Cistanche Tubulosa kutsub esile inimese primaarsete ja metastaatiliste käärsoolevähi rakkude reaktiivsete hapnikuliikide vahendatud apoptoosi

SISSEJUHATUS

Kolorektaalne vähk on üks levinumaid vähivorme kogu maailmas (Brenneret al., 2014) ja selle esinemissagedus kasvab pidevalt, hinnanguliselt 2,4 miljonit juhtu 2035. aastal, mis on tingitud tänapäevasest toitumisest ja elustiilist ning vähenenud kehalisest aktiivsusest. Praegused jõupingutused ei ole praeguse kolorektaalse vähi epideemiaga võitlemiseks piisavad ja seetõttu on tõhusaks ennetamiseks ja raviks vaja uusi lähenemisviise, sealhulgas elustiili muutmine koos ohutumate alternatiivsete sekkumistega, nagu näiteksFütoteraapia (Weidneret al., 2015). Fütoteraapia, ravimtaimede kasutamine haiguste raviks, on olnud iidse inimkonna ajaloo vältimatu osa. Ravimtaimi on pikka aega kasutatud alternatiivsete vähiravi allikatena, moodustades üle kuuekümne protsendi tavameditsiinis kasutatavatest vähivastastest ainetest (Balunas ja Kinghorn, 2005; Saibuet al., 2015). Mõned tuntumad näited hõlmavad väljavõtteidCatharanthus roseusG. Don. (Apocynaceae), Taxus baccata L. (Taxaceae) ja Camptotheca teravik Decne (Nyssaceae) (Cragg ja Newman, 2005; da Rochaet al., 2001). Näidati, et mitmed taimsed ekstraktid ja fütokemikaalid avaldavad kasvajavastast toimet kolorektaalse vähi korral, mis on tingitud reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) tootmise indutseerimisest ja sellega seotud vähirakkude apoptoosist, nagu ka ekstraktide puhul.Melissa officinalis(Weidneret al., 2015)

Fütoteraapia kandidaatide hulgasCistanche tubulosaOrobanchaceae parasiitkõrbetaim (Jiang et al., 2009), mis on laialt levinud Aafrika, Aasia ja Vahemere piirkonna kuivades ja poolkuivades piirkondades, on näidanud, et sellel on väärtuslikud raviomadused. Cistanche tubulosa on laialdaselt kasutatud traditsioonilises meditsiinis ja sellel on oletatavasti raviv toime neerupuudulikkuse, haigusliku leukorröa, metrorraagia, naiste viljatuse ja seniilse kõhukinnisuse korral (Jiang et al., 2009). Lisaks traditsioonilisele meditsiinilisele kasutamisele on oluline ravi Cistanche Tubulosa omadusi on viimase kümnendi jooksul intensiivselt uuritud, sealhulgas vasorelaksanti (Yoshikawa et al., 2006), hepatoprotektiivset (Morikawa et al., 2010), antihüperglükeemilist ja hüpolipideemilist toimet (Xiong et al., 2013). Cistanche Tubulosa soovitati ka kui tugevat immuunsüsteemi tugevdajat, luu moodustumise soodustajat ning vananemis- ja väsimusevastast ainet (Xu et al., 2014). Lisaks on näidatud, et Cistanche tubulosa ekstrakt blokeerib amüloidi ladestumist Alzheimeri tõve mudelis (Wu et al., 2015). Vaatamata erinevatele terapeutilistele kasutustele ei ole Cistanche Tubulosa kui võimaliku vähivastase ainena mõju veel uuritud.

Käesolevas töös oleme uurinud Cistanche Tubulosa vähivastast toimet kahele primaarsele ja kahele metastaatilisele käärsoolevähi rakuliinile ning selle mõju aluseks olevaid võimalikke mehhanisme.

LOODUSLIK TUBULOOS SUGUFUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

MATERJALID JA MEETODID

Taimeekstrakti kogumine ja valmistamine

Cistanche tubulosa proovid koguti 2014. aastal Katari kõrbealadelt ja taime ehtsust kinnitas herbatoloog. Vautšeri näidised on arhiveeritud ADLQ toksikoloogia ja mitmeotstarbelise osakonna osakonnas. Päikesekuivatatud taimeproovid jahvatati Retsch Knife Mill Grindomix GM300 abil peeneks pulbriks. Kakskümmend grammi pulbrit ekstraheeriti 200 ml ülipuhta veega üleöö temperatuuril 37 kraadi pöörleval loksutil kiirusel 200 p/min. TooresCistanche tubulosa ekstraktid (CTE)tsentrifuugiti 3 0 min kiirusel 8000 pööret minutis, et sadestada lahustumatuid ühendeid, supernatant koguti ja külmkuivatati, kasutades Labconco Freezone 6 plus Freeze kuivatit. Kuivatatud ekstrakt taastati Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes (DMEM, SIGMA, Saksamaa) kontsentratsioonini 20 mg/ml ja steriilselt filtreeriti läbi 0,{8}mikronilise membraanfiltri.

Rakuliinid ja rakkude hooldus

Inimese käärsoole kartsinoomi rakuliinid CaCo2, SW620 ja LoVo saadi ettevõttest Cell Lines Service (CLS, Eppelheim, Saksamaa), samas kui HCT 116 rakuliin oli Katari ülikooli bioloogia- ja keskkonnateaduste osakonna lahke kingitus. CaCo2 ja HCT11 saadi käärsoole kartsinoomi esmasest kohast, SW620 ja LoVo aga metastaatilisest kohast. SW620, HCT116 ja LoVo rakke kasvatati ja hoiti DME söötmes, CaCo2 rakke aga Eagle'i minimaalses olulises söötmes (EMEM, SIGMA, Saksamaa). Rakke kasvatati monokihina 37 kraadi juures vastavas söötmes, millele oli lisatud 10% veise loote seerumit (FBS, SIGMA, Saksamaa) ja 1% penitsilliini/streptomütsiini (SIGMA, Saksamaa), niisutatud atmosfääris, mis sisaldas 5% süsinikdioksiidi.

Rakkude elujõulisuse test

Tsütotoksilise aktiivsuse hindamiseks kasutati {{0}}[4,5-dimetüültiasool-2-üül]-2,5-difenüültetrasooliumi (MTT) testi. CTE sarnaselt varem kirjeldatule (Jaganjac et al., 2010). CaCo2, HCT116, SW620 ja LoVo rakkude külvitihedus, mida kasvatati 96-süvendiplaatidel, oli 104 rakku süvendi kohta. Rakud plaaditi 24 tundi enne töötlemist vastavasse söötmesse, millele oli lisatud 10% FBS. 24 tunni pärast sööde eemaldati ja rakke töödeldi 0, 0,25, 0,5, 1 ja 2 mg/ml CTE-ga 24, 48 ja 72 tundi temperatuuril 37 kraadi niisutatud atmosfääris, mis sisaldas 5% CO2. Pärast CTE-ga töötlemist sööde eemaldati ja igasse süvendisse lisati 40 µl MTT lahust (0,5 mg/ml).

Pärast 3-tunnist inkubeerimist eemaldati MTT lahus, formazaan lahustati dimetüülsulfoksiidis (DMSO, SIGMA, Saksamaa) ja neeldumist mõõdeti 590 nm juures mikroplaadilugejaga (Infinite 200 PRO NanoQuant, Tecan Trading AG, Šveits). .

Apoptoosi test

Apoptoos CaCo2, HCT116, SW620 ja LoVo rakkudes tuvastati, kasutades PE anneksiin V apoptoosi tuvastamise komplekti I koos 7-aminoaktinomütsiin D-ga (7-AAD) elutähtsa värvainena (Becton). Dickinson International, Belgia) vastavalt tootja juhistele. Lühidalt öeldes külvati rakud 24-süvendiplaatidele tihedusega 5 × 104 rakku süvendi kohta vastavas söötmes, millele oli lisatud 10% FBS-i, 24 tundi enne CTE lisamist (0, 0,5). või 1 mg/ml). Pärast 24 CTE inkubeerimist rakud koguti, pesti kaks korda külma fosfaatpuhverdatud soolalahusega ja värviti fükoerütriini (PE) anneksiin V ja 7-AAD-ga 15 minutit toatemperatuuril pimedas. Värvitud rakke analüüsiti 1 tunni jooksul voolutsütomeetria abil, kasutades FACS-i. Aria III voolutsütomeeter ja FACSDiva tarkvara (Becton Dickinson) madala voolukiirusega minimaalselt 104 rakuga. Testi positiivse kontrollina kasutati rakkude töötlemist 4 tundi 6 uM kamptotetsiiniga (SIGMA).

Intratsellulaarne ROS tootmine

Intratsellulaarset ROS-i tootmist uuriti, kasutades 2,7- diklorodihüdrofluorestseiindiatsetaati (DCFH-DA, SIGMA, Saksamaa). DCFH-DA on mittefluorestseeruv sond, mis oksüdeeritakse intratsellulaarse ROS-iga fluorestseeruvaks ühendiks 2,7- diklorofluorestseiiniks (DCF) (Poljak-Blazi et al., 2011). DCFH DA test viidi läbi sarnaselt, nagu oleme varem kirjeldanud (Cindric et al., 2013; Poljak-Blazi et al., 2011). Lühidalt, 96-süvendi mustadel plaatidel kultiveeritud CaCo2, HCT116, SW620 ja LoVo rakkude külvitihedus oli 104 rakku süvendi kohta. Rakud plaaditi 24 tunniks vastavasse söötmesse, millele oli lisatud 10% FBS. Enne töötlemist inkubeeriti rakke 10 uM DCFH-DA-ga 37 kraadi juures 30 minutit 5% CO2/95% õhus. Seejärel rakke pesti ja töödeldi 0, 0,5 ja 1 mg/ml CTE-ga söötmes ilma fenoolpunaseta. Intratsellulaarset ROS-i moodustumist jälgiti pidevalt 25 tunni jooksul temperatuuril 37 kraadi ja 5% CO2, kasutades ülemise fluorestsentsi ja gaasi juhtimismooduliga mikroplaadilugejat (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Šveits). Fluorestsentsi intensiivsust mõõdeti ergastuslainepikkusel 500 nm ja emissiooni tuvastamisel lainepikkusel 529 nm. Suvalised ühikud, suhtelised fluorestsentsi ühikud (RFU), põhinesid otseselt fluorestsentsi intensiivsusel.

LOODUSLIK TUBULOOS NEERU FUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Mitokondriaalse superoksiidi teke

CTE võimet indutseerida superoksiidi teket mitokondrite poolt hinnati raku läbilaskva mitokondritele suunatud MitoSOX Red sondi (Life Technologies) ja Hoechst 33342 abil tuumavärvimiseks (Life Technologies). CaCo2, HCT116, SW620 ja LoVo rakud külvati 96-süvendiplaatidele tihedusega 104 rakku süvendi kohta vastavas söötmes, millele oli lisatud 10% FBS-i 24 tunniks. . Seejärel laaditi rakud 20 minutiks 4 uM MitoSOX-i ja 2 uM Hoechst 33342-ga, pesti üleliigne värvaine ja süvendeid töödeldi 0, 0,5 ja 1 mg/ml CTE-ga 24 tundi temperatuuril 37 kraadi ja 5% CO2. Fluorestsentsi intensiivsust mõõdeti ergastuse lainepikkusega 510 nm ja emissiooni tuvastamisega 580 nm MitoSOX ja ergastuse lainepikkusega 350 nm ja emissiooni tuvastamisega 461 nm Hoechst 33342 abil (Trading, Profinite fluorescence00 lugejaga PROfinite Tecan000 AG, Šveits)

Statistiline analüüs

Kirjeldav statistika esitati keskmisena +/− SD. Rühmadevaheliste erinevuste olulisust hinnati Studenti t-testi ja hii-ruuttesti abil. Kui võrreldi rohkem kui kahte rühma, kasutasime ühepoolset ANOVA-d koos sobiva post hoc testimisega. Kasutati Mircosoft Windowsi SPSS 11.{6}}1. Erinevusi P väärtusega alla 0,05 peeti statistiliselt olulisteks.

TULEMUSED

CTE mõju inimese käärsoolevähi rakuliinide proliferatsioonile on näidatud joonisel 1. Kõik testitud CTE kontsentratsioonid näitasid tugevat inhibeerivat toimet CaCo2 rakuliinile kontsentratsioonist ja ajast sõltuval viisil (joonis 1A). Seitsekümmend kaks tundi kestnud CTE-ravi pärssis CaCo2 rakkude kasvu rohkem kui 60% võrreldes kontrolliga (p < 0.05 kõigi kontsentratsioonide puhul). CTE-ravi märkimisväärne mõju HCT116 rakkude kasvule tuvastati ka kõigi aegade kahe kõrgeima kontsentratsiooni juures (1 mg/ml ja 2 mg/ml), saavutades viimase kontsentratsiooni korral enam kui 70% vähenemise (joonis). 1B, p < 0,05). Kuigi kaks madalamat CTE kontsentratsiooni (0,25 ja 0,5 mg/ml) vähendasid oluliselt HCT116 rakkude kasvu 24 tunni pärast (p<0.05), they had no significant effect following 72 hours of treatment compared to control (p>{{0}}.{10}}5). Ajast ja kontsentratsioonist sõltuv proliferatsiooni pärssimine CTE-ga kinnitati LoVo rakkudes rohkem kui 60% võrra kõrgeima kontsentratsiooni juures (p < 0.05) (joonis 1C), ja kõik neli testitud CTE kontsentratsiooni vähendasid SW620 rakkude kasvu 48 tunni pärast (joonis 1D, p < 0,05 kõigi jaoks). Pärast 72-tunnist ravi täheldati sama efekti ainult kahe kõrgeima kontsentratsiooni korral (p < 0,05), samas kui kontsentratsioonid 0,25 ja 0,5 mg/ml ei näidanud kontrolliga võrreldes olulist toimet (p > 0,05). 0,5 ja 1 mg/ml CTE-ravi mõju apoptoosi indutseerimisele testiti täiendavalt kõigis neljas rakuliinis (joonis 2). Pärast 24-tunnist töötlemist 0,5 mg/ml (p) HCT116 ja LoVo tuvastati varase apoptoosi korral suurenenud rakkude arv<0.05, Figure 2B and 2C) and in all cell lines at 1 mg/mL (p<0.05). A significant increase in necrotic or late apoptotic cell number was further observed in CaCo2 and SW620 cell lines (p<0.05, Figure 2A and 2D). The ability of CTE to induce intracellular ROS production is demonstrated in Figure 3. Three hours following CTE treatment there was a strong increase in intracellular ROS production in all cell lines (p<0.05). The intracellular ROS production increased progressively throughout the 25 hours of treatment in a time and concentration-dependent manner. Furthermore, the staining of cells with a mitochondria-targeted probe revealed a strong impact of CTE on mitochondrial superoxide production in a concentration-dependent manner (Figure 4). The highest increase in superoxide production by mitochondria was observed in HCT116 (69%, Figure 4B) and LoVo cells (82%, Figure 4C) following 24-hour treatment with 1 mg/mL of CTE.

Joonis 1:MõjuCistanche tubulosakäärsoolevähi rakuliinide elujõulisuse kohta. (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo ja (D) SW620 rakkude MTT testiga mõõdetud rakkude elujõulisus on esitatud protsendina ravimata käärsoolevähi kontrollrakuliinist. Keskmised väärtused (± SD) on antud representatiivse katse 5 korduse kohta: (*) olulisus p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Joonis fig 2: Cistanche tubulosa vesiekstrakt indutseerib inimese käärsoolevähi rakkudes apoptoosi. (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo ja (D) SW620 rakkude anneksiin-V-FITC voolutsütomeetria analüüsid on esitatud protsendina töötlemata käärsoolevähi kontrollrakuliinist. Keskmised väärtused (± SD) on antud representatiivse katse 3 korduse kohta: (*) olulisus p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Joonis fig 3: Cistanche tubulosa veeekstrakt kutsub esile rakusisese ROS-i tootmise ajast ja annusest sõltuvalt. ROS-i tootmine, mõõdetuna DCFH-DA testiga (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo ja (D) SW620 rakkudes, on esitatud keskmiste RFU väärtustena (± SD) vastavate 5-korduste jaoks. esinduslik eksperiment. (*) Tähendus lk<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells. 

Joonis 4: Cistanche tubulosa veeekstrakt kutsub esile mitokondriaalse superoksiidi tootmise inimese käärsoolevähi rakkudes. Mitokondritele suunatud MitoSOX Red sondi fluorestsentsi intensiivsus A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo ja (D) SW620 rakkudes on esitatud protsendina töötlemata käärsoolevähi kontrollrakuliinist. Keskmised väärtused (± SD) on antud representatiivse katse 5 korduse kohta: (*) olulisus p<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells.

ARUTELU

Kuigi varasemad uuringud on teatanud paljudest Cistanche tubulosa raviomadustest, on see esimene teade selle proliferatsioonivastasest toimest pahaloomulistes rakkudes. Väga polaarse lahusti veega ekstraheeritud Cistanche tubulosa bioaktiivsed ühendid näitasid tugevat vähivastast bioaktiivsust. Oleme varem võrrelnud vees lahustatud Cistanche tubulosa efektiivsust teiste lahustitega, nagu metanool ja etüülatsetaat, kuid veeekstraktidel oli kõige lootustandvam vähivastane toime (andmeid pole näidatud).

Oleme näidanud CTE võimet kontsentratsioonides 1 mg/ml ja 2 mg/ml inhibeerida 60% nii primaarsete kui metastaatilise käärsoolevähi rakuliinide kasvust, mis näitab potentsiaalselt olulist rolliCistanche tubulosakäärsoolevähi ravina. Võrreldes normaalsete rakkudega iseloomustab vähirakke üldiselt redoks-homöostaasi häire ja praeguste vähivastaste ravimeetodite ühine strateegia on suurendada raku oksüdatiivset stressi (Yang et al, 2013). Kuigi ROS-i füsioloogiliselt madalal tasemel on signaalimolekulidena oluline roll, võib liigne ROS-i tootmine kaasa aidata vähi ebastabiilsusele ja pahaloomulisusele (Liou ja Storz, 2010). Paradoksaalselt muudab see raku redoks-homöostaasi tasakaalustamatus vähirakud haavatavamaks ROS-indutseeritud rakusurma suhtes (Jaganjac et al., 2008; Nogueira ja Hay, 2013). Selles uuringus kirjeldatud CTE proliferatsioonivastast toimet võivad vahendada ekstraktis sisalduvate teadaolevate ja tundmatute ühendite erinevad rakuvälised ja intratsellulaarsed mehhanismid, mis on suunatud mitmetele radadele, millel on apoptoosis oluline roll. Erinevate rakusurma viiside eristamiseks uurisime võimalikku mehhanismi, mis vastutab täheldatud CTE-indutseeritud tsütotoksilisuse eest.

CISTANCHE TUBULOSA EXTRACT Anti Alzhermer's PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Meie andmed näitavad, et CTE suurendab rakusisest ROS-i tootmist ja sellest tulenevalt ROS-indutseeritud rakusurma. Raku redoksseisund mängib samuti otsustavat rolli apoptoosi reguleerimisel ja mitokondriaalne elektronide transpordiahel on raku ROS-i tekke üks peamisi kohti (Trachootham et al., 2008). Lisaks võib rakusisene ROS põhjustada raku apoptoosi nii mitokondritest sõltuvate kui ka sõltumatute radade kaudu (Sinha et al., 2013). Tõepoolest, meie andmed näitavad ka seda, et CTE-indutseeritud fosfatidüülseriini eksternaliseerimine on nii primaarsete kui ka metastaatiliste vähirakuliinide apoptoosis tavaline toime, mis viitab sellele, et CTE-indutseeritud surma mehhanismi vahendab pigem apoptoos kui nekroos. Apoptoosi aktiveerimine vähirakkudes on korrigeeriv strateegia ja paljud vähivastased ravimid võivad avaldada vähirakkudes apoptootilist toimet.

Seetõttu on vähirakkudes apoptootilise toimega ühendid või ekstraktid potentsiaalselt kasulikud vähivastaste ravimite uuringutes (Wong, 2011). Et teha kindlaks, kas CTE-indutseeritud pro-apoptootilist toimet vahendab mitokondrite poolt indutseeritud ROS-mehhanism, mõõtsime CTE-ga töödeldud rakkudes mitokondritele suunatud fluorestsentssondi abil superoksiidi tootmist. Meie andmed näitavad selgelt, et CTE stimuleerib mitokondriaalse superoksiidi tootmist, mis viitab sellele, et Cistanche tubulosa vähivastane aktiivsus on vähemalt osaliselt vahendatud mitokondrite poolt indutseeritud ROS-mehhanismi kaudu.

JÄRELDUSED

Kokkuvõtteks võib öelda, et meie andmed viitavad sellele, et kõrbetaime Cistanche tubulosa veeekstrakt võib olla paljutõotav kandidaat vähivastaseks lähenemisviisiks koos teiste tavapäraste käärsoolevähi ennetamise ja ravi ravimeetoditega. Samuti demonstreerime, et taimeekstrakti toksilisust vähirakkude vastu vahendab suurenenud rakusisene ROS tootmine ja vähemalt osaliselt mitokondriaalsest sõltuvast apoptoosist. Täiendavad uuringud käivad vähivastase toime eest vastutavate üksikute bioloogiliselt aktiivsete koostisosade eraldamiseks ja iseloomustamiseks.

Vaja on rohkem uuringuid, et hinnata selle ekstrakti potentsiaalset kasutamist tõhusa kemopreventiivse ainena ja mõista käärsoolevähi rakkude toimemehhanisme molekulaarsel tasemel. Samuti on vaja täiendavaid prekliinilisi ja kliinilisi uuringuid, et kinnitada täheldatud kasulikke tervisemõjusidCistanche tubulosa vähi ennetamiseks.

 CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE COFFE PARANDAB MÄLU VÄSIMUSVASTANE PHGS75% ECH 30% ACT 12%