Võrgufarmakoloogia ja eksperimentaalne valideerimine paljastavad Cistanche fenüületanoidglükosiidide mehaanilise rolli NAFLD ravis TNF/PI3K/Akt raja kaudu

3. Tulemused

3.1 Võrgufarmakoloogia

3.1.1 Aktiivsed ühendid ja potentsiaalsed sihtmärgid

Projektimeeskonna eelnevate uuringute ning andmebaaside ja kirjanduse teabe põhjal valiti välja kümme tüüpilist farmakoloogilise toimega ühendit [10–11]:verbaskosiid, isoverbaskosiid, ehhinakosiid, 2'-atsetüül-verbaskosiid, tsistanosiid A, tsistanosiid B, salidrosiid, isokrenatosiid II, tsistanche glükosiid A ja tsistanche glükosiid F.

Kõrge sisaldusega verbaskosiidi (akteosiidi) tsistantsiekstrakt vere lipiidide raviks

Cistanche ekstrakti tehniliste andmete loend

Võtke meiega ühendust osta kohe

KasutadesSwissTargetPrediction, saadi 44 sihtmärki;NetInferennustas 20 parimat sihtmärki, andes tulemuseks 45 sihtmärki;SuperPredandis 118 sihtmärki. Pärast duplikaatide ühendamist ja eemaldamist195 unikaalset sihtmärkituvastati.

AlatesGSE89632andmestik, mis sisaldas 39 NAFLD proovi ja 24 tavalist proovi,589 erinevalt ekspresseeritud geenivaadati läbi. Andmete kombineerimine alatesGeneCardsjaDisGeNET, 2315 NAFLD-ga seotud haiguse geenisaadi pärast deduplikatsiooni (joonised 1A–1B). Ühendatega seotud sihtmärke haiguse sihtmärkidega lõikuvates,77 kattuvat sihtmärkituvastati Cistanche fenüületanoidglükosiidide potentsiaalsete terapeutiliste sihtmärkidena NAFLD vastu (joonis 1C).

Need sihtmärgid imporditiSTRING database with an interaction threshold >0,400. Eraldatud sõlmed eemaldati ja võrk visualiseeriti selle kauduCytoscape, mille tulemuseks on aPPI võrk 75 sõlme ja 408 servaga(Joonis 1D). Kasutades Cytoscape'i funktsiooni "Analüüsi võrku", tuvastati põhisihtmärkidena 10 parimat kraadi väärtusel põhinevat sihtmärki:TNF, NFKB1, TLR4, HSP90AA1, ESR1, HIF1A, STAT1, APP, PRKACA, SMAD3.

3.1.2 GO, KEGG ja DO rikastamise analüüsid

GO rikastamise analüüs näitas 93 terminitmolekulaarne funktsioon (MF), 38 eestrakuline komponent (CC)ja 989 eestbioloogiline protsess (BP). Visualiseeriti iga kategooria 10 parimat tööd (joonis 2). Tulemused näitasid, et Cistanche fenüületanoidglükosiidid võivad avaldada NAFLD-vastast toimet radade kaudu, mis on seotudpõletik, tsütokiinid, ainevahetus ja immuunvastus.

DO rikastamine tuvastatud833 haigustsihtmärkidega seotud, visualiseerides 25 parimat (joonis 4), sealhulgasmetaboolsed, immuunsüsteemi, südame-veresoonkonna, rasvumisega seotud ja maksahaigused, mis kõik on NAFLD-ga tihedalt seotud.

3.1.3 Võrgustik "ühend-siht-tee".

KEGG rikastamise tulemuste põhjal a"ühend-sihtmärk-tee" võrkehitati kasutadesCytoscape 3.9.1. Rohelised ruudud tähistavad aktiivseid ühendeid, sinised ringid tähistavad sihtmärke ja oranžid V-kujulised sõlmed tähistavad teid (joonis 5). See näitab, et Cistanche fenüületanoidglükosiidid avaldavad NAFLD-vastast toimetmitu ühendit, sihtmärki ja radu, koosehhinakosiid ja verbaskosiidon 2020. aasta väljaandes kõige levinumad ja loetletud markerühendidHiina farmakopöa.

3.1.4 Molekulaarne dokkimine

PPI võrgustiku viis peamist sihtmärki (TNF, NFKB1, TLR4, HSP90AA1, ESR1) dokiti aktiivsete ühenditega ja arvutati nende minimaalsed seondumisenergiad (joonis 6). Kõik dokkimisskoorid olid väiksemad kui- 6 kcal / mol, mis näitab tugevat sidumisafiinsust.TNF näitas tugevaimat afiinsust. Mõned dokkimistulemused visualiseeriti kasutadesPyMOL(Joonis 7).

3.2 Rakukatsed

3.2.1 FFA mõju lipiidide akumulatsioonile HepG2 rakkudes

Nagu näidatudJoonis 8, põhjustas FFA kontsentratsiooni suurendamine 0, 5-lt 2 mmol / l punaste lipiidide tilkade arvu suurenemiseni, mis ühinesid suurteks lipiiditilkadeks, mis näitab edukat lipiidide laadimist.

3.2.2 FFA ja Cistanche fenüületanoidglükosiidide mõju rakkude elujõulisusele

Nagu näidatudJoonis 9A, FFA kontsentratsioonid1 mmol/L ja alla selleei avaldanud olulist mõju rakkude elujõulisusele (P > 0,05); seega,1 mmol/lvaliti modelleerimiseks. Nagu näidatudJoonis 9B, Cistanche fenüületanoidglükosiidid kuni200 μg/mlei mõjutanud oluliselt elujõulisust (P > 0,05), kuid400 μg/mlinhibeeris oluliselt elujõulisust (P < 0,01). Seetõttu25, 50 ja 100 μg/mlvaliti raviks madala, keskmise ja suure annusena.

3.2.3 Mõju lipiidide akumulatsioonile

Nagu näidatudJoonis 10, näitas mudelrühmas kontrollrühmaga võrreldes märkimisväärne punaste lipiidide tilkade kogunemine (P <0,01), mis kinnitas edukat modelleerimist. Ravi koos50 ja 100 μg/mlCistanche fenüületanoidglükosiidid vähendasid oluliselt lipiidide tilkade moodustumist (P <0,01). sisseJoonis 11, TG ja TC tasemed olid mudelrühmas kõrgenenud (P < 0,01), samas kui kõigis ravirühmades oli tase oluliselt langenud võrreldes mudelrühmaga (P < 0,01).

3.2.4 Mõju mitokondriaalsele kahjustusele

JC-1 värvaine koguneb tervetesse mitokondritesse ja kiirgab punast fluorestsentsi; kahjustatud mitokondrites jääb see monomeersesse vormi ja kiirgab rohelist fluorestsentsi. Nagu näidatudJoonis 12, kontrollrühmas domineeris punane fluorestsents, samas kui mudelrühmas oli roheline fluorestsents silmapaistev. Ravirühmadel oli vähenenud roheline fluorestsents ja suurenenud punane fluorestsents, mis näitab paranenud mitokondriaalse membraani potentsiaali.

3.2.5 Mõju intratsellulaarsetele ROS-tasemetele

Nagu näidatudJoonis 13, näitas mudelirühm märkimisväärselt suurenenud fluorestsentsi intensiivsust (P <0, 01), mis näitab kõrgenenud ROS-i. Ravi Cistanche fenüületanoidglükosiididega vähendas oluliselt ROS-i taset kõigil kontsentratsioonidel (P <0,01).

3.2.6 Mõju apoptoosile

Hoechst 33342 värvib tuumad, apoptootiliste tuumade morfoloogia on helesinine, kondenseerunud või killustatud. Nagu nähaJoonis 14, oli kontrollrühmal minimaalne ere fluorestsents, samas kui mudelrühmal oli rohkesti helesiniseid apoptootilisi tuumasid. Ravirühmadel oli vähenenud fluorestsentsi intensiivsus, mis näitab apoptoosi vähenemist.

3.2.7 Mõju TNF/PI3K/Akt signaalirajale ja Baxi avaldisele

Nagu näidatudJoonis 15, võrreldes kontrollrühmaga näitas mudelrühmas oluliselt kõrgem ekspressioonTNF-a, PI3K p85, Akt ja Baxvalgud (P < 0,05, P < 0,01). Ravi ajal:

Kõik Cistanche fenüületanoidglükosiidi rühmad näitasid vähenemistTNF-αavaldis (P < 0,01),

The50 μg/mlrühmas vähenesPI3K p85avaldis (P < 0,01),

The100 μg/mlrühmas vähenesAkt ja Baxväljend (P < 0,05).

4. Arutelu

NAFLD on keeruline maksahaigus, mis on seotud metaboolsete häiretega, mis hõlmavadlipiidide metabolismi tasakaalustamatus, insuliiniresistentsus ja oksüdatiivne stress[12]. Viimastel aastateltraditsiooniline hiina meditsiin (TCM)on näidanud NAFLD ravimisel märkimisväärset lubadust.

Kaasaegsed uuringud on seda näidanudCistanche'i fenüületanoidglükosiididvõib reguleerida lipiidide ja glükoosi metabolismi maksas ning pärssida oksüdatiivset stressi, põletikku ja fibroosi [13–15]. Maks kasutabβ-oksüdatsioonrasvhapete metaboliseerimiseks jaCYP7A1muuta kolesterool lipiidide homöostaasi jaoks sapphapeteks [16–18]. Suure rasvasisaldusega keskkondades põhjustab metaboolne tasakaalustamatus lipiidide akumuleerumist ja NAFLD-d [19].

See uuring kinnitas sedaFFA-indutseeritud HepG2 rakudnäitas suurenenud lipiidide tilkade arvu ja kõrgenenud TC ja TG taset. Ravi Cistanche fenüületanoidglükosiididega vähendas märkimisväärselt lipiidide tilkade moodustumist ja TC / TG ​​taset, parandades maksa steatoosi.

Mitokondriaalne düsfunktsioon põhjustab β-oksüdatsiooni vähenemist, liigset ROS-i tootmist ja lipiidide peroksüdatsiooni [20]. ROS kahjustab veelgi mitokondreid, süvendades steatoosi [21]. Meie tulemused näitavad, et Cistanche fenüületanoidglükosiididvähendada ROS-i, parandadamitokondriaalse membraani potentsiaal, ja leevendadaoksüdatiivne stress, vähendades seeläbi rasva kogunemist.

Võrgufarmakoloogia näitas, et NAFLD-vastased toimed hõlmavad mitmeidmetaboolsed ja apoptoosiga seotud teed. Molekulaarne dokkimine näitas tugevat seondumisafiinsust aktiivsete ühendite ja sihtmärkide vahel, eritiTNF, mis viitab selle kesksele rollile.

TheTNF radaon raku signaalimisel kriitiline. TNF-α seondubTNFR1, aktiveerides surmaretseptori radu ja kutsudes esile apoptoosi [22]. See aktiveerib kaPI3K/Akt radaparakriinse signaalimise kaudu [23–24]. Ebanormaalne PI3K/Akt signaaliülekanne on seotud lipiidide akumulatsiooni, põletiku ja fibroosiga NAFLD-s [25]. Meie andmed näitavad, et Cistanche fenüületanoidglükosiididinhibeerivad apoptoosija vähendada väljendustTNF-α, PI3K, AktjaBax, mis on kooskõlas võrgu ennustustega, kinnitades selle tähtsustTNF/PI3K/Akt rada.

Järeldus

Cistanche fenüületanoidglükosiidid reguleerivad NAFLD-d läbimitu protsessi ja rada, sealhulgas:

lipiidide kogunemise vähendamine,

Oksüdatiivse stressi pärssimine,

Leevendab mitokondriaalseid kahjustusi,

Apoptoosi pärssimine.

Need mõjud võivad olla tihedalt seotudTNF/PI3K/Akt signalisatsioonirada. See uuring ei paku mitte ainult teaduslikku tuge Cistanche fenüületanoidglükosiidide kasutamiseks NAFLD-ravis, vaid ka viiteallikaks uute terapeutiliste ravimite väljatöötamiseks ja kliinilisteks uuringuteks.