Cistanche Tubulosa fenüületanoidglükosiidid kutsuvad esile apoptoosi H22 hepatotsellulaarsetes kartsinoomirakkudes nii välise kui ka sisemise signaaliradade kaudu

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Pengfei Yuan, Jinyu Li, Adila Aipire, Yi Yang, Lijie Xia, Xinhui Wang, Yijie Li ja Jinyao Li

Abstraktne

Taust:Cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight on traditsiooniline Hiina meditsiin, mis parasiteerib Tamarixi taime juurtes ja mida on kasutatud meeste impotentsuse, steriilsuse, keha nõrkuse raviks ja toonikuna. Selle kasvajavastane toime hepatotsellulaarsele kartsinoomile on aga endiselt tabamatu. Siin uurisime kasvajavastast toimetC. tubulosa fenüületanoidglükosiidid(CTPG) H22 hepatotsellulaarse kartsinoomi rakkudel nii in vitro kui ka in vivo ja selle mehhanismid. Meetodid: H22 rakkude morfoloogiat, elujõulisust, apoptoosi, rakutsüklit ja mitokondriaalset membraanipotentsiaali (Δψm) analüüsiti vastavalt pöördmikroskoopia, MTT testi ja voolutsütomeetria abil. Valkude ekspressioon ja aktiveerimine apoptoosi rajal tuvastati Western blot abil. In vivo kasvajavastast toimet hinnati kasvaja hiiremudelil, mis loodi isastel Kunmingi hiirtel. Tulemused: CTPG-ravi pärssis oluliselt H22 rakkude kasvu annusest ja ajast sõltuval viisil, mis oli korrelatsioonis suurenenud apoptoosi ja rakutsükli peatamisega G0/G1 ja G2/M faasides. Lisaks täheldati CTPG-ga töödeldud H22 rakkudes kromosomaalset kondenseerumist. CTPG-ravi suurendas oluliselt Bax/Bcl{10}} suhet, vähendas Δψm ja suurendas tsütokroom c vabanemist. Lõhustatud kaspaasi-8 ja kaspaasi-9 tase nii välises kui ka sisemises signaaliradades suurenes märkimisväärselt, mis järjestikku aktiveeris kaspaasi-7 ja -3 PARP-i lõhustamiseks. Lõpuks CTPG (Cistanchetubulosafenüületanoidglükosiidid) inhibeeris H22 rakkude kasvu hiirtel ja parandas kasvaja hiirte elulemust. Järeldused: Need tulemused näitasid, et CTPG pärssis H22 rakkude kasvu nii välise kui ka sisemise apoptoosi kaudu.

Taust

Maksavähk oli vähktõve esinemissageduse poolest kuuendal kohal ja vähisurmade osas neljas. Lisaks oli see madala sotsiaaldemograafilise indeksiga riikides vähktõve esinemissageduse osas neljandal kohal ja vähktõve suremuse osas esimene [1]. Hiinas on maksavähk 2015. aastal kolmas vähiga seotud surmapõhjus [2]. Rohkem kui 90 protsenti primaarsetest maksavähkidest on maailmas hepatotsellulaarne kartsinoom (HCC) [3]. Praegu on HCC ravi peamine võimalus maksa resektsioon. Vähem kui 30 protsenti HCC-ga patsientidest vastas aga raviva maksa resektsiooni kriteeriumidele ja üldine 5-aastane elulemus on kõrge retsidiivide esinemissageduse tõttu endiselt madal kuni 35-50 protsenti [4, 5 ]. Keskmise kuni kaugelearenenud HCC-ga patsientide ravivõimaluste kättesaadavus on väga piiratud. Sorafeniib, molekulaarselt suunatud ravim, on FDA poolt heaks kiidetud arenenud HCC esmavaliku raviks. Sorafeniib pikendab aga elulemust vaid umbes 3 kuud ja ravivastuse määr on alla 4 protsendi [6, 7]. Kiiresti on vaja välja töötada uued ravimid või strateegiad HCC vastu. Traditsioonilist hiina meditsiini (TCM) üksi või kombineerituna teiste strateegiatega on kasutatud HCC raviks ja see on näidanud kliinilist kasu, sealhulgas elulemuse pikenemine, elukvaliteedi paranemine, kõrvaltoimete vähenemine ja nii edasi [8, 9].Cistanche, omamoodi TCM, omab erinevaid bioloogilisi funktsioone, naguoksüdatsioonivastane, põletikuvastane, vananemisvastane,ja neuroprotektsioon [10, 11]. Fenüületanoidglükosiide on peetud peamisteks aktiivseteks komponentideksCistanche, millel on mitmekesine toime, sealhulgas oksüdatsioonivastane, põletikuvastane, hepato- ja neuroprotektsioon [12–15]. Meie rühm on sellest teatanudCistanche tubulosa fenüületanoidglükosiidid(CTPG) võib kutsuda esile apoptoosi melanoomi B16-F10 rakkudes ja pärssida kasvajate kasvu hiirtel [16]. Selles uuringus mõõtsime CTPG kasvajavastast toimet HCC H22 rakkudele nii in vitro kui ka in vivo ning uurisime selle mehhanisme. Leidsime, et CTPG indutseeris H22 rakkudes apoptoosi nii väliste kui ka sisemiste signaaliradade kaudu ja pärssis H22 kasvajate kasvu hiirtel.

meetodid

Raku liin

Hiire H22 hepatotsellulaarse kartsinoomi rakud saadi Xinjiangi bioloogiliste ressursside ja geenitehnoloogia võtmelaborist, Xinjiangi ülikool (Urumqi, Xinjiang, Hiina) ja neid kultiveeriti RPMI 1640 söötmes (Gibco), millele oli lisatud 100 U/ml penitsilliini ja 100 ug/ml. streptomütsiini ja 10% kuumusega inaktiveeritud veise loote seerumit (Gibco) temperatuuril 37 kraadi 5% CO2-sisaldusega niisutatud atmosfääris.

MTT analüüs

CTPG osteti ettevõttelt Hetian Dichen Biotech Co., Ltd. (Hetian, Xinjiang, Hiina) ning CTPG peamised ühendid kvalifitseeriti ja kvantifitseeriti kõrgsurvevedelikkromatograafia abil [16]. Rakkude elujõulisust hinnati 3- (4, 5-dimetüültiasool-2-üül)-2, 5-difenüültetrasooliumbromiidi (MTT) (Sigma, St. Louis, MO) abil , USA) test. H22 rakud inokuleeriti 96-süvendiplaatidele tihedusega 2 × 104 rakku 100 ul söötmes süvendi kohta ja kultiveeriti 37 kraadi juures. 24 tunni pärast töödeldi rakke erineva kontsentratsiooniga CTPG (0, 100, 200, 300 ja 400 ug/ml) või 0,3% DMSO-ga (võrdne 400 ug/ml CTPG-ga) vastavalt 24, 48 ja 72 tundi. . Pärast tsentrifuugimist kiirusel 1000 p/min 7 minutit, supernatant visati ära ja igasse süvendisse lisati 100 ui MTT lahust (5 mg/ml PBS-s). Plaate inkubeeriti 37 kraadi juures 4 tundi ja moodustunud formatsaani kristallide lahustamiseks lisati 100 ul DMSO-d. OD490 väärtused tuvastati 96- süvendiga mikroplaadilugejaga (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). Rakkude elujõulisus arvutati järgmise valemi järgi: rakkude elujõulisus (protsent)=(OD-töödeldud/OD-ravimata) × 100 protsenti.

Apoptoosi tuvastamine

H22 rakke töödeldi erineva kontsentratsiooniga CTPG-ga (0, 100, 200, 300 ja 400 ug/ml) või 0,3% DMSO-ga 24 tundi ja seejärel värviti anneksiin V FITC/-ga. Propiidiumjodiidi (PI) apoptoosi tuvastamise komplekt (YEASEN, Hiina) vastavalt tootja juhistele. Proove analüüsiti voolutsütomeetria abil (BD FACSCalibur, USA).

Mitokondriaalse membraani potentsiaali tuvastamine

H22 rakke töödeldi erinevate kontsentratsioonidega CTPG-ga (0, 200 ja 400 ug/ml) 24 tundi ja seejärel värviti membraaniläbilaskva JC-1 värviga (Beyotime, Hiina) 20 tundi. min 37 kraadi juures. Pärast kahekordset pesemist JC-1 puhvriga resuspendeeriti proovid 300 ul JC-1 puhvriga ja analüüsiti voolutsütomeetriaga (BD FACSCalibur, USA).

Rakutsükli analüüs

H22 rakud inokuleeriti 60 mm kultuuritassidele ja töödeldi erineva kontsentratsiooniga CTPG-ga (0, 100, 200, 300 ja 400 ug/ml) või 0,3% DMSO-ga. 24 h. Kõik rakud koguti ja pesti kaks korda PBS-ga. Rakud fikseeriti 70% jääkülmas etanoolis temperatuuril –20 kraadi 2 tundi ja pesti kaks korda PBS-iga, seejärel suspendeeriti uuesti 300 ul propiidiumjodiidi/RNaasi värvimispuhvris (BD Biosciences). Pärast 10 minutit toatemperatuuril koguti proovid voolutsütomeetria abil (BD FACSCalibur, USA) ja rakutsükli jaotust analüüsiti tarkvaraga ModFit LT 3.0.

Hoechst 33 258 värvimine

H22 raku tuumade morfoloogilisi muutusi analüüsiti membraani läbilaskva DNA-d siduva värviga Hoechst 33 258 värvimisega. H22 rakud külvati 6-süvendiga plaadile kontsentratsiooniga 1 × 105 rakku süvendi kohta 2 ml söötmes. Pärast 60-70-protsendilist liitumist töödeldi rakke CTPG-ga (0, 100, 200, 300 ja 400 ug/ml) 24 tundi. Rakud koguti ja fikseeriti 4% jääkülma paraformaldehüüdiga 4 kraadi juures 10 minutit. Pärast PBS-ga pesemist värviti rakke Hoechst 33 258-ga (Beyotime, Hiina) 4 kraadi juures 10 minutit. Proove vaadeldi ümberpööratud fluorestsentsmikroskoobiga (Nikon Eclipse Ti-E, Jaapan).

Western blot

Anti-kaspaas-3, anti-kaspaas-3, Anti-Bcl-2 ja anti-Bax osteti ettevõttelt Beyotime Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Hiina). Anti-kaspaas-7, anti-kaspaas--7, anti-kaspaas-8, anti-kaspaas--8, anti-kaspaas-9, anti-kaspaas -lõhustatud kaspaas-9, anti-PARP, anti-lõhustatud PARP, anti-hiire IgG-HRP ja anti-küüliku IgG-HRP osteti ettevõttest Cell Signaling Technology. Anti- -aktiini osteti ettevõttelt Beijing ComWin Biotech Co., Ltd. (Peking, Hiina).

H22 rakke töödeldi erineva kontsentratsiooniga CTPG-ga (0, 100, 200, 300 ja 400 ug/ml) või 0,3% DMSO-ga 24 tundi. Rakud koguti ja lüüsiti rakulüüsilahusega RIPA (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) 30 minutit jääl. Proove tsentrifuugiti (12,{11}} g 15 minutit temperatuuril 4 kraadi) supernatantide kogumiseks ja valgukontsentratsioone mõõdeti BCA komplektiga (Thermo Fisher Scientific, USA). Igas proovis eraldati võrdne kogus valku 12% SDS-PAGE abil ja kanti üle PVDF membraanidele (Biosharp, Hiina). Pärast blokeerimist TBST puhvriga, mis sisaldas 5 protsenti rasvavaba piima, inkubeeriti membraane vastavalt vastavate primaarsete antikehade ja sekundaarsete antikehadega, mis olid konjugeeritud mädarõika peroksidaasiga (HRP). Pärast TBST-ga pesemist tuvastati sihtvalgud ECL-testikomplektiga (Beyotime, Hiina).

Loomad ja eetikaavaldus

6-8 nädala vanused isased Kunmingi hiired osteti Xinjiangi meditsiiniülikooli (Urumqi, Xinjiang, Hiina) Animal Laboratory Centerist. Hiiri peeti Xinjiangi ülikooli standardses kontrollitud temperatuuriga valgustsükliga loomakasvatusasutuses. Kõik loomkatsed viidi läbi vastavalt Xinjiangi ülikooli loomade hooldamise ja kasutamise komitee juhistele. Protokolli kiitis heaks Xinjiangi ülikooli Xinjiangi bioloogiliste ressursside ja geenitehnoloogia võtmelabori (BRGE-AE001) loomkatsete eetika komitee.

Kasvaja hiire uuring

Kasvaja hiiremudeli esilekutsumiseks süstiti isastele Kunmingi hiirtele parempoolsesse külge subkutaanselt 1 × 106 H22 rakku 100 ul PBS-s. 3 päeva pärast jagati hiired juhuslikult 3 rühma (7 hiirt rühma kohta). Kontrollrühmale süstiti kasvaja ümber subkutaanselt 0, 1 ml DMSO-d. CTPG-200 ja CTPG- 400 rühmadele süstiti kasvaja ümber subkutaanselt 200 või 400 mg/kg CTPG-d 0,1 ml DMSO-s. Hiiri raviti iga 2 päeva järel kuni 21 päeva. Kasvajate suurusi mõõdeti nihikutega kuni 25 päeva ja kasvaja maht arvutati järgmise valemi järgi: kasvaja maht (mm3)=(pikkus × laius2)/2. 25 päeva pärast jälgiti kasvaja hiirte ellujäämist iga päev kuni selle uuringu lõpuni.

Statistiline analüüs

Statistiline olulisus arvutati ühesuunalise dispersioonanalüüsiga ravi- ja kontrollrühmade vahel. Kõik andmed väljendati keskmisena ± standardhälbe (SD). p < 0,05="" loeti="" statistiliselt="">

Tulemused

CTPG vähendas H22 rakkude elujõulisust in vitro

CTPG kasvajavastase toime uurimiseks HCC-le töödeldi H22 rakke in vitro erinevate CTPG kontsentratsioonidega (0, 100, 200, 300 ja 400 ug/ml). 24 tunni pärast jälgiti ümberpööratud mikroskoobi abil H22 rakkude morfoloogiat. Leidsime, et CTPG-ravi muutis dramaatiliselt H22 rakkude morfoloogiat. CTPG kontsentratsiooni suurenemisega muutusid rakud väikeseks ja ümaraks ning rakkude arv vähenes samuti oluliselt (joonis 1a). MTT testi kasutati H22 rakkude elujõulisuse analüüsimiseks pärast CTPG-ga töötlemist vastavalt 24, 48 ja 72 tundi. CTPG vähendas oluliselt H22 rakkude elujõulisust annusest ja ajast sõltuval viisil (joonis 1b). CTPG kontsentratsioonil 300 ug/ml saavutas parima inhibeerimismäära (joonis 1c). CTPG IC50 väärtused H22 rakkude jaoks on 236 ug/ml 24 tunni pärast ja 169,8 ug/ml 48 tunni pärast.

CTPG indutseeris H22 rakkudes apoptoosi

Et uurida, kas H22 rakkude elujõulisuse vähenemist vahendab apoptoosi esilekutsumine, töödeldi H22 rakke erinevate kontsentratsioonidega CTPG-ga (0, 100, 200, 300 ja 400 ug/ml) 24 tundi ja värviti. PI ja anneksiin V-ga. Voolutsütomeetria tulemused näitasid, et CTPG indutseeris oluliselt H22 rakkude apoptoosi (sealhulgas varajast ja hilist apoptoosi) annusest sõltuval viisil (joonis 2a). Kuigi CTPG suur annus suurendas märkimisväärselt ka H22 rakkude nekroosi, mängib nekroosil H22 rakkude kasvu pärssimisel vähest rolli, kuna selle osakaal on väiksem (8,3 protsenti) võrreldes apoptoosiga (52,6 protsenti). Peale selle isoleeriti pärast CTPG-ga töötlemist H22 rakkude üldvalgud ning apoptootilise B-rakulise lümfoomi 2 (Bcl-2) ja pro-apoptootilise BCL-2--seotud X-valgu (Bax) ekspressioonid tuvastati Western blot. Halltoonides skaneerimise andmed näitasid, et Baxi ja Bcl-2 ekspressioonitasemed suurenesid ja vähenesid vastavalt. Bax/Bcl-2 suhe suurenes oluliselt (joonis 2b). Need tulemused viitavad sellele, et CTPG indutseerib H22 rakkudes apoptoosi.

CTPG kutsub esile kromosomaalse kondenseerumise ja rakutsükli peatamise H22 rakkudes

On teatatud, et ravimite poolt indutseeritud DNA kahjustus ja rakutsükli seiskumine võivad pärssida kasvajarakkude kasvu ja põhjustada kasvajarakkudes apoptoosi [17, 18]. Tuumade morfoloogia tuvastamiseks H22 rakkudes pärast 24-tunnist CTPG-ga töötlemist värviti H22 rakud Hoechst 33 342-ga ja jälgiti pööratud fluorestsentsmikroskoopia abil. CTPG-ga töödeldud rakkudes ilmnes tuumade eredalt kondenseerunud kromatiini annusest sõltuv suurenemine, samal ajal kui töötlemata rakkudel ilmnesid homogeenselt värvunud tuumad (joonis 3a). Rakutsükli jaotust H22 rakkudes analüüsiti pärast 24-tunnist CTPG-ga töötlemist täiendavalt PI värvimisega. Nagu on näidatud joonisel 3b, suurendas CTPG-ravi oluliselt G0/G1- ja G2/M-faasi rakkude osakaalu ning vähendas oluliselt S-faasi rakkude osakaalu, mis viitab sellele, et CTPG indutseeris G-d 0/G1 ja G2/M faasiseiskus H22 rakkudes. CTPG suur annus suurendas oluliselt ka sub-G1 rakkude osakaalu.

CTPG vähendas mitokondriaalse membraani potentsiaali ja suurendas tsütokroom c vabanemist

Mitokondritest sõltuv rada mängib apoptoosi esilekutsumisel olulist rolli [19, 20]. Mitokondriaalse membraani potentsiaali (Δψm) muutusi saab jälgida JC-1 värvimisega, kuna JC-1 agregaat (punane fluorestsents) võib laguneda monomeeriks (roheline fluorestsents) koos Δψm [21] vähenemisega. Pärast 24-tunnist CTPG-ga töötlemist värviti H22 rakud JC- 1 värviga. Voolutsütomeetria andmed näitasid, et punane fluorestsents FL-2 kanalis ja roheline fluorestsents FL-1 kanalis vähenesid oluliselt ja suurenesid CTPG-ga töötlemisel. PE-FITC pluss rakkude osakaal suurenes oluliselt (joonis 4a), mis viitab sellele, et CTPG vähendas Δψm H22 rakkudes. See on kooskõlas suurenenud Bax/Bcl{13}} suhtega. Järelikult täheldasime, et tsütokroom c vabanemine suurenes CTPG-ravi korral oluliselt (joonis 4b). Need tulemused näitasid, et CTPG võib osaliselt indutseerida apoptoosi H22 rakkudes mitokondriaalsest sõltuva (sisemise) raja kaudu.

CTPG aktiveeris kaspaasi raja ja takistas DNA paranemist

Järgmisena analüüsiti CTPG poolt indutseeritud kaspaasi aktiveerimist nii välise kui ka sisemise signaaliradade kaudu. Pärast 24-tunnist töötlemist CTPG-ga eraldati H22 rakkudest koguvalgud ning pro- ja lõhustatud kaspaaside tasemed tuvastati Western blot abil. Võrreldes töötlemata või DMSO-kontrolliga reguleeris CTPG-ravi oluliselt mitte ainult lõhustatud kaspaasi -8 (välimine rada), vaid ka lõhustatud kaspaasi -9 (sisemine rada) taset (joonis 1). 5). Aktiveeritud kaspaas-8 ja -9 lõikasid järjestikku allavoolu pro-kaspaasi-3 ja -7, mida täheldati joonisel 5. Aktiveeritud kaspaas-3 lõikas DNA. polü(ADP-riboosi) polümeraasi (PARP) parandusensüüm, et vältida DNA paranemist ja akumuleerida DNA kahjustusi, nagu on näidatud joonisel 3a.

Need tulemused näitasid, et CTPG indutseeris H22 rakkudes apoptoosi nii väliste kui ka sisemiste signaaliradade kaudu.

CTPG pärsib H22 HCC kasvu in vivo ja parandab kasvaja hiirte ellujäämise määra

Lõpuks hinnati CTPG kasvajavastast toimet HCC-le kasvaja hiiremudelis, mis määrati kindlaks H22 rakkude subkutaanse süstimisega. Pärast 3-päevast H22 raku süstimist töödeldi kasvajahiiri CTPG-ga 8 korda. Hiirte kehakaalu ja kasvaja suurust jälgiti näidatud ajahetkedel. Nagu on näidatud joonisel fig 6a, ei erine iga rühma hiirte kehakaal olulist erinevust, mis viitab sellele, et valitud CTPG annustel ei ole ilmseid kõrvalmõjusid. Huvitav on see, et kasvaja kasv hiirtel, keda raviti nii 200 mg/kg kui ka 400 mg/kg CTPG-ga, oli oluliselt pärsitud (joonis 6b). Peale selle parandasid kaks CTPG-ravi annust oluliselt kasvaja hiirte ellujäämist (3/7, 3/7) võrreldes kontrollrühmaga (0/7) katse lõpus (joonis 6b). Samuti leidsime, et CTPG suurendas oluliselt isastelt Kunmingi hiirtelt eraldatud splenotsüütide proliferatsiooni annusest sõltuval viisil (joonis 6c), mis viitab sellele, et CTPG-l on immunostimuleeriv toime.

Arutelu

TCM-i on pikka aega kasutatud mitmesuguste haiguste, sealhulgas vähi raviks. On teatatud, et TCM võib kasvajavastase toime avaldamiseks esile kutsuda apoptoosi erinevat tüüpi kasvajarakkudes nii välise (surmaretseptori poolt vahendatud) kui ka sisemise (mitokondritest sõltuva) signaaliradade kaudu [22–25]. Need kaks rada võivad aktiveerida vastavalt kaspaasi -8 ja -9 [24, 26]. Siin leidsime, et CTPG pärssis oluliselt H22 rakkude kasvu apoptoosi ja rakutsükli peatamise kaudu. Lõhustatud kaspaaside -8 ja -9 tasemed olid CTPG-raviga oluliselt ülesreguleeritud, mis viitab sellele, et apoptoosi esilekutsumisse olid kaasatud nii välised kui ka sisemised signaalirajad. Meie eelmine uuring näitas, et CTPG kutsus melanoomi B16-F10 rakkudes esile apoptoosi mitokondritest sõltuva raja kaudu, mis suurendas lõhustatud kaspaasi-9, kuid mitte kaspaasi-8 taset [16]. CTPG võib aktiveerida erinevat tüüpi kasvajarakkudes erinevaid signalisatsiooniteid.

Mitokondriaalse membraani terviklikkust reguleerivad tihedalt BCL-2 valguperekonna liikmed, sealhulgas Bax ja Bcl-2 [27, 28]. Baxi ja Bcl{4}} suhe mängib mitokondritest sõltuvas apoptoosi rajas kriitilist rolli [29]. CTPG-ga töödeldud H22 rakkudes oli Bax/Bcl-2 suhe oluliselt ülesreguleeritud, mis võib põhjustada selles uuringus täheldatud Δψm vähenemist ja tsütokroom c vabanemist. Järelikult pro-kaspaas{11}} lõhustati ja aktiveeriti. Lõpuks aktiveerisid aktiivse kaspaasi-8 ja -9 initsiaatorid kaspaasi-3 teostaja PARP-i lõikamiseks, et vältida DNA paranemist. Kokkuvõttes näitasid need tulemused, et CTPG indutseeris H22 rakkudes apoptoosi nii väliste kui ka sisemiste signaaliradade kaudu.

Kasvaja hiiremudelis pärssis CTPG märkimisväärselt H22 HCC kasvu ja parandas oluliselt kasvaja hiirte ellujäämist. Huvitaval kombel soodustas CTPG annusest sõltuvalt Kunmingi hiirte splenotsüütide proliferatsiooni, mis on kooskõlas meie eelmise uuringuga [16].

Need tulemused näitasid, et CTPG võib pärssida H22 HCC kasvu hiirtel nii otsese kasvajavastase toime kui ka kaudse immuunsüsteemi tugevdamise kaudu.

Järeldused

CTPG pärssis H22 rakkude kasvu nii in vitro kui ka in vivo ning indutseeris H22 rakkudes apoptoosi nii väliste kui ka sisemiste signaaliradade kaudu. Need andmed näitasid, et CTPG võib olla potentsiaalne kandidaat HCC raviks.