Cistanche Tubulosa sahharoosi süntaasi geenide kloonimine, funktsionaalne identifitseerimine, struktuuri- ja ekspressioonianalüüs Ⅲ

4 CtSus ekspressioonianalüüs Cistanche tubulosa erinevates osades ja rakukultuurisüsteemis põuastressi all

4.1 CtSus ekspressioonianalüüs Cistanche tubulosa erinevates osades

In vitro tervete rakkude transformatsioonikatsed ja ensümaatilise katalüütilise reaktsiooni katsed kinnitasid, et CtSus geeni poolt kodeeritud valgul on võime katalüüsida UDP-glükoosi sünteesi. Selle geeni ja glükosiidühendite biosünteesi vahelise seose edasiseks uurimiseks Cistanche tubulosa's on selle geeni ekspressioonitaseCistanche tubulosaanalüüsiti.

MÜÜA KVALITEETNE TASTANŠI TOORMATERJAL

Wecistanche'i tugiteenus - võtke meiega ühendust, et saada teavet allahindluse kohta:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

ehhinakosiidon Cistanche tubulosa kõige tüüpilisem glükosiidühend ja selle sisaldus võib ulatuda üle 30% Cistanche tubulosa taimede kuivkaalust [23]. Uurimisrühm mõõtis eelnevalt ehhinakosiidi sisaldust Cistanche tubulosa taimede erinevates osades ja konkreetne jõudlus oli:echinacoside in different tissues was haustorium>underground part>>õhust osa; nende hulgas oli ehhinakosiidi sisaldus haustoriumis kõrgeim. Reaalajas fluorestsents-kvantitatiivne PCR viidi läbi, kasutades matriitsina Cistanche tubulosa erinevatest osadest pärit cDNA-d ja tulemusi analüüsiti 2.–ΔΔCT meetod ja viidi läbi diferentsiaalanalüüs. Tulemused on näidatud joonisel 4A. CtSus geeni ekspressioonitase haustoriumis oli kõrgeim, 1,5 korda kõrgem kui maapealses osas, ja maa-aluses osas oli ekspressioonitase oluliselt kõrgem kui maapealses osas, mis on kooskõlas fenüületanoolglükosiidide akumulatsiooni mustriga. mida esindab ehhinakosiid erinevates osadesCistanche tubulosa.

Joonis 4 CtSus suhtelised ekspressioonitasemed C. tubulosa erinevates osades ja PEG6000-ga töödeldud suspensioonirakkudes. A: CtSus suhteline ekspressioonitase C. tubulosa erinevates osades; B: CtSus suhteline ekspressioonitase PEG6000-ga töödeldud C. tubulosa suspensioonirakkudes erinevatel ajahetkedel n=3, 𝑥̅± s.*P ＜ 0,05,***P ＜ 0,001

KÕRGKVALITEETNE TISTANŠI TOORMATERJAL

4.2 CtSus ekspressioonianalüüs Cistanche deserticola suspensioonirakkudes põua stressi tingimustes

Projekti esialgne uuring näitas sedaPEG6000 põhjustatud põuastresssaaboluliselt suurenedaafenüületanoolglükosiidide kogunemineCistanche suspensiooni rakkudes. 3 kuni 9 päeva pärast induktsiooni suurenes ehhinatsasiidi sisaldus märkimisväärselt. 12.-15. päeval,ehhinatsasiidi kasvukiirussisu aeglustus ja saavutas maksimumväärtuse 15. päeval. Seejärel kasvas kultiveerimisaja pikenedes ehhiaatsiidi sisaldus märkimisväärselt. Fruktosiidi sisaldus vähenes järk-järgult [24]. Selle uurimistöö põhjal kasutati selles artiklis töötlemata Cistanche deserticola suspensioonirakkude ja PEG6000-indutseeritud Cistanche deserticola suspensioonirakkude cDNA-d mallidena reaalajas fluorestsentsi kvantitatiivse PCR tuvastamiseks, et uurida CtSus geeni Cistanche deserticola suspensioonis. rakud põua stressi tingimustes. muutused ekspressioonitasemetes. Tulemused on näidatud joonisel 4B. PEG6000 poolt indutseeritud Cistanche deserticola suspensioonirakkudes suurenes CtSus ekspressioon märkimisväärselt 6. päeval pärast induktsiooni ja saavutas kõrgeima väärtuse 9. päeval ning langes seejärel kontrolliga samale tasemele. sama taseme rühmad. Ülaltoodud tulemused näitavad, et põuastress võib märkimisväärselt suurendada CtSus geeni ekspressiooni Cistanche deserticola suspensiooni rakuliinis, mis on kooskõlas ehhinatsasiidi akumulatsioonimustriga põuastressi all. CtSus geeni ekspressiooni tipp ilmneb siiski varem kui ehhinatsasiidi sisalduse tipp, sest CtSus katalüüsiga sünteesitud aktiivne glükosüüldoonor on oluline eelkäija, mis on vajalik mitmeastmelise glükosüülimisreaktsiooni jaoks järgnevas ehhiaatsiasiidi biosünteesirajas. Seetõttu oletatakse, et pärast põuastressi allutamist mobiliseerivad organismid eelistatult primaarse metabolismiga seotud geene, et saavutada aktiivsete doonorite kogunemine ja seejärel oluliste sekundaarsete metaboliitide kogunemine.

KÕRGKVALITEETNE TISTANŠI TOORMATERJAL

5 CtSus valgu kolmemõõtmeline struktuuriuuring ja peamiste aktiivsete saitide analüüs

Tuginedes CtSus funktsioonile glükosüüldoonori UDP-glükoosi tootmise katalüüsimisel, uuriti täiendavalt CtSus katalüütilise aktiivsuse struktuurset alust. Valgu sekundaarse struktuuri ennustamiseks kasutati veebipõhist tööriista SOPMA. Tulemused näitasid, et CtSus sekundaarstruktuur sisaldas 55,28% -heelikseid, 25,47% juhuslikke mähiseid, 12,80% pikendatud ahelaid ja 6,46% -pöördeid (joonis 5A), mis näitab, et -heeliksid on CtSus valgu kõige olulisemad sekundaarsed struktuuriüksused. järgnevad juhuslikud mähised, mis moodustavad samuti suure osa valgust. Laiendatud ahelad ja -pöörded jaotuvad kogu valgu ulatuses. Olemasolevate uuringute kohaselt eksisteerib sahharoosi süntaas tavaliselt tetrameeri kujul, mida peetakse selle aktiivseks vormiks. Seetõttu kasutas see artikkel AlphaFold2 CtSus valgu struktuuri ennustamiseks ja saadi selle valgu tetrameeride kolmemõõtmeline struktuur. PDB (Protein Data Bank) andmebaasi võrdlus näitas, et Arabidopsis thaliana sahharoosi süntaasi AtSus1 (PDBID 3S28) ja CtSus järjestuste sarnasus võib ulatuda 77, 93% -ni. Prognoositavat CtSus struktuuri võrreldi AtSus1 kolmemõõtmelise struktuuriga ja ruutkeskmise kõrvalekalde (RMSD) väärtus pärast valgu superpositsiooni oli 1, 11 Å, mis näitab, et nende kahe ruumilised struktuurid on väga järjepidevad (joonis 5B).

Arabidopsis AtSus1 teatatud valgu-ligandi kristallkompleksi struktuuri koos UDP ja fruktoosiga (PDBID3S29) kasutati mallina [16], et analüüsida CtSus sidumisviisi UDP ja fruktoosiga. Molekulaarse dokkimise tulemused on näidatud joonisel 5C. Võib täheldada, et AtSus1 ja CtSus substraadi sidumistaskud on aminohapete tüübi, ruumilise jaotuse ja konfiguratsiooni poolest väga sarnased ning kattumine on suur, mis tõestab, et sahharoosi süntaasi järjestus on taimedes väga konserveerunud. Kahe ligandi, UDP ja fruktoosi konformatsioonid valgu substraadi sidumistaskus on näidatud joonisel fig 5D. UDP ja CtSus-i molekulaarse dokkimise kõige soodsam konformatsioon kattub hästi UDP konformatsiooniga AtSus1-UDP kristallikompleksis, mis tõestab molekulaarse dokkimise tulemuste täpsust. Interaktsioon UDP ja peamiste aminohappejääkide vahel valgu substraadi sidumistaskus on näidatud joonisel fig 5E. UDP ja CtSus on omavahel seotud peamiselt vesiniksidemete ja hüdrofoobsete interaktsioonide kaudu. Peamised aminohappejäägid substraadi sidumistaskus on järgmised: eu294, Gly301, Met576, Arg578, Lys583, Gln646, Asn652, Leu677, Thr678 ja Glu681.

Viited

[1] Laul ZH, Lei L, Tu PF. CistancheHoffingi taimede farmakoloogilise aktiivsuse uurimise edusammud. et link [J]. Chin Tradit Herb Drugs (中草药), 2003, 34: 113-115.

[2] Liu WJ, Liu Y, Song QQ jt. Kultiveeritud ja metsiku Cistanchetubulosa keemia võrdlus, kasutades 1H-NMR spektroskoopiat [J]. Hiina J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2018, 43:3506-3512.

[3] Laul Y, Zeng K, Jiang Y jt. Cistanches Herba, alates ohustatud liigist kuni suure Hiina meditsiini kaubamärgini [J]. Med Res Rev, 2021, 41: 1539-1577.

[4] Liu Y, Wang H, Yang M jt. Cistanche deserticola polüsahhariidid kaitsevad PC12 rakke OGD/RP-indutseeritud vigastuste eest [J]. Biomed Pharmacother, 2018, 99: 671-680.

[5] Yin Y, Huang J, Gu X jt. Taimsete nukleotiidide ja suhkrute vastastikuse konversiooni ensüümide evolutsioon [J].PLoS One, 2011, 6: e27995.

[6] Bar-Peled M, O'Neill MA. Taimede nukleotiidide suhkru moodustumine, vastastikune muundamine ja päästmine suhkru ringlussevõtu teel [J]. Annu Rev Plant Biol, 2011, 62: 127-155.

[7] Guo H, Li L, Wang PG. Escherichia coli O86:B7 [J] UDP-GlcNAc/Glc4-epimeraasi biokeemiline iseloomustus. Biochemistry, 2006, 45: 13760-13768.

[8] Dong S, Chesnokova ON, Turnbough CL Jr jt. UDP-N-atsetüülglükoosamiin4-epimeraasi tuvastamine, mis osaleb Bacillus anthracis [J] eksosporiumi valgu glükosüülimises. J Bacteriol, 2009, 191: 7094-7101.

[9] Li LN, Kong JQ. Sahharoosi süntaasi geenide transkriptoomiline tuvastamine Ornithogalumcaudatum [J]. RSC Adv, 2016, 6: 18778-18792.

[10]Schmölzer K, Gutmann A, Diricks M jt. Sahharoosi süntaas: ainulaadne glükosüültransferaas biokatalüütilise glükosüülimise protsessi arendamiseks [J]. Biotechnol Adv, 2016, 34: 88-111.

[11] Cardini CE, Leloir LF, Chiriboga J. Sahharoosi biosüntees [J]. J Biol Chem, 1955, 214: 149-155.[12]Stein O, Granot