseid hiiri hoiti standardkeskkonnas: toatemperatuur 26 kraadi, niiskus umbes 55%, valguse käes 12 tundi päevas, vaba liikumine ja sõltumatu söömine. Katseprotokolli kiitis heaks Shanxi meditsiiniülikooli teise haigla katseloomade heaolu ja eetika komitee (kinnitusnumber: DW2023031).

1.3.2 Reaktiivid ja ravimid

Tsistanhesiid A (puhtusaste 98%, CAS 93236-42-1) osteti ettevõttelt Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.; veise loote seerum ja kõrge glükoosisisaldusega MEM sööde osteti ettevõttelt HyClone Company of USA; trüpsiin-EDTA seedimislahus 0,25%, punaste vereliblede lüüsilahus, 1 × PBS, penitsilliini-streptomütsiini segu (x 100), toluidiinsinise värvimislahus (1/100, boraadi meetod), rodamiiniga märgistatud falloidiin ring

Peptiid (kat. nr CA1610) ja DAPI peits (kasutusvalmis) osteti ettevõttelt Beijing Solebao Technology Co., Ltd. ning hiire rekombinantne makrofaagide kolooniaid stimuleeriv faktor ja hiire rekombinantne tuumori nekroosifaktori ligandi superperekond RANKL osteti ettevõttelt Beijing Ze Xiyuan Biotechnology Co., Ltd.; CCK-8 komplekt osteti Ameerika Ühendriikide ettevõttelt MCE Company, tartarresistentse happelise fosfataasi (TRAP) värvimiskomplekt osteti firmalt Sigma-Aldrich Company of USA, RNAiso Plus, premix tüüpi pöördtranskriptsioonireaktiivid, TB Green® Kiire qPCR segu,

Prime Script TM RT Master Mix ja Trizol osteti firmalt Takara Company Ameerika Ühendriikidest; dendriitraku-spetsiifiline transmembraanne valk (DC-STAMP), TRAP, CTSK, c-Fos, NFATc-1 spetsiifilised PCR-praimerid osteti ettevõttelt Sangon Bioengineering (Shanghai) Co., Ltd.; -aktiini antikeha, c-Fos antikeha, Nfatc1 antikeha, JNK antikeha ja p-JNK antikeha, m-IgG Fc BP-HRP osteti Santa Cruzist, USAst.

Biotehnoloogia korporatsioon.

1.4.6 Luu resorptsiooni katse osteoklastide luu resorptsioonivõime testimiseks

Luuüdi makrofaagid külvati 96-süvendiga plaadile, millele asetati eelnevalt steriliseeritud veise luuviilud tihedusega 7 × 103 süvendi kohta. Igasse süvendisse lisati 100 µl kultiveerimissöödet ja jagati positiivseks kontrollrühmaks ja väikeses annuses Cistanche A. rühm (40 μmol/L) ja tsistanchesiid A suure doosiga rühm (160 μmol/L), iga rühm oli varustatud 5 mitme auguga, millest 3 mitu auku asetati veise luuviiludega ja ülejäänud 2 mitut auku kasutati luuüdi makrofaagide ekspressiooni jälgimiseks. Kleepuv ja osteoklastide moodustumine. Pärast rakkude kleepumist positiivne kontrollrühm ja tsisantsid

Osteoklastide diferentseerumise esilekutsumiseks lisati kõikidele rühmadele RANKL kontsentratsioonis 50 ng/ml. Tsistanhesiid A väikese ja suure annusega rühmadele lisati sekkumiseks vastavalt 40 μmol / l või 160 μmol / l tsistanchesiid A ja söödet vahetati iga 48 tunni järel. Pärast 14-päevast kultiveerimist võtke veise luulõigud välja, peske luulõigud kaks korda PBS-iga, lisage 70% isopropüülalkoholi ja 15-minutilist suure võimsusega ultrahelipuhastust, et ülejäänud rakud ära pesta, lisage toluidiinsinist (1%, lahustunud). vees) värvilahuses ja värvige toatemperatuuril 2 sekundit. 1 minuti pärast loputage luufragmente topeltdestilleeritud veega, et eemaldada värvaine jäägid. Värvitud luulõike vaadeldi ja pildistati stereomikroskoobiga ning luu resorptsioonilünkade pindala loendati Image J tarkvara abil.

1.4.7 RT-PCR

Intratsellulaarse luu resorptsiooni funktsiooni ja osteoklastidega seotud geenide ekspressiooni tuvastamiseks külvati luuüdi makrofaagid 6-süvendiga plaadile 1,5 × 105 süvendi kohta ja igasse süvendisse lisati 100 μl söödet ja jagatud positiivseks kontrollrühmaks, Cistanche A väikese annuse rühmaks (40 μmol/L) ja Tsistancheside A suure annuse rühmaks (160 μmol/L). Nii positiivsele kontrollrühmale kui ka tsistanchesiid A rühmale lisati 50 ng/ml RANKL-i indutseerijat.

Osteoklastide diferentseerumise esilekutsumiseks lisati sekkumiseks 40 μmol / l või 160 μmol / l tsistanhesiidi A väikese ja suure annusega rühmadesse. Söödet vahetati iga 48 tunni järel. Vaatlus viidi läbi pöördmikroskoobi all kolm või neli päeva pärast induktsiooni. Mikroskoobi all täheldati, et luuüdi makrofaagid olid just sulandunud. Lisage rakkude lüüsimiseks TRIzol, lisage kloroform, asetage 10 minutiks jääle ja aspireerige segu

Lisage 1,5 ml EP tuubidesse 200 μL kloroformi igasse katsutisse, loksutage 15 sekundit, seejärel laske 15 minutit jääl seista, tsentrifuugige 4 kraadi juures, 12 000 p/min 10 minutit, võtke supernatant, lisage võrdne kogus isopropüülalkoholi ja asetada jääle. Laske seista 10 minutit, visake supernatant ära, tsentrifuugige 4 kraadi juures kiirusel 120, 000 p/min, peske 75% etanooli lahusega koos steriilse ensüümivaba vee mahuosaga ja kuivatage õhu käes, et saada. kogu RNA. Kasutage Prime ScriptTMRT Master mix pöördtranskriptsiooni komplekti, et konfigureerida 20 μL süsteem cDNA sünteesimiseks pöördtranskriptsiooniks. Seejärel konfigureerige PCR-i töösüsteem vastavalt komplekti juhistele ja teostage tuvastamine fluorestsents-kvantitatiivse PCR-seadmega. PCR reaktsiooni tingimused olid: eeldenatureerimine 95 kraadi juures 5 minutit; denatureerimine 95 kraadi juures 10 sekundit, lõõmutamine ja pikendamine 60 kraadi juures 30 sekundit, kokku 40 tsüklit. Praimeri järjestus on näidatud tabelis 1.

Pärast lihtsa -MEN söötme lisamist ja 3-tunnist nälgimist lisati tsistanhesiid A rühmale sekkumiseks 160 μmol/L tsistanchesiid A. Pärast nälgimise lõppu lisati igale rühmale stimuleerimiseks 100 ng/ml RANKL-i. Stimuleerimisajad olid vastavalt 0, 10, 20, 30 ja 60 minutit. Pärast stimulatsiooniaja lõppemist sööde visati ära ja pesti kolm korda eeljahutatud 1 × PBS-ga. Ekstraheeritud valke kasutati p-JNK, JNK ja -aktiini valkude ekspressiooni tuvastamiseks.

Pärast valgu ekstraheerimise lõpetamist kasutage valgu eraldamiseks ja PVDF membraanile ülekandmiseks geelelektroforeesi. Lisage 5% veise seerumi albumiini (BSA) blokeerimiseks 4 kraadi juures 1 tund. Blokeerimislahus visake ära, peske membraani 3 korda TBST puhvriga ja lisage primaarne antikeha. (Nfatc1 antikeha 1: 1000, c-Fos antikeha 1: 1000, p-JNK antikeha 1: 1000, JNK antikeha 1: 1000, -aktiini antikeha 1: 1000), inkubeerida 4 kraadi juures 14-16 h, pesta membraani 3 korda TBST puhvriga, lisage sekundaarne antikeha (m-IgG Fc BP-HRP, lahjendussuhe 1:5000), inkubeerige toatemperatuuril 2 tundi, lisage pärast pesemist fluorestsentslahus ja arendage geelkuvamissüsteemi all, Image Lab Tarkvara analüüsib saadud ribade halli väärtust ja kasutab sihtvalgu suhtelise ekspressiooni arvutamiseks sisemise viitena -aktiini.

1.5 Peamised vaatlusnäitajad

① RANKL-i poolt indutseeritud osteoklastide diferentseerumise tulemused pärast tsistanchesiid A sekkumist; ② Aktiinirõngaste moodustumine osteoklastide pinnal ja muutused osteoklastide luu resorptsiooni funktsioonis pärast tsistanchesiid A sekkumist; ③ Osteoklastide võti pärast tsistanchesiid A sekkumist geeniekspressiooni; ④ JNK / mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi (MAPK) raja ja p-JNK valgu allavoolu valkude ekspressioon pärast tsistanchesiid A sekkumist.

1.6 Statistiline analüüs

Statistiliseks analüüsiks ja joonistamiseks kasutati GraphPad Prism 9 tarkvara. Kõik andmed väljendati kui x-±s. Rühmadevaheliseks võrdluseks valiti t test ja ühesuunaline dispersioonanalüüs. P < 0,05 määratleti olulise erinevusena. Selle artikli statistilised meetodid on välja töötanud Shanxi meditsiiniülikooli statistikaosakond.

Kodu ülevaade.