Miks Cistanche mõjutab PC12 rakkude apoptoosi?

Cistanche mõju PC12 rakkude apoptoosile

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Tian Jiyu¹, Chen Jianzong¹, Chen Xiaoli², Yang Hao³

¹Hiina traditsioonilise meditsiini osakond,²Xijingi haigla farmaatsia osakond,³PLA Neurobioloogia Instituut, Neljas Sõjaväe Meditsiiniülikool, Xi'an 710033, Hiina

Abstraktne

EESMÄRK:Et uurida selle mõjuCistanche1- metüül-4-fenüülpüridiiniumi (MPP pluss ) poolt indutseeritudPC12 rakkude apoptoos.

MEETODID: PC12 rakudeksponeeriti 200 μmol/L MPP pluss eraldi või MPP plus kombineerituna erinevate kontsentratsioonidegaCistancheUus-Meremaa valge küüliku seerum. MõjudCistanchepealPC12 rakkude apoptoostuvastati voolutsütomeetria, elektronmikroskoopia ja fluorestsentsmikroskoopia abil.

TULEMUSED:Seerumid koguti küülikutelt, keda toideti samaväärse annusegaCistanchevõi kahekordses ekvivalentses annusesCistancheoli ilmselge kaitsev toimePC12 rakudjaPC12 rakkude apoptoosi määradNende kahe seerumiga inkubeeriti vastavalt 2,8 protsenti ja 10,2 protsenti, mis olid ilmselgelt madalamad kuiPC12 rakudainult MPP pluss raviga (18,6 protsenti, P<0>

KOKKUVÕTE:Cistanchesaab kaitstaPC12 rakudalatesapoptoosMPP pluss indutseeritud.

Märksõnad:CistancheDeserticola, 1-metüül-4-fenüülpüridiinium,PC12 rakud, apoptoos

Sissejuhatus

Parkinsoni tõve (Parkinsoni tõbi, PD) patogenees on substantia nigra dopamiinergiliste neuronite kahjustus ja kadu.apoptoosvõib olla oluline põhjus. Kasutame Hiina meditsiini tuvastamiseks voolutsütomeetriat (FACS), transmissioonelektronmikroskoopiat ja tuuma kuju analüüsi fluorestsentsvärvimist ja muid meetodeid.Cistanchemeditsiinilise seerumi ja neurotoksiini 1-metüül-4-fenüülpüridiinium (1-metüül-4-fenüülpüridiinium, M PP pluss) töödeldud PC12 rakud, et uurida Cistanche'i mõju neuronitele. tegevust.

MõjudCistanchePC12 rakkude apoptoosi kohta

1. Materjalid ja meetodid

1.1 Materjalid

PC12 rakudosteti Jaapani eluteaduste sihtasutuselt; RP-MI1640 sööde, vasika seerum ja roti saba kollageen osteti firmalt Gibco; MPP plus, anneksiin V-FITC, PI, PBS, rakukultuuri kolvid ja kultiveerimisplaadid osteti firmalt Sigma; Hiina meditsiinCistancheosteti ettevõttest Xi'an Decoction Piece Factory; Uus-Meremaa suurkõrv valge küülik (isane, kehakaal 2,5 ~ 3 kg) saadi kooliloomade keskusest; Hoechst33342 osteti ettevõttelt Biyuntian Company; Paraformaldehüüd oli kodumaiselt puhas; LD4- 2. tüüpi tsentrifuug (Pekingi meditsiinilise tsentrifuugi tehas) Instrumendid Fluorestsentsmikroskoop (Laika firma), pöördmikroskoop (firma Olympus), JEM-2000EX transmissioonelektronmikroskoop (Jaapan), CO2 konstantse temperatuuriga inkubaator (siin) -cus HERAcell, Saksamaa), Coulter EPICS voolutsütomeeter (Beck-man Coulter, USA).

1.2 Meetod

PC12 rakudkasvatati RPMI1640 rakukultuurisöötmes, mis sisaldas 100 ml/l vasika seerumit. Rakukultuuri kolb ja kultiveerimisplaat kaeti enne kasutamist 0,2 g/l roti saba kollageeniga. Kultiveeritud rakud pandi 37 kraadi juurde 50 ml/L CO2 inkubaatorisse, vahetage söödet 3 päeva. Kui ühekihilised kultuurirakud hakkavad sulanduma, seedige 1,25 g/l trüpsiiniga ja külvage subkultuur. Kui subkultuuri rakud sisenevad logaritmilise kasvufaasi, saate lisada ravimeid. Vastavalt küüliku kehakaalule arvestatakse ümber looma ekvivalentdoos vastavalt kehapinnale. Traditsiooniline hiina meditsiinCistanchevalmistatakse külmkuivatatud pulbrina, mida lahjendatakse kasutamisel destilleeritud veega, ja loomale manustatakse kaks korda päevas 3 päeva jooksul (Chinese Experimental Formula Chinese Journal of Science, 1998; 4:13-15), 1 h pärast viimast ig-d, unearteri verelaskmine, üleöö 4 kraadi juures, tsentrifuugimine kiirusel 2500 p/min 25 min, seerumi eraldamine, inaktiveerimine 56 kraadi juures, 30 min ja 0. Steriliseerimine 22 μm filtrimembraaniga ja ladustamine -20 kraadi juures. Samadel tingimustel valmistati küüliku kontrollseerum, 1/2, 1 ja 2 korda samaväärne annus seerumit. Katse jagati 5 rühma: rühm A oli küüliku tühja seerumi rühm, rühm B on 2-kordne seerumi ja MPP pluss grupi ekvivalentdoos (sondiannus on cistanche toorravim 6,4 g/kg), rühm C on samaväärne seerumi annus pluss MPP pluss rühm (sondannus on Cistanche toorravim 3,2 g/kg), rühm D on poolekvivalentne seerumi annus pluss MPP pluss rühm (annuses on Cistanche toorravim 1,6 g/kg), rühm E on tühi küüliku seerum pluss MPP pluss rühm. Subkultuur 12 tundi Edaspidi jälgige rakke pöördmikroskoobi all ja lisage ravim enne liitumist. Iga rühma seerumisisaldus on 10 protsenti . Pärast 3-päevast kultiveerimist lisatakse MPP pluss lõppkontsentratsioonini 200 μmol/L. Paigaldatud temperatuurile 37 kraadi, 50 ml/L CO2 kultuuri ja kontrollige seda pärast 24-tunnist inkubeerimist.

1.2.1 PC12 rakkude fluorestsentsvärvimise vaatlus

Lisage kultiveeritud hulka Hoechst33342PC12 rakudlõppkontsentratsioonil 10 mg/l, inkubeerige 37 kraadi juures 30 minutit, segage 40 g/l paraformaldehüüdi ja kultiveerimissöödet temperatuuril 13: et paraformaldehüüdi lõppkontsentratsioon oleks 10 g/l. Pärast fikseerimist 5-10 min, visake supernatant ära, peske PBS-ga ja jälgige fluorestsentsmikroskoobi all.

1.2.2 Vaatlus ülekandeelektronmikroskoobiga

Pärast 24-tunnist ravi ravimiga koguti rakud ja viidi tsentrifuugituubi, tsentrifuugiti kiirusel 1500 p/min, 4 kraadi juures 5 minutit ja pesti kaks korda 10 mmol/l PBS-ga. Tsentrifuugige kiirusel 1500 p/min, 4 kraadi 5 minutit, supernatant visake ära, lisage aeglaselt piki katsuti seina 25 ml/L glutaaraldehüüdi ja fikseerige 4 kraadi juures 2 tundi, eemaldage rakutükid sirge pipetiga, peske 3 korda PBS-iga, iga kord 5 minutit, fikseerige 1 tund pärast osmiumhapet 4 kraadi juures. Gradiendijärgne atsetooni dehüdratsioon, epoksüvaigu leotamine ja kinnistamine, viilutatud LKB-2188 üliõhukese mikrotoomiga, värvitud uranüülatsetaadiga. pliitsitraat, mida vaadeldi transmissioonielektronmikroskoobiga ja pildistati.

1.2.3 Voolutsütomeetria tuvastamine

M PP pluss töötlemine 24 h, seedimine 106 kleepuvPC12 rakud1,25 g/l trüpsiiniga, peske kaks korda PBS-ga, lisage 490 μL sidumispuhvrit, segage rakud põhjalikult ja lisage 5 μL Annexin V-FI TC. Segage rakususpensioonis 10 μL lahustunud PI-d, segage õrnalt, asetage test. katseklaasi 4 kraadi juures, inkubeerige 10 minutit pimedas ja määrake voolutsütomeetriga. Igal rühmal on 4 korduskaevu.

Statistiline töötlemine: andmed esitatakse x ±s, mitme grupi võrdlus viiakse läbi Kruskal-Wallise testiga ja paaridevaheline võrdlus Mann-Whitney testiga ja P<0.05 is="" considered="" as="" a="" significant="">

Cistanche mõju PC12 rakkude apoptoosile

2. Tulemused

2.1 PC12 rakkude vaatlemine fluorestsentsmikroskoobiga

Tavaliselt kasvatatudPC12 rakudvõib pärast Hoechst33342 värvimist kiirata ühtlast fluorestsentsi ning apoptootilises raku tuumas on näha tihedalt värvitud granuleeritud massi fluorestsentsi ja punktiir valget fluorestsentsi. Enamiku normaalse rühma rakkude tuum on suhteliselt ühtlane. Sinine fluorestsents, nõrgalt nähtav punktikujuline kondenseerunud punktikujuline fluorestsents, selle kondenseerunud punktikujuline fluorestsents on nõrgem kui MPP pluss kontrollrakkudel. Tavaliselt kasvatatud rakud näitavad pärast Hoechsti värvimist ühtlast sinist fluorestsentsi ja tuuma morfoloogia on korrapärane (joonis 1A); Pärast MPP pluss-i näib tuumakromatiin kontsentreeritud või tugevalt kondenseerunud, ebaregulaarse punktfluorestsentsiga või marginaliseeritud; hilise raku tuumad jagunesid fragmentideks (joonis 1B). Ekvivalentdoos ja 2-kordne ekvivalentdoos RakudCistancheravimseerum pluss M PP pluss rühm olid normaalsele lähedased (joonis 1C, D).

Joonis 1PC12 rakudvärvitud Hoechst33342(Ho)

A:Kontroll:kromatiin on ühtlaselt jaotunud ja värvitud korrapäraselt;B:MPP pluss töödeldud:kromatiini kondenseerumine ja marginatsioon tuumamembraanil;C:ekvivalentCistanchepluss MPP pluss ravi ed;D :kahekordne ekvivalent Cistanche pluss MPP pluss töödeldud , kromatiin on normaalne.

2.2 Vaatlus projektsioonelektronmikroskoobiga

Tavaliselt kultiveeritudPC12 rakudneil on ühtlane tuumakromatiin, selge ja täielik tuumamembraan, rikkalikud tsütoplasmaatilised mitokondrid ja terviklikud organellid (joonis 2A). Pärast MPP pluss töötlemist on PC12 rakud oluliselt muutunud, rakumembraan on terve, pinnapealsed mikrovillid kadusid ja tsütoplasma on kontsentreeritud, kromatiin on kondenseerunud, purunenud, tugevalt kondenseerunud ja kogunenud tuumamembraani sisepinnale, mis näitab. omadusedapoptoos, peamiselt varajases ja keskmises staadiumis apoptootilistes rakkudes (joonis 2B, C). Apoptootilised rakud igas rühmas, mis sisaldavadCistancheseerumid on selgelt vähenenud, tuuma kromatiin on ühtlaselt jaotunud, tuumamembraan on selge ja terviklik ning organellid on terved, lähedal joonisel 2A näidatud rakule.

2.3 Voolutsütomeetria testi tulemused

Rakumembraani siseküljel asuv fosfatidüülseriin (PS) migreerus rakumembraani välisküljele rakumembraani varases staadiumis.apoptoos. Iga rühma apoptootiline määr oli (2,3 ± 0,11) protsenti, (2,8 ± 0,21) protsenti, (1{{10}}},2 ± {{ 14}},60) protsenti , (16,0 ± 0,87) protsenti ja (18,6 ± 0,67) protsenti . B-, C-, D-rühma järjestus-summutesti analüüs võrreldes E-rühma P-ga<0.05. there="" is="" a="" significant="" difference="" between="" serum-containing="" chinese="" medicine="" and="" the="" blank="" serum="">

Joonis 2PC12 rakudultrastruktuur EM × 6000

V: Ilma MPP-ta ja ühtlaselt hajutatud kromatiinita, kergelt elektrontiheda tsütoplasma, normaalse organellide struktuuri ja terve rakumembraanita; B, C: eksponeeritud 200 μmol/LM PP pluss .Varajane apoptootiline faas, perifeerne kromatiini kondensatsioon, peaaegu normaalne tsütoplasmastruktuur (B). Hiline post-kõrvafaas, edasine kromatiini kondenseerumine, suurenenud tsütoplasmaatiline elektrontihedus, normaalse organellide struktuuri puudumine ja rakumembraani terviklikkuse (C) rikkumine.

3. Arutelu

M PP plusi neurotoksilisus on keerukas mitmekomponendilise toimega protsess, mis hõlmab mitokondrite ja sünaptiliste vesiikulite asendamist dopamiiniga, et tekitada reaktiivseid hapniku liike [1]. Praegu arvatakse, et enamik neist on seotud mitokondriaalsete rakkudegaapoptoosja endogeenne Dopamiini neurotoksiline toime põhjustab apoptoosiga seotud [,2] Substantia nigra dopamiini rakuliini SN4741 apoptoosi jälgimise protsessis M PP plus poolt aktiveeritakse kaspaas-1 ja kaspaas{ {4}} [3] .1 μmol/L MPP pluss mõjub neerupealise neuroblastoomi SH-SY5Y rakkudele ja võib mõne päeva pärast suurendada apoptoosiga seotud Bcl-2 valgu ekspressiooni [4].Cistancheon kuiv ketendav leht perekonnast Cistanche perekonnast (Cistanche).Cistanche. Tistanche lihakas vars on Alzheimeri tõve ja PD ravis hea ravitoimega. Tistanche'i glükosiidid võivad tõhusalt eemaldada mitmesuguseid aktiivseid hapniku vabu radikaale ja kaitsta OH poolt põhjustatud DNA oksüdatsiooni. [5]. Sheng et al. [6] uuringud kinnitasid, et Cistanche Tubulkosiid B ekstrakt võib nõrgendada MPP pluss-indutseeritud tsütotoksilisust, nõrgendada reaktiivsete hapnikuliikide akumuleerumist rakus ja avaldada antagonistlikku toimet MPP pluss-indutseeritud rakkudele.apoptoosja oksüdatiivne stress. Oleme seda täheldanudCistancheon antagonistlik toime MPP pluss-indutseeritud PC12 raku toimeleapoptoosja kaitsev toimePC12 rakudsuureneb koos annuse suurendamisega.

Cistanche mõju PC12 rakkude apoptoosile

Viide

[1] Lotharius J, O Malley KL. Parkinsonismi indutseeriv ravim 1- metüül-4-fenüülpüridiinium käivitab rakusisese dopamiini oksüdatsiooni. Uus toksilisuse mehhanism [J]. J Biol Chem, 2000;275 (49):38581-38588.

[2] Maruyama W, Naoi M. Rakusurm Parkinsoni tõve korral [J]. J Neurol, 2002; 249 (S Suppl 2):6-10.

[3] Chun HS, Gibson GE, DeGiorgio LA jt. MPP (pluss), oksüdeerija ja spetsiifiliste neurotoksiliste ainete poolt indutseeritud dopamiinergilisel rakusurmal on ühine molekulaarne mehhanism [J]. J Neurochem, 2001;76(4): 1010-1021.

[4] Veech GA, Dennis J, Keeney PM jt. Häiritud mitokondriaalne elektronide transpordifunktsioon suurendab apoptootilise Bcl-2 ja Bcl-XL valgu ekspressiooni SH-SY5Y neuroblastoomi ja Parkinsoni tõve kübriidrakkudes oksüdatiivse stressi kaudu [J]. J Neurosti Res, 2000; 6(1):693-700.

[5] Wang Xiaowen, Jiang Xiaoyan, Wu Lia jt. Vabade radikaalide in vitro eemaldamine ja kaitsev toime OH-indutseeritud DNA kahjustustele, mida põhjustavad kogu glükosiididCistanche[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2001; 36(1): 29-32. Wang XW, Ji ang XY, Wu LY jt. Uuring tsistoliliste glükosiidide koguarvu kohta, mis kõrvaldavad vabu radikaale ja kaitsevad vigastatud DNA-d in vitro [J]. Chin Pharm, 2001;36(1):29-32.

[6] Sheng G, Pu X, Lei L jt. Tubulosiid B alatescistanchesalsa päästab PC12 neuronaalsed rakud 1-metüül-4-fenüülpüridiiniumi poolt indutseeritudapoptoosja oksüdatiivne stress[ J]. Play nta Med, 2002;68(11):966-970.

Alates: Neljanda sõjalise meditsiini ülikooli ajakiri (J Fourth Mil Med Univ) 2004; 25(10)

Artikli ID: 1000-2790 (2004) 10-0955-03