Abstraktne

Käesolev leiutis avalikustab aCistanche ekstrakt luu mineraalse tiheduse (BMD) parandamiseks. Väljavõttes onehhinakosiidi ja akteosiidi (verbaskosiidi) kogusisalduson>25 massiprotsenti. Ekstrakt valmistatakse sooritadesdestilleeritud vee ekstraheeriminekohtatoorpulberCistanche tubulosa, millele järgnebfiltreerimine, tsentrifuugiminefiltraadist,kontsentratsioon, vedelik-vedelik ekstraheerimine, kontsentratsioon koos lisandite eemaldamisega, lahjendamine, järelravi, ja siislõppkontsentratsioon ja kuivatamineCistanche ekstrakti saamiseks.

 

 

Cistanche ekstraktimise protsess

Leiutisekohases Cistanche ekstraktis luu mineraalse tiheduse parandamiseks onehhinakosiidi ja akteosiidi kogusisalduson25–30 massiprotsenti(v.a 25 massiprotsenti) ning ekstrakt on samuti rikasšikimiinhapesamutifenüülpropioonhappe tüüpi komponendidjaalkaloidi tüüpi komponendid, mis võimaldab seda tehaavaldavad stabiilselt luutihedust parandavat toimet.

 

Nõuded

1. Valmistamismeetod

1. Meetod Cistanche ekstrakti valmistamiseks luu mineraalse tiheduse parandamiseks, mis erineb selle poolest, et see sisaldab järgmisi etappe:

purustamineCistanche tubulosatoorpulbri saamiseksCistanche tubulosa;

destilleeritud vee lisamine toorpulbrileCistanche tubulosaekstraheerimiseks, filtreerimiseks, filtraadi tsentrifuugimiseks ja kontsentreerimiseks, et saada kontsentreeritud lahusCistanche tubulosa;

kontsentreeritud lahuse ekstraheerimineCistanche tubulosa, alumine ekstraheerimisfaas kontsentreeritakse lisandite eemaldamiseks ja lahjendatakse laadimislahuse saamiseks;

laadimislahuse järeltöötlemine, millele järgneb kontsentreerimine ja kuivatamine Cistanche ekstrakti saamiseks.

2. Materjali ja vee suhe

2. Meetod vastavalt punktile 1, mis erineb selle poolest, et toorpulbri massi ja mahu suheCistanche tubulosadestilleeritud veele on1 : (15–25).

3. Väljatõmbetemperatuur

2. Meetod vastavalt punktile 1, mis erineb selle poolest, et destilleeritud veega ekstraheerimise temperatuur on60-100 kraadi.

4. Vedeliku ja vedeliku ekstraheerimise suhe

2. Meetod vastavalt punktile 1, mis erineb selle poolest, et kontsentreeritud lahuse ekstraheerimise ajal on kontsentreeritud lahuse mahusuheCistanche tubulosaekstraheerimiseks lahusti on1 : (1–5).

5. Ekstraheerimislahusti

5. Meetod vastavalt punktile 4, mis erineb selle poolest, et ekstraheerimislahusti sisaldab vähemalt ühte järgmistestpetrooleeter, etüülatsetaat, n-heksaan või tsükloheksaan.

6. Järelravi protsess

2. Meetod vastavalt punktile 1, mis erineb selle poolest, et laadimislahuse järeltöötlus hõlmab: laadimislahuse läbiviimistmakropoorne vaikja seejärel elueeridesdestilleeritud vesija anetanooli lahus.

7. Elueerimismahud

7. Meetod vastavalt punktile 6, mis erineb selle poolest, et destilleeritud vee ja makropoorse vaigu mahusuhe on(5–10) : 1, ja etanoolilahuse ja makropoorse vaigu mahusuhe on(3–9) : 1.

8. Väljavõte

8. Cistanche ekstrakt luu mineraalse tiheduse parandamiseks, mida iseloomustab see, et see on valmistatud vastavalt ükskõik millisele punktile 1-7.

9. Aktiivse markeri sisu

9. Cistanche ekstrakt vastavalt punktile 8, mis erineb selle poolest, et ehhinakosiidi ja akteosiidi kogusisaldus on25–30 massiprotsenti, välja arvatud 25 massiprotsenti.

10. Taotlus

10. Mis tahes nõudluspunktile 8-9 vastava Cistanche ekstrakti kasutamine toote valmistamiseks luu mineraalse tiheduse parandamiseks, kusjuures Cistanche ekstrakti kontsentratsioon tootes on12,5–25 ug/ml.

 

Tehniline valdkond

[0001] Käesolev leiutis käsitleb valdkondameditsiinilised ravimvormidja on konkreetselt seotud aCistanche ekstrakt luu mineraalse tiheduse parandamiseks, sellevalmistamismeetodjarakendusi.

Taust

Cistanche viitab Orobanchaceae taimede kuivatatud lihakale varrele koos soomuslehtedegaCistanche deserticola YC MavõiCistanche tubulosa (Schenk) Wight. Cistanche'il on mitu tegevust, näiteksimmuunregulatsioon, põletikuvastane, väsimusevastane, antioksüdant, neuroprotektiivnejareproduktiivsüsteemi tugi.

Fenüületanoidglükosiidid (PhG-d) - koosehhinakosiidjaakteosiid (verbaskosiid)Olles Cistanche'i peamised PhG-d, on olulised koostisosad.ehhinakosiidon tõestatud, et sellel on mõjuluu mineraalse tiheduse parandamine. Siiski leidsime, et Cistanche ekstraktide luutihedust parandav toime onei ole seotud ainult ehhinakosiidisisaldusega. Lihtsalt ehhinakosiidi sisalduse kontrollimineei suuda tagadaet väljavõte saabstabiilseltavaldada luutihedust parandavat toimet. Seetõttu on ülioluline välja töötada Cistanche ekstrakt ja valmistamismeetod, mis suudaksstabiilselttagavad soovitud luutihedust toetava efekti.

Hiina leiutise patenditaotlusCN102441040Aavaldab Cistanche'i fenüületanoidglükosiidide valmistamismeetodi peenestamise, ekstraheerimise, makropoorse vaigu adsorptsiooni, elueerimise, kontsentreerimise jne abil. Nõrgalt happelistes tingimustes (pH 2–4) paraneb oluliselt Cistanche fenüületanoidglükosiidide stabiilsus ning saadud aktehiiniglükosiidide kogusisaldus 9% sisaldab 9%. Kuid see ei kontrolli, kas toode saabstabiilseltparandada luu mineraalset tihedust.

Hiina leiutise patenditaotlusCN105111255Aavaldab meetodi ehhinakosiidi ja akteosiidi ekstraheerimiseks ja eraldamiseks Cistanche'st, kasutades ekstraheerimislahustina 75% etanooli, täitematerjalina AB-8 makropoorset vaiku ja 55% etanooli elueerimist, saades Cistanche ekstrakti ehhinakosiidiga > 25%, akteosiidi > 25%, akteosiidi >8%. See ei pruugi siiski garanteerida astabiilneluutihedust parandav toime.

 

Leiutise kokkuvõte

[0004] Töötada välja Cistanche ekstrakt ja valmistamismeetod, mis suudabstabiilselttoetab luu mineraalse tiheduse paranemist, pakub leiutis:

Esimene aspekt: ​​ettevalmistusmeetod

Meetod Cistanche ekstrakti valmistamiseks luu mineraalse tiheduse parandamiseks, mis sisaldab:

purustamineCistanche tubulosatoorpulbri saamiseks;

toorpulbri ekstraheerimine destilleeritud veega, filtreerimine, tsentrifuugimine ja kontsentreerimine, et saada kontsentreeritud lahus;

kaevandamise teostamine; alumise faasi kontsentreerimine lisandite eemaldamiseks; lahjendamine laadimislahuse saamiseks;

laadimislahuse järeltöötlemine, kontsentreerimine ja kuivatamine Cistanche ekstrakti saamiseks.

[0005] Ühes teostuses lastakse toorpulber läbi a40-silmasõela.

Ühes teostuses on toorpulbri ja destilleeritud vee massi ja mahu suhe1 : (15–25).

[0007] Ühes teostuses on massi ja mahu suhe1 : 20.

[0008] Ühes teostuses on ekstraheerimistemperatuuriks60-100 kraadi.

[0009] Ühes teostuses on ekstraheerimise temperatuur80 kraadi.

[0010] Ühes teostuses teostatakse ekstraheerimine1-2 korda, 1 tund iga kord.

[0011] Ühes teostuses teostatakse filtreerimine läbi an80-silmafilter.

[0012] Ühes teostuses on tsentrifuugimise kiirus3000–4000 p/minja aeg on3–9 min.

[0013] Ühes teostuses on tsentrifuugimise kiirus3500 p/minja aeg on5 min.

[0014] Ühes teostuses kontsentreeritakse filtraat pärast tsentrifuugimist temperatuuril70 kraadijuurde18%–28%esialgsest mahust.

Ühes teostuses on kontsentreeritud lahuse ekstraheerimise ajal kontsentreeritud lahuse ja ekstraheerimislahusti mahusuhe1 : (1–5).

[0016] Ühes teostuses on suhe1 : 3.

[0017] Ühes teostuses sisaldab ekstraheerimislahusti vähemalt ühte järgmistestpetrooleeter, etüülatsetaat, n-heksaan või tsükloheksaan.

[0018] Ühes teostuses teostatakse ekstraheerimine järjestikku kasutadespetrooleeterjärgnebetüülatsetaat.

Ühes teostuses tähendab "kontsentreerimine lisandi eemaldamisega" alumise ekstraheerimisfaasi kontsentreerimist pastaks, selle lahustamist300 ml 50 massiprotsendilist etanooli vesilahustlisandite eemaldamiseks ja kohandamiseks1,0–1,5 g toorürti ml kohtalaadimislahendusena.

[0020] Ühes teostuses on laadimislahuse kontsentratsioon1,0–1,5 g toortaimi / ml vee kohta.

[0021] Ühes teostuses hõlmab järeltöötlus laadimislahuse läbilaskmistmakropoorne vaikja seejärel elueeridesdestilleeritud vesija anetanooli lahus.

[0022] Ühes teostuses on laadimisvoolu kiirus läbi makropoorse vaigu1–5 ml/min.

[0023] Ühes teostuses on vaikAB-8 makropoorne vaikmille vaigu maht on0.93 L.

[0024] Ühes teostuses on destilleeritud vee ja vaigu mahusuhe(5–10) : 1, ja etanoolilahuse ja vaigu mahusuhe on(3–9) : 1.

[0025] Ühes teostuses on destilleeritud vee ja vaigu mahusuhe7 : 1, ja etanoolilahuse ja vaigu suhe on6 : 1.

[0026] Ühes teostuses on etanoolilahus80% (mass/mass) etanooli vesilahus.

Teine aspekt: ​​väljavõte

[0027] Lisaks pakub leiutis ülaltoodud meetodil valmistatud Cistanche ekstrakti.

Ühes teostuses on ehhinakosiidi ja akteosiidi kogusisaldus25–30 massiprotsenti, välja arvatud 25 massiprotsenti.

Kolmas aspekt: ​​kasutamine

Lisaks pakub leiutis Cistanche ekstrakti kasutamist luu mineraalse tiheduse parandamiseks mõeldud toodete valmistamisel, kus ekstrakti kontsentratsioon tootes on12,5–25 ug/ml.

 

Eelised / kasulikud mõjud

[0030] Võrreldes tehnika tasemega on leiutisel järgmised kasulikud mõjud:

Cistanche ekstrakt sisaldab25–30 massiprotsentikogu ehhinakosiidi ja akteosiidi ning on rikasšikimiinhape, fenüülpropioonhappe tüüpi komponendid, alkaloididjarasvhapped, mis võimaldab seda tehastabiilselttoetada luu mineraalse tiheduse paranemist.

Piirkonnas12,5–25 ug/mlkontsentratsioonivahemikus, soodustab ekstrakt vohamistMC3T3-E1suurepärase proliferatiivse toimega rakud.

Ekstrakt näitab sama annusest sõltuvat suundumust rakkude proliferatsiooni soodustamisel jaALP aktiivsusning võib stabiilselt soodustada levikut ja diferentseerumist. Osteoblastide mineralisatsiooni soodustamisel näitab see paremat mõju kui positiivne kontroll17 -östradiool.

Ekstrakt stimuleerib osteoblastispetsiifilisi transkriptsioonifaktoreidRunx2jaOsx, suurendab osteoblastide diferentseerumist ja soodustab osteogeensete markerite ekspressiooniOPNjaOCN, soodustades seeläbi luu moodustumist. Samuti suurenebBmp2 mRNAekspressiooni, et suurendada osteoblastide diferentseerumist ja uue luu moodustumist, aktiveeridesBMP/Smad rada; lisaks reguleeridesLrp5 mRNA, Lrp6 mRNAjaWnt3 mRNA, see aktiveerubWnt/ -catenin signaalimine, mõjutab allavoolu transkriptsioonifaktori ekspressiooni ning soodustab osteoblastide diferentseerumist ja luu moodustumist.

Valmistamismeetod annab ekstrakti, mis sisaldab fenüületanoidglükosiide (ehhinakosiid ja akteosiid), šikimiinhapet ja fenüülpropioonhappeid, alkaloide ja rasvhappeid. Need komponendid koos võimaldavad ekstraktil proliferatsioonis, diferentseerumises ja mineraliseerumises avaldada püsivat annusest sõltuvust, võimaldades stabiilset luutihedust toetavat toimet.

 

Jooniste lühikirjeldus

Joonis. 1: ekstrakti (näide 1) mõju MC3T3-E1 rakkude proliferatsioonile
Joonis. 2: ekstrakti (näide 2) mõju MC3T3-E1 rakkude proliferatsioonile
Joonis. 3: ekstrakti (näide 3) mõju MC3T3-E1 rakkude proliferatsioonile
Joonis. 4: ekstrakti (näide 1) mõju ALP aktiivsusele
Joonis. 5: ekstrakti (näide 2) mõju ALP aktiivsusele
Joonis. 6: ekstrakti (näide 3) mõju ALP aktiivsusele
Joonis. 7: fotod osteoblastide mineralisatsiooni alisariinpunase värvumisest (näide 2)
Joonis. 8: osteoblastide mineralisatsiooni kvantitatiivsed tulemused (näide 2)
Joonis . 9–12: näite 2 mõjud Runx2, Osx, Opn, Ocn mRNA ekspressioonile
Joonis. 13: Näite 2 mõju Bmp2 mRNA ekspressioonile (BMP/Smad)
Joonis . 14–16: Näite 2 mõju Lrp5, Wnt3 , Lrp6 mRNA ekspressioonile (Wnt/ -kateniin)
Joonis. 17–18: Näite 2 mõju Osx- ja RUNX2-valgu ekspressioonile

 

Üksikasjalik kirjeldus / teostused

Näide 1

Valmistamismeetod sisaldab:

purustamineCistanche tubulosa, lastakse saamiseks läbi 40-silmalise sõela200 gtoorpulber;

ekstraheerimine koosdestilleeritud vesi massiga 5x(nagu kirjeldatud), ekstraheerimine juures75 kraadijaoks2 korda, 1 h iga, keskendudes70 kraadikontsentratsiooni suhteni1 : 2.2kontsentreeritud lahuse saamiseks;

absoluutse etanooli lisamine kontsentreeritud lahusele etanooli astmeliseks sadestamiseks, etanooli lõppmassikontsentratsiooniga20%, 40%, 60%, 80%, sadeneb kell5 kraadi 24 tundi, kogudes supernatandi pärast80 massiprotsentietanooli sadestamine;

kontsentreerimine ja kuivatamine kell70 kraadiCistanche ekstrakti saamiseks saagisega20.75%.

Näide 2

Valmistamismeetod sisaldab:

purustamineCistanche tubulosasaada240 gtoorpulber;

ekstraheerimine destilleeritud veega, filtreerimine, tsentrifuugimine ja kontsentreerimine kontsentreeritud lahuse saamiseks;

kontsentreeritud lahuse ekstraheerimine; alumise faasi kontsentreerimine lisandite eemaldamiseks; lahjendamine laadimislahuse saamiseks;

laadimislahuse järeltöötlus; kontsentreerimine ja kuivatamine kell70 kraadiekstrakti saamiseks saagisega19.69%.

Toorpulber läbib 40-mešši sõela.
Toorpulbri ja destilleeritud vee massi ja mahu suhe on1 : 20.
[0040] Ekstraheerimistemperatuur on80 kraadi.
[0041] Tehakse ekstraheerimine1-2 korda, 1 h iga.
[0042] Filtreerimine toimub läbi an80-silmafilter.
Tsentrifuugimine on3500 p/min 5 min.
Kontsentreerimine pärast tsentrifuugimist: kontsentreerida temperatuuril70 kraadijuurde20%esialgsest mahust.
[0045] Ekstraheerimise ajal on kontsentreeritud lahuse ja lahusti mahusuhe1 : 3.
[0046] Ekstraheerimine viiakse läbi järjestikkupetrooleeterjaetüülatsetaat.
Alumine faas kontsentreeritakse pastaks ja lahustatakse300 ml 50 massiprotsendilist etanooli vesilahustlisandite eemaldamiseks.
Laadimislahuse kontsentratsioon:1,0 g toortaimi 1 ml vee kohta.
Järeltöötlus: lasta läbi makropoorse vaigu, elueerida destilleeritud vee ja seejärel etanoolilahusega.
[0050] Voolukiirus läbi vaigu:3 ml/min.
Vaik:AB-8, vaigu maht0.93 L.
Destilleeritud vee ja vaigu mahusuhe:7 : 1. Etanooli-lahuse ja vaigu suhe:6 : 1.
Etanoolilahus:80% (w/w)etanooli vesilahus.

 

Tsüstanche tehase kohta lisateabe saamiseks klõpsake nuppu

Näide 3

Valmistamismeetod sisaldab:

purustamineCistanche tubulosa, lastakse saamiseks läbi 40-silmalise sõela120 gtoorpulber;

ekstraheerimine koos12 × masskohta50 massiprotsendiline etanooli vesilahus, ekstraheerimine kell70 kraadi, 2 korda, 1 h iga, keskendudes70 kraadisuhtega1 : 2.5kontsentreeritud lahuse saamiseks;

lisades kontsentratsiooni reguleerimiseks vett0,2 g toortaimi 1 ml vee kohta, tsentrifuugimine juures3500 p/min 5 min, võttes laadimislahusena supernatanti;

läbib makropoorset vaiku; järjestikune elueerimine destilleeritud vee ja etanooli lahusega; etanoolieluatsiooni kogumine ja kontsentreerimine/kuivatamine temperatuuril70 kraadiekstrakti saamiseks saagisega24.30%.

Vaik:HPD750, vaigu maht0.93 L.
Destilleeritud vee ja vaigu suhe:3 : 1. Etanooli-lahuse ja vaigu suhe:4 : 1.
Etanoolilahus:30% (w/w)etanooli vesilahus.

 

Jõudluskatsed

1.1 Rakkude proliferatsiooni test

Osteoblastid on peamised funktsionaalsed rakud, mis vastutavad luu moodustumise eest, mis hõlmavad pre-osteoblastide proliferatsiooni, luumaatriksi tootmist ja lõplikku diferentseerumist. TheMC3T3-E1rakuliini kasutatakse tavaliselt osteogeense aktiivsuse uurimiseks. Osteoblastide diferentseerumine hõlmab proliferatsiooni, diferentseerumist ja mineraliseerumist, mis väljendub suurenenud pre-osteoblastide arvus, küpsemises osteoblastideks ja uue luumaatriksi moodustumisena.

Leeliseline fosfataas (ALP)on osteoblastide fenotüübiga seotud valk, mis on tuvastatav rakkude proliferatsiooni ja maatriksi küpsemise ajal ning on tavaliselt kasutatav osteoblastide diferentseerumise varane marker.

Seetõttu võrreldi MC3T3-E1 proliferatsiooni ja ALP aktiivsust hinnates näidetes 1–3 valmistatud ekstraktide osteogeneesi soodustavat toimet.

MC3T3-E1 rakud taaselustati ja passeeriti. Pärast stabiliseerimist rakud seediti, tsentrifuugiti ja koguti. Rakkude tihedus reguleeriti nii, et iga 100 μl sisaldas 5 × 1035 × 10 ^ 35 × 103 rakku ja külvati 96 süvendiga plaadile. Pärast üleöö kultiveerimist asendati sööde täieliku söötmega, mis sisaldas näidete 1–3 ekstrakte kontsentratsioonides6,25, 12,5, 25 ja 50 ug/mlvõi sisaldavad0,1 M östradiool(positiivne kontroll) või ainult söötmega (pimekontroll) ja kultiveeriti48 h. Valguse eest kaitstud tingimustes lisati MTT põhilahust (10–20% süvendi mahust) ja inkubeeriti4 hCO₂ inkubaatoris, sööde eemaldati ja200 µl DMSO-dlisatakse formazaani lahustamiseks. OD väärtused mõõdeti juures490 nm.

Tulemused: Fig. 1 (Näide 1), Fig. 2 (Näide 2), Fig. 3 (Näide 3).

[0058] Rakkude proliferatsioonikiirus (%)=OD(Näide 1–3)–OD(Tühi)OD(Tühi)×100%\\frac{OD(\\tekst{Näide 1–3}) - OD(\\tekst{Tühi})}{OD(\\tekst{Tühi})} \\times OD10. 1–3)-OD (tühi) × 100%

Nagu on näidatud joonistel . 1–3, soodustas positiivne kontroll MC3T3-E1 proliferatsiooni. Näide 1 soodustas proliferatsiooni kontsentratsioonidel 6,25, 12,5 ja 25 ug/ml; proliferatsioonikiirus 12,5 ug/ml juures oli 1,4 korda suurem kui positiivsel kontrollil, kuid ilma olulise erinevuseta (P > 0,05). Näide 2 soodustas proliferatsiooni 6,25, 12,5, 25 ja 50 ug/ml juures; 12,5, 25 ja 50 ug/ml juures olid selle toimed paremad kui positiivsel kontrollil (P < 0,01 või P < 0,001), proliferatsioonimäärad olid 2,55×, 3,46× ja 2,59× positiivse kontrolli omast. Näide 3 soodustas proliferatsiooni kontsentratsioonidel 6,25, 12,5, 25 ja 50 ug/ml; 12,5, 25 ja 50 ug/ml juures oli see parem kui positiivne kontroll (P < 0,01 või P < 0,001), proliferatsioonimäärad olid 1,40×, 1,76× ja 0,93× positiivse kontrolli omast. See näitab, et näitel 2 oli parim mõju MC3T3-E1 proliferatsiooni soodustamisele.

1.2 ALP aktiivsuse test

[0060] ALP aktiivsust mõõdeti ALP analüüsikomplekti abil. P-nitrofenooli põhikontsentratsioon oli 10 mM ja standardkõvera kontsentratsioonid olid 0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12, 0,16, 0,2 ja 0,25 mM, valmistati gradientlahjendusega detekteerimispuhvriga.

Igasse 96-süvendilise plaadi proovisüvendisse lisati 49 μL tuvastamispuhvrit, 1 μL töödeldud MC3T3-E1 rakkudest ekstraheeritud valku (alates jaotisest 1.1) ja 50 μL kromogeenset substraati (lisati viimasena). Reaktsioon kestis 30 minutit valguse eest kaitstud inkubaatoris, lõpetati 100 μL stopplahuse lisamisega ja neeldumine mõõdeti405 nm. ALP aktiivsus arvutati standardkõvera põhjal.

Tulemused: Fig. 4 (Näide 1), Fig. 5 (Näide 2), Fig. 6 (Näide 3).

[0061] ALP aktiivsus (U/L)=(valgu suhteline molaarne kontsentratsioon) × 1000 × 100/30
(1000 molaarühiku muundamiseks; 100 kogu reaktsioonimahu jaoks; 30 30-minutise reaktsiooniaja jaoks)

ALP on MC3T3-E1 diferentseerumise varajane marker. Joonised . 4–6 näitavad, et positiivne kontroll suurendas ALP aktiivsust. Näide 1 ei soodustanud ALP aktiivsust. Näide 2 suurendas ALP aktiivsust 12,5, 25 ja 50 ug/ml juures; 25 ja 50 ug/ml juures olid erinevused võrreldes tühja katsega olulised (P < 0,01). Näide 3 suurendas ALP aktiivsust 12,5 ja 25 ug/ml juures (P < 0,001), kuid kontsentratsiooni suurenemisega suurenemine vähenes. See näitab, et ainult näited 2 ja 3 suurendasid ALP aktiivsust ja toetasid diferentseerumist.

[0062] Üldiselt näitas ainult näide 2 annuse-positiivset korrelatsiooni nii MC3T3-E1 proliferatsiooni kui ka ALP aktiivsuse osas 12,5 ja 25 ug/ml juures. Näide 3 näitas annuse-positiivset korrelatsiooni proliferatsiooni suhtes, kuid annuse-negatiivset korrelatsiooni ALP suhtes. Võrdluseks on näide 2 sobivam luu mineraalse tiheduse parandamiseks.

1.3 Näite 2 mineraliseerimine (alizariinpunane värvimine).

Kuna näide 2 näitas parimat aktiivsuse ja annuse korrelatsiooni võrreldes näidetega 1 ja 3, viidi selle mõju edasiseks hindamiseks läbi mineralisatsioonikatsed.

MC3T3-E1 rakke töödeldi pärast 72-tunnist kultiveerimist näite 2 ekstraktiga12,5, 25 ja 50 ug/ml, inkubeeriti 37 kraadi juures14 days(kaltsiumisõlmede moodustumise alusel), keskmise vahetusega iga 2 päeva järel. Alizarin Red värvimine viidi läbi: sööde eemaldati, rakke fikseeriti 10% neutraalse formaliiniga (300 μL süvendi kohta) 30 minutiks, loputati, värviti 0,1% Alizarin Rediga (300 μL süvendi kohta) 30 minutit (toatemperatuur, valguse eest kaitstud) ja pesti, kuni punast värvi ei jäänud. Pildid tehti. Seejärel lisati 10% tsetüülpüridiiniumkloriidi lahust (400 µl süvendi kohta) ja loksutati lubjastunud sõlmede lahustamiseks 1 tund. Lahustunud lahus kanti 96 süvendiga plaadile (100 µl süvendi kohta) ja OD mõõdeti562 nmmineralisatsioonikiiruse arvutamiseks. Fotod: joon. 7; kvantitatiivsed tulemused: joonis. 8.

[0065] Mineralisatsioonimäär (%)=OD(Näide 2)−OD(Tühi)OD(Tühi)×100%\\frac{OD(\\tekst{Näide 2}) - OD(\\tekst{Tühi})}{OD(\\tekst{Tühi})} \\ korda 100\\tekst(Blank)%OD(Blank) 2)-OD (tühi) × 100%

[0066] Joonisel . 7 on näidatud, et kaltsiumisõlmede arv suurenes järjestikku kontsentratsiooniga võrreldes tühja katsega. Joonis . 8 näitab, et näide 2 soodustas mineraliseerumist kontsentratsioonist sõltuval viisil kontsentratsioonidel 12,5, 25 ja 50 ug/ml, tugevaima toimega 50 ug/ml juures, mis on oluliselt parem kui positiivne kontroll (P < 0,001). Kuna mineraliseerunud sõlmed esindavad osteoblastide diferentseerumise viimast etappi, kinnitavad need tulemused veelgi näite 2 luutihedust toetavat toimet ja näitavad selle stabiilset aktiivsust. Näide 2 oli parem kui östradiool, mis näitab luu tervisetoodete potentsiaalset väärtust.

Geeni ekspressiooni ja raja mehhanism (näide 2)

Näite 2 ekstrakti (12,5, 25, 50 ug/ml) kanti MC3T3-E1 rakkudele 3 päevaks. RNA ekstraheerimine, kvantifitseerimine, pöördtranskriptsioon (20 µl süsteem; 800 ng RNA sisend) ja qRT-PCR viidi läbi, et määrata kindlaks suhtelised ekspressioonitasemed.Runx2 mRNA, Osx mRNA, Opn mRNA ja Ocn mRNA. Tulemused: joonised. 9–12.

Runx2 ja Osx on BMP signaaliülekande peamised allavoolu regulaatorid, mis kutsuvad esile osteoblastide diferentseerumise. Runx2 on oluline varajases pühendumisetapis, samas kui Osx toimib terminali eristamises. OPN ja OCN on osteoblastide aktiivsuse ja kudede mineralisatsiooni olulised näitajad. Joonised . 9–12 näitavad, et näide 2 suurendas nende markerite suhtelist ekspressiooni, toetades osteoblastide suurenenud diferentseerumist ja luude moodustumist.

[0069] Näide 2 on ülesreguleeritudBmp2 mRNA(Joonis. 13), mis näitab, et on aktiveeritudBMP/Smad rada, mis toetab osteoblastide diferentseerumist ja uue luu moodustumist.

Näide 2 suurendas suhtelist ekspressiooniLrp5 mRNA, Lrp6 mRNA ja Wnt3 mRNA(joonis. 14–16), mis toetab aktiveerimistWnt/ -catenin signaalimine, mis on tihedalt seotud osteoblastide proliferatsiooni, diferentseerumise ja luu moodustumisega.

Valgu ekspressioon (näide 2)

[0073] Western blot analüüs näitas, et näites 2 saadud kontsentratsioon suurenesOsxjaRUNX2valgu ekspressioon (joonis . 17–18), mis näitab regulatsiooni nii transkriptsiooni kui ka translatsiooni tasemel, et soodustada osteoblastide diferentseerumist.

[0075] Need aktiivsustestid näitavad, et näide 2 andis parima proliferatsiooni soodustava toime ja oli ainus, millel oli järjepidev dooside korrelatsioon nii proliferatsiooni kui ka ALP suhtes. Näide 2 oli samuti parem kui östradiool MC3T3-E1 proliferatsiooni ja mineraliseerumise soodustamisel võrreldavate diferentseerumisefektidega, mis viitab optimaalsele luutihedust toetavale potentsiaalile.

 

Keemilise koostise testimine

6.1 Fenüületanoidglükosiidide sisaldus

[0076] Viidates Hiina farmakopöa "Cistanche" analüüsimeetodile, mõõdeti ehhinakosiidi ja akteosiidi sisaldus näidetes 1–3 (tulemused on näidatud tabelis 1). Ehhinakosiidi, akteosiidi ja kogu PhG-de põhjal oli trend ühtlane: näide 3 > näide 1 > näide 2 ning näites 3 oli akteosiidi sisaldus vastavalt 3,85 × ja 4,27 × näidete 1 ja 2 omast. Aktiivsuse ja sisu tulemuste kombineerimine näitab, et ehhinakosiid ja akteosiid üksi ei määra otseselt osteogeenset toimet.

 

Tabel 1. Ehhinakosiidi ja akteosiidi sisaldus Cistanche ekstraktides (%)

Näidis (näide)	ehhinakosiid (%)	Akteosiid / verbaskosiid (%)	Kokku (%)
Näide 1	28.68	1.63	30.31
Näide 2	26.27	1.47	27.74
Näide 3	30.39	6.27	36.66

 

6.2 Muud komponendid (UPLC/Q-TOF/MS)

UPLC/Q-TOF/MS kasutati näidete 1–3 keemiliste komponentide võrdlemiseks. Vastuse väärtused on näidatud tabelis 2.

Näide 2 sisaldas lisaks ehhinakosiidile ja akteosiidile täiendavaidšikimiinhape ja fenüülpropioonhappe tüüpi komponendid, ja kaalkaloidid. Võrreldes näidetega 1 ja 3, oli näites 2 11 fenüülpropioonhappe/shikimiinhappega seotud komponenti, millel oli kõrgeim reaktsioon, sealhulgas:

Tabel 2. Cistanche ekstraktide põhikomponentide UPLC/Q-TOF/MS vastuse väärtused (näited 1–3)

注:原表为"响应值(response value)";我保留为纯数值,不加单位(与图表一致).表内分为2Šikimiinhape ja fenüülpropioonhappe derivaadid(莽草酸及苯丙酸类)与 Alkaloidid(生物碱).

A. Šikimiinhape ja fenüülpropioonhappe derivaadid

Ühend	Näide 1	Näide 2	Näide 3
Isodanfenoolhape B (异丹酚酸B)	1,514,590.932	5,985,000.378	5,279,315.212
p-hüdroksüfenüülpropioonhape (对羟基苯丙酸)	2,897,237.374	6,144,507.902	1,139,582.918
Shikimiinhape (莽草酸)	6,539,932.014	8,883,034.928	7,442,038.152
(2R)-2-[(E)-3-[3-[(1R)-1-karboksü-2-(3,4-dihüdroksüfenüül)etoksü]karbonüül-2-(3,4-dihüdroksüfenüül)-7-hüdroksü-2,3-dihüdrobensofuraan-4-üül]prop-2-enoüül,4-dioksü)-3	1,514,590.932	5,985,000.378	5,279,315.212
Bensoüülatsetoon (苯甲酰丙酮)	4,235,952.540	4,526,539.189	4,297,281.060
Epipinoresinool 4′-O- -D-glükosiid (表丁香树脂酚 4′-O- -D-葡萄糖苷)	2,758,386.748	4,338,477.068	1,182,637.856
Yangmei Changshani glükosiid* (杨梅常山苷)	713,259.014	9,202,359.822	841,791.016
Jionoside A1 (焦地黄苯乙醇苷A1)	2,184,856.679	3,736,929.302	3,098,713.743
3,4-dimetüülbensoehape (3,4-2甲基苯甲酸)	585,269.7562	1,386,349.28	1,400,433.204
Robustaside D	1,693,753.421	3,272,248.064	4,236,657.164
7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihüdroksü-6-[[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5-trihüdroksütetrahüdropüraan-2-üül]oksümetüül]tetrahüdropüraan-2-üül]oksükromeen-2-oon	4,489,728.765	1,167,879.841	824,633.4

 

---

B. Alkaloidid

Ühend	Näide 1	Näide 2	Näide 3
Vertitiin (野百合碱)	1,306,481.28	524,919.97	4,057,704.757
Dihüdrokoptisiin (氢化可他宁碱)	6,406,217.365	9,533,850.521	4,649,410.535
tümiin (胸腺嘧啶)	2,658,397.084	2,715,160.269	554,956.4602
Gelsemiin (钩吻碱)	3,698,263.919	1,554,195.385	5,144,366.562
Yohimbine (育亨宾)	3,929,806.438	1,286,932.427	9,431,924.132

isodanfenoolhape B,

p-hüdroksüfenüülpropioonhape,

(2R)-2-[(E)-3-[3-[(1R)-1-karboksü-2-(3,4-dihüdroksüfenüül)etoksü]karbonüül-2-(3,4-dihüdroksüfenüül)-7-hüdroksü-2,3-dihüdrobensofuraan-4-üül]prop-2-enoüül,4-oksü)-3

bensoüülatsetoon,

epipinoresinool 4'-O- -D-glükosiid,

müritsetiiniga seotud glükosiid (nagu loetletud),

jionosiid A1,

3,4-dimetüülbensoehape,

robustaside D,

7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihüdroksü-6-[[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5-trihüdroksütetrahüdropüraan-2-üül]oksümetüül]tetrahüdropüraan-2-üül]oksükromeen-2-oon.

See sisaldas ka 5 alkaloidi, sealhulgas:

vertikaalne,

dihüdrokoptisiin (nagu loetletud),

tümiin,

geelsemiiniga seotud alkaloid (nagu loetletud),

johimbiin.

Proliferatsiooni/ALP aktiivsuse, fenüületanoidglükosiidide analüüside ja keemilise profiilide võrdlevate tulemuste põhjal võib järeldada, et fenüületanoidglükosiidid (ehhinakosiid ja akteosiid), šikimiin-/fenüülpropioonhapped, alkaloidid ja terpenoidid moodustavad koosseisva näite 2 produktsiooniekstrakti spetsiifilise doosist sõltuvuse. (12,5–25 ug/mL) kogu proliferatsiooni, diferentseerumise ja mineraliseerumise ajal, võimaldades stabiilset luutihedust toetavat toimet.

[0081] Tabel 2: komponentide reaktsiooniväärtused.
Leiutis pakub näite 2 protsessi kaudu Cistanche ekstrakti, mille ehhinakosiidi + akteosiidi kogusisaldus on > 25% ja rikastatud šikimiin-/fenüülpropioonhapete ja alkaloididega, võimaldades stabiilset luutihedust toetavat toimet. 12,5–25 ug/ml piires soodustab see MC3T3-E1 proliferatsiooni, diferentseerumist ja mineraliseerumist annust suurendaval viisil koos järjepideva annuse korrelatsiooniga, toetades paremaid ja stabiilsemaid luu tervise tulemusi ning võimaldades kasutamist toodetes, mis on seotud luu mineraalse tiheduse parandamisega.