Cistanche Deserticolapolüsahhariidid leevendavad vananevate mudelhiirte kognitiivset langust, taastades soolestiku mikrobiota-aju telje

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Yuan Gao1,*, Bing Li1,*, Hong Liu1, Yajuan Tian2, Chao Gu1, Xiaoli Du1, Ren Bu1, Jie Gao1, Yang Liu1, Gang Li1

ABSTRAKTNE

Hiljutised tõendid näitavad, et muutused soolestiku mikrobiota-aju teljel võivad põhjustada kognitiivseid häireid.vananemine. Käesolevas uuringus täheldasime, et D-galaktoosi pikaajaline manustamine hiirtele kutsus esile kognitiivse languse, soolestiku mikroobse düsbioosi, perifeerse põletiku ja oksüdatiivse stressi. Selles vanusega seotud kognitiivse languse mudelisCistanche deserticola polüsahhariidid(CDPS) parandas D-galaktoosiga töödeldud hiirte kognitiivset funktsiooni, taastades soolestiku mikroobide homöostaasi, vähendades seeläbi oksüdatiivset stressi ja perifeerset põletikku. CDPS-i kasulikud mõjud nendel vananevatel mudelhiirtel kaotati soolestiku mikrobiota ablatsiooniga antibiootikumidega või immunosupressiooniga tsüklofosfamiidiga. Seerumi metaboolsed profiilid näitasid, et kreatiniini, valiini, L-metioniini, o-toluidiini, N-etüülaniliini, kusihappe ja proliini tasemed olidvananeminemudelhiirtel, kuid CDPS taastas need. Need leiud näitasid sedaCDPSparandab D-galaktoosi poolt indutseeritud kognitiivset funktsioonivananeminemudelit hiirtel, taastades soolestiku mikrobiota ajutelje homöostaasi, mis leevendas aminohapete tasakaalustamatust, perifeerset põletikku ja oksüdatiivset stressi.CDPSseega näitab see terapeutilist potentsiaali mälu- ja õppimishäiretega patsientidel, eriti soolestiku mikroobide düsbioosiga seotud patsientidel.

Click to Cistanche vananemisvastase kõrvalmõju

SISSEJUHATUS

D-galaktoosi (D-gal) ja berülliumi soolade pikaajaline manustamine kutsub eksperimentaalsetes loommudelites ja in vitro primaarsetes rakukultuurides esile vananemise ning seda kasutatakse loomuliku vananemisprotsessi aluseks olevate mehhanismide tuvastamiseks [1–4]. Varasemad uuringud näitavad, et D-galaktoosi indutseeritud kognitiivne langusvananeminemudelhiired on seotud vähenenud närvikasvufaktori (NGF) valgu taseme ja suurenenud reaktiivsete hapnikuliikidega (ROS) ajus, mis mõlemad põhjustavad hipokampuse neuronite degeneratsiooni ja vähendavad neurogeneesi [3, 4]. Hiljutised uuringud on samuti näidanud, et inimese soolestiku mikrobiota koostis ja arv muutuvad märkimisväärseltvananemineprotsessi[5].

Cistanchedeserticola on rohttaim, mis kasvab peamiselt Hiina loodeosas kõrbepiirkonnas ja mida kasutatakse traditsioonilises hiina meditsiinis. Seda tuntakse üldiselt kui "kõrbe ženšenni". Cistanche deserticola ekstraktid sisaldavad mitmeid farmakoloogiliselt aktiivseid ühendeid, sealhulgas fenüületanoidglükosiide, iridoide, lignoosi, oligosahhariide, polüsahhariide ja aminohappeid; neid ühendeid seostatakse põletikuvastaste, antioksüdatiivsete, vananemisvastaste, neuroprotektiivsete ja immunomoduleerivate omadustega [6, 7]. Näiteks on Cistanche deserticola'st ekstraheeritud polüsahhariide kasutatud traditsioonilises hiina meditsiinis kolorektaalse vähi raviks [8]. Mitmetest organismidest, nagu Chuanqiongi polüsahhariid, Ganoderma lucidum polüsahhariid ja Lycium barbarum polüsahhariid, on eraldatud lai valik nõrgalt toksilisi kasuliku bioaktiivsusega polüsahhariide [9–11]. CDA 0.05 on galaktoglükaan, mis on isoleeritudCistanchedeserticola, mis soodustab mitmete kasulike soolebakterite, sealhulgas mitmete Bacteroides'i ja Lactobacilluse liikide kasvu [12].

Normaalsuse aluseks olevad mehhanismidvananemineSee protsess on seotud ka mitmete inimeste haigustega, nagu neurodegeneratiivsed häired, koronaarateroskleroos, 2. tüüpi diabeet (T2DM) ja hüpertensioon [13, 14]. Hiljutised uuringud on näidanud, et muutused sooleflooras mängivad inimese vananemisel olulist rolli [15]. Mitmed uuringud on näidanud, et D-galaktoosi pikaajaline manustamine katsehiirtele ja rottidele jäljendab normaalset vananemisprotsessi ja on kasulik mudel uurimiseks.vananemineseotud fenotüübid, nagu tunnetuse langus [16]. Lisaks näitavad D-galaktoosi poolt indutseeritud vananemise mudelhiirtel muutusi soolestiku mikrobiota koostises [17]. Seetõttu püstitasime hüpoteesi, et muutused soolestiku mikrobiota koostises võivad põhjustada D-galaktoosi poolt indutseeritud vananemismudeli hiirte kognitiivset langust, ja uurisime, kasCistanche deserticola polüsahhariidid(CDPS) võib leevendada kognitiivset langust, taastades soolestiku mikrobiota düsbioosi.

TULEMUSED

D-galaktoosi poolt indutseeritud vananemise mudelhiirtel on kognitiivne langus ja soolestiku mikroobne düsbioosi

Analüüsisime metsikut tüüpi (WT) hiirte ja nende hiirte käitumist, keda raviti 150 mg D-gal-iga kehakaalu kilogrammi kohta 2 kuu jooksul (mudel või Mod), kasutades uudseid objektituvastuse ja Morrise veelabürindi (MWM) teste. Eelisindeksi väärtused uudse objekti äratundmise testis olid Mod-rühma hiirtel oluliselt vähenenud võrreldes WT-rühma hiirtega (joonis 1A, 1B). MWM-testi tulemused näitasid, et põgenemislatentsusaeg pärast kuuendat päeva suurenes Mod-rühmas WT-rühmaga võrreldes oluliselt (joonis 1C, 1D). Veelgi enam, sihtplatvormi ületused ja ujumisajad sihtkvadrandis vähenesid Mod-rühmas WT-rühmaga võrreldes oluliselt (joonis 1E, 1F). Need tulemused näitasid D-gal-indutseeritud õppimis- ja mäluvõime olulist langustvananeminemudelhiired.

Seejärel analüüsisime Mod- ja WT-rühma hiirte väljaheiteproovides soolestiku mikroobide sugukonna, perekondade ja liikide arvukuse ja koostise erinevusi, kasutades väljaheiteproovidest saadud 16S ribosomaalse RNA (rRNA) sekveneerimisandmeid. WT- ja Mod-rühma hiirte domineeriv soolefloora oli Firmicutes ja Bacteroides. Kuid Bacteroides'i arvukus vähenes oluliselt ja Firmicutes'i arvukus suurenes oluliselt Mod rühmas võrreldes WT rühmaga (joonis 2A). Järgmisena viisime läbi lineaarse diskrimineeriva analüüsi (LDA), et määrata LDA efekti suuruse (LEfSe) skoorid, millele järgnesid Kruskal-Wallise ja Wilcoxoni testid, et hinnata erinevate taksonite suhtelist arvukust WT ja Mod rühma hiirtel. LDA tulemused on näidatud joonisel 2B. Lisaks koostasime kladogrammid, mis näitavad WT- ja mudelirühmades Bacteriodes ja Firmicutes phyla kuuluvate erinevate perekondade ja liikide erinevat rikastumist (joonis 2C). Üldiselt näitasid meie tulemused kognitiivsete võimete ja soolestiku mikroobide düsbioosi halvenemist D-galaktoosist põhjustatud vananemismudeli hiirtel.

CDPS-ravi parandab D-gal-indutseeritud vananemismudeli hiirte kognitiivseid võimeid

Analüüsisime, kasCDPSravi leevendab D-gal-indutseeritud kognitiivset langustvananeminemudelhiired. 2 manustamiskuu jooksul mõõdeti kehakaalu ülepäeviti. Hiirte mudeli- ja CDPS-rühmade kehakaal olid sarnased (joonis 3A). Viige läbi käitumiskatsed pärast viimast annust. Uudsete objektide äratundmise ja Morrise veelabürindi testi tulemused näitasid, et lühiajaline mälu oli CDPS-rühma hiirtel oluliselt kõrgem võrreldes hiirte mudelrühmaga; pikaajaline mälu CDPS hiirte rühmas oli suurem, kuid statistiliselt ebaoluline võrreldes hiirte mudelrühmaga (joonis 3B, 3C). See viitas sellele, et CDPS-ravi tühistas D-gal-ga ravitud hiirtel lühiajalise objektituvastusmälu kaotuse.

Nende hiirte ruumilist õppimist ja mälu hinnati Morrise veelabürindi testiga ning tulemused näitasid, et hiirte põgenemise latentsusajadCDPShiirte rühm olid võrreldavad WT hiirte rühmaga ja oluliselt lühemad kui Mod rühma hiired (joonis 3D). Lisaks olid põgenemise latentsusajad kuuendal päeval pärast CDPS-i manustamist mudelirühmaga võrreldes oluliselt madalamad (joonis 3E). Ujumisaeg sihtkvadrandis oli CH ja CM rühmades mudelirühmaga võrreldes oluliselt pikem. CL-rühm on kõrgem kui mudelrühm, kuid sellel puudub statistiline olulisus (joonis 3F). Veelgi enam, platvormiületuste arv oli CM- ja CL-rühmades mudelirühmaga võrreldes oluliselt suurem. CH-rühm on siiski kõrgem kui mudelrühm ja sellel puudub statistiline olulisus (joonis 3G). Need tulemused näitasid, et CDPS-ravi parandas D-gal-indutseeritud vananemismudeli hiirtel ruumilist õppimist ja mälu.

CDPS-ravi taastab soolestiku mikrobiota koostise homöostaasi D-galaktoosi vananemise mudelhiirtel

Monosahhariidid ja polüsahhariidid on bakterite kasvuks vajalikud toitained [18–21]. Samuti teatatakse, etCDPSreguleerib soolestiku mikrobiota koostist [22]. Seetõttu analüüsisime, kas CDPS-ravi leevendas soolestiku mikroobset düsbioosi mudelrühma hiirtel, hinnates hiirte WT-, mudel- ja CDPS-rühmade väljaheiteproovide16S rRNA sekveneerimisandmeid.

Esiteks arvutasime alfa mitmekesisuse indeksid, et hinnata nende rühmade üldist fekaalse mikrobiota rikkust ja struktuurset erinevust. Analüüsisime alfa-mitmekesisuse (-mitmekesisuse) indekseid, nagu vaadeldud liigid, Shannoni, Chao 1, ACE ja Simpsoni indeksi väärtused, et määrata kindlaks muutused erinevate bakteriliikide koostises erinevate hiirerühmade väljaheiteproovides. Mitmekesisusindeksid (vaadeldud liigid, Shannoni, Chao 1, ACE ja Simpsoni indeksid) olid kõrgemad WT-s jaCDPShiirte rühmad võrreldes mudelrühmaga, kuid statistilist olulisust täheldati ainult Chao 1 indeksi väärtuste puhul CM rühma ja Mod rühma vahel. See näitas, et CDPS-iga manustamine suurendab mikrobioomi rikkust (joonis 4A–4E). Järgmisena analüüsisime mitmekesisuse indekseid, et teha kindlaks erinevused soolestiku mikroobiliikides hiirte WT-, mudel- ja CDPS-rühmade vahel, kasutades mittemeetrilist mitmemõõtmelist skaleerimist (NMDS), põhikoordinaatide analüüsi (PCoA) ja põhikomponentide analüüsi (PCA). . PCA näitas mudelirühma hiirte soolestiku mikroobide koostise erinevusivananemineprotsessi, sealhulgas mõõtmete vähendamist ning mustrite ja suundumuste säilitamist (joonis 4F). Väljaheite mikrobiota erinevused WT, mudeli ja CDPS rühmade vahel tuvastati 16S rRNA geenide kaalumata UniFrac kauguste PCoA põhjal (joonis 4G). Klasterdusanalüüs näitas olulisi erinevusi NMDS-is mudelrühma ning WT- ja CDPS-rühmade vahel (joonis 4H).

Hindasime soolestiku mikrobiota 10 parimat sugukonda ja leidsime, et Bacteroides phyla arvukus oli oluliselt suurem CH, CM ja CL rühmas võrreldes mudelrühmaga (joonis 4I). See viitas sellele, et CDPS taastas D-gal-ravi saanud hiirtel soolestiku mikrobiota homöostaasi. Kladogrammid näitasid Bacteriodes ja Firmicutes phyla kuuluvate erinevate perekondade ja liikide erinevat rikastumist WT-, mudeli- ja CDPS-rühmades (joonis 4J). Nagu soojuskaartidel näidatud,CDPSravi vähendas Thermoplasmata, Bacilli, identifitseerimata aktinobakterite, fusobakterite ja identifitseerimata elusimikroobiate suhtelist arvukust ning suurendas metanobakterite, spiroheetia, deltaproteobakterite, identifitseerimata _deferribacteres, mollicutes, niidentropellines{erhiays, niidentropellines{ermiays,1}, }Tsüanobakterid võrreldes mudelrühmaga (joonis 4K). Need tulemused näitasid, et CDPS-ravi taastas oluliselt soolestiku mikrobiota homöostaasi D-gal indutseeritud vananemismudelhiirtel.

CDPS-ravi leevendab neurodegeneratsiooni D-gal-indutseeritud vananemismudeli hiirtel, vähendades oksüdatiivset stressi

Järgmisena analüüsisime CDPS-i mõju põletikule, analüüsides põletikueelsete tsütokiinide (IL-2 ja TNF-) ning põletikuvastaste tsütokiinide (IL-4 ja IL-10) taset seerumis. ) erinevates hiirerühmades. Seerumi IL-2 ja TNF-tasemed olid oluliselt madalamad ning IL-4 ja IL-10 seerumitasemed oluliselt kõrgemad CH, CM ja CL rühmas võrreldes mudelrühmaga. . See näitas sedaCDPSon põletikuvastase toimega (joonis 5A–5D).

Oksüdatiivne stress on põhjustatud reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) suurenenud tootmisest ja on üks peamisi tegureid, mis soodustavadvananemine[23]. Seetõttu analüüsisime CDPS-i mõju oksüdatiivsele stressile D-gal-indutseeritud vananeva hiiremudelis, hinnates antioksüdantse ensüümi SOD ja lipiidide peroksüdatsiooniprodukti malondialdehüüdi (MDA) seerumitasemeid. MDA seerumitasemed olid oluliselt kõrgemad ja SOD tasemed seerumis oluliselt vähenenud Mod rühmas võrreldes WT rühmaga, kuidCDPSravi muutis need mõjud ümber (joonis 5E, 5F). Need tulemused näitasid, et D-gal-indutseeritud vananemismudeli hiirtel oli oksüdatiivne stress suurenenud, kuid CDPS-ravi vähendas seda.

Lisaks hindasime oksüdatiivse stressi taset ajukoes, analüüsides arenenud oksüdeeritud valguprodukti (AOPP), otsese lipiidide peroksüdatsiooni (LPO) ja MDA taset, samuti antioksüdantsete ensüümide, nagu glutatioonperoksüdaas (GSH-Px) aktiivsust. ) ja superoksiiddismutaas (SOD) ajukoe homogenaatides. Mod-rühma hiirte ajudes oli SOD ja GSH-PX aktiivsus oluliselt vähenenud ning AOPP, LPO ja MDA tase oluliselt suurenenud võrreldes WT rühmaga, kuid need mõjud olid CH, CM ja CL rühmas vastupidised (joonis 6A–6E ).

Lisaks teostasime ajuosade histoloogilise värvimise H&E ja Nissli plekkidega, et hinnata aju kaitsvat toimet.CDPSajudes D-gal indutseeritudvananeminemudelhiired. Mod-rühma hiirtel vähenes oluliselt neuronite arv ja maht, suurenes lõhe neuronite vahel, neuronite ebaregulaarne paigutus ja tuumapüknoos hipokampuse CA1 piirkonnas võrreldes WT rühmaga, kuid neid patoloogilisi muutusi vähendas oluliselt CDPS-ravi ( Joonis 6F). Need tulemused näitasid, et CDPS-ravi vähendas oluliselt oksüdatiivset stressi ja ajupatoloogiat D gal-indutseeritud vananemismudeli hiirtel.

CDPS-ravi vähendab perifeerset põletikku ja oksüdatiivset stressi, säilitades soolestiku mikroobide homöostaasi D-gal-indutseeritud mudelhiirtel

Järgmisena analüüsisime, kas muutused soolestiku mikrobiota koostises olid seotud suurenenud perifeerse põletiku ja oksüdatiivse stressiga vananemise ajal. Selleks kasutasime CDPS-iga ravitud soolestiku mikrobiota eemaldamiseks või immunosupressiooni esilekutsumiseks kolmekordse antibiootikumi kokteili (ABX rühm) või tsüklofosfamiidi (Cy rühm; vt ka materjalid ja meetodid).vananeminemudelhiired. Antibiootikumravi tühistas CDPS-ravi kasulikud mõjud vananevatel mudelhiirtel. Täheldasime ABX-rühma hiirtel õppimise ja mälu halvenemist (joonis 7A) ja muutusi soolestiku mikrobiota koostises (joonis 7B, 7C) võrreldes CDPS-ga ravitud rühmaga. Ülaltoodud tulemused näitavad, et isegi manustamineCDPSei suuda pärast soolefloora muutmist suurendada hiirte õppimis- ja mäluvõimet. Lisaks täheldasime ABX-rühma hiirte ajus ja seerumis põletikueelsete tsütokiinide taseme tõusu võrreldes CDPS-rühmaga (joonis 7D–7N). ABX rühma ja CY rühma tulemused näitasid, et pärast soolefloora ja immuunfunktsiooni hävitamist ei suutnud isegi CDPS-i manustamine parandada hiirte õppimis- ja mäluvõimet. Need tulemused näitasid, et CDPS-ravi vähendas perifeerset põletikku, oksüdatiivset stressi ja D-gal-indutseeritud kognitiivset langust.vananeminemodelleerida hiiri, vältides soolestiku düsbioosi.

Seejärel kasutasime immunosupressiivset ravimit tsüklofosfamiidi [24], et määrata põletiku osa CDPS-i kasulikes mõjudes. Tsüklofosfamiidiga töödeldud CDPS-hiirtel (Cy rühm) ilmnes halvenenud õppimis- ja mäluvõime, muutused soolestiku mikrobiota koostises ning pro- ja põletikuvastaste tsütokiinide ebanormaalne tase ajus ja seerumis võrreldes metsiktüüpi ja seerumis.CDPSrühma hiired. Siiski pole mudeli ja ABX-rühmaga võrreldes mingit tähtsust. (Joonis 7A–7N). Need andmed näitavad, et muutused soolestiku mikrobiota koostises suurendavad D-gal-indutseeritud perifeerset põletikku.vananeminemudelhiired.

CDPS hoiab ära D-gal-indutseeritud vananemise, reguleerides aminohapete metabolismi

Peremeesorganismi immuunsüsteemi mõjutavad soolestiku mikrobiota tekitatud metaboliidid [25]. Väljaheite metaboliidid esindavad soolestiku mikroobide metabolismi ja soolestiku mikroobide koostise funktsionaalset näitu[26]. Lisaks sisenevad soolestiku mikrobiota metaboliidid vereringesse ja mõjutavad peremeesorganismi ainevahetust ja tervist [26, 27]. FWT, Mod ja seerumiproovis tuvastati kokku 1058 metaboliitiCDPShiired. Seejärel analüüsisime neid metaboliite BioCyci, Kyoto geenide ja genoomide entsüklopeedia (KEGG) ja inimese ainevahetuse andmebaasi (HMDB) abil ning leidsime, et Mod rühmas ekspresseeriti WT rühmaga võrreldes 65 metaboliiti erinevalt. Lisaks leidsime, et 8 metaboliidi (kreatiniin, valiin, L-(-)-metioniin, o-toluidiin, N-etüülaniliin, kusihape, proliin ja fenüülalaniin) tasemed erinesid oluliselt WT, Mod ja CDPS rühmades. Nende 8 metaboliidi radade rikastamise analüüs, kasutades MetaboAnalyst [28, 29], näitas, et need metaboliidid olid seotud arginiini, histidiini, arginiini, proliini ja puriini metabolismiga (joonis 8A, 8B). 7 erinevat metaboliiti MOD rühmast ja CDPS rühmast WT rühmas.

Seejärel analüüsisime, kas muutused aminohapete metabolismis olid seotud muutustega soolestiku mikrobiota koostises. Täheldasime, et 7 erinevat WT, Mod ja CDPS rühmade metaboliiti (kreatiniin, valiin, L-(-)-metioniin, o-toluidiin, N-etüülaniliin, kusihape ja proliin) vähenesid oluliselt ABX, Cy ja Mod-rühmad võrreldes WT- ja CDPS-rühmadega. Lisaks pole ABX ja Cy rühmade vahel mingit tähtsust (joonis 8C). Lõpuks, selleks, et uurida, on seos diferentseeritud ainevahetuse ja muude vananemisega seotud haiguste vahel. Analüüsisime nende seitsme erinevalt ekspresseeritud metaboliidi ja inimeste haiguste vahelist seost, kasutades MetaboAnalysti andmebaasi ja leidsime, et need metaboliidid olid seotud Alzheimeri tõvega (p=0.00173; joonis 8D, 8E). Üldiselt viitasid need andmed selleleCDPSkaitseb D-gal-indutseeritudvananeminereguleerides aminohapete metabolismi.

ARUTELU

Kognitiivse funktsiooni järkjärguline langus on vananemisele iseloomulik tunnus. Varasemad uuringud näitasid, et CDPS-ravi parandas oluliselt õppimist ja mälu vananevatel mudelhiirtel [30–33]. Selles uuringus näitasime, et CDPS-ravi parandas kognitiivset funktsiooni, pärssides perifeerset põletikku ja oksüdatiivset stressi, taastades D-gal-indutseeritud soolestiku mikroobide homöostaasi.vananeminemudelhiired (joonis 9). Sprague-Dawley rotid toidetiCistanche polüsahhariididnäitas kasulike soolebakterite suurenenud kasvu ja soolestiku mikroobide mitmekesisust [34]. CDA-0.05, Cistanche neutraalne polüsahhariid, parandas probiootiliste laktobatsillide kasvu [22]. Need andmed viitasid sellele, et Cistanche polüsahhariidid parandasid soolestiku bakterite homöostaasi.

Selles uuringus näitasime sedaCDPSomab põletikuvastast toimet ja parandab vananevate mudelhiirte kognitiivseid võimeid, moduleerides soolestiku bakteriperekondade, nagu Bacteroidetes, Firmicutes ja Proteobacteria, arvukust. Seega võib CDPS olla terapeutiliselt kasulik vananemisega seotud haiguste korral, kujundades ümber soolestiku mikrobiota koostist [35, 36]. Lisaks on varasemad uuringud näidanud, et põletikuliste tsütokiinide tase seerumis ja käärsooles on seotud bakteriperekondade, nagu Bacteroidetes, Firmicutes ja Proteobacteria, suhtelise arvukusega [37, 38]. Lisaks reguleerib soolestiku mikroobide koostis aju funktsiooni, moduleerides mitmete tsütokiinide ringlevat taset [39–43]. Meie tulemused näitasid, et CDPS-ravi vähendas Thermoplasmata, Bacilli, identifitseerimata Actinobacteria, Fusobacteria ja tuvastamata Elusimicrobia suhtelist arvukust ning suurendas Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, identifitseerimata _Deferribobacteria,,M Anatroollicuphateres,, Erysipelotrichia ja tuvastamata{9}}tsüanobakterid.

Soolestiku mikroobsed metaboliidid vabanevad vereringesse ja reguleerivad peremeesorganismi tervist ja ainevahetust [26, 27]. Soolestiku mikroobide metaboliite saab hinnata, hinnates väljaheite metaboliitide koostist, mis muutub koos soolestiku mikroobide koostise muutumisega [44]. Hiljutised uuringud on näidanud, et tsitrulliini, proliini, arginiini, asparagiini, fenüülalaniini ja treoniini plasmatasemed on seotud neurodegeneratiivsete häiretega, sealhulgas Alzheimeri tõvega [45, 46]. Meie uuring näitas, et seerumi kreatiniini, valiini, L-metioniini, o-toluidiini, N-etüülaniliini, kusihappe ja proliini taset seostati D-gal-indutseeritudvananeminehiirtel.

Immuunsüsteemi kaasasündinud ja adaptiivsed käed mängivad olulist rolli peremees-mikroobse homöostaasi säilitamisel soolestiku luminaalsel pinnal [47]. Soolestiku mikrobiota mängib olulist rolli ka kesknärvisüsteemi (KNS) ja immuunsuse reguleerimisel, vabastades vereringesse tsütokiine ja metaboliite [48, 49]. Põletikueelsed tsütokiinid mängivad võtmerolli mitmetes neurodegeneratiivsetes haigustes [50–52]. Näiteks on vanusega seotud kollatähni degeneratsioon (AMD) ja glaukoom seotud amüloidi (A) rakuvälise akumuleerumisega ning hüperfosforüülitud tau (p-tau) ja raua rakusisese ladestumisega võrkkesta ganglionrakkudes (RGC) [44]. Lisaks mängib põletik olulist rolli glaukoomiga seotud patogeneesis [53]. Nägemiskahjustus on Alzheimeri tõve (AD) varajane sümptom ja see avaldub enne kognitiivse languse algust [54]. Meie uuring näitas sedaCDPSkaitseb kognitiivse languse ja perifeerse põletiku eest, säilitades soolestiku mikrobiota homöostaasi.

Sellel uuringul on mitmeid piiranguid. Esiteks ei ole seos aminohapete metabolismi ja soolestiku mikrobiota koostise vahel hästi teada. Teiseks pole CDPS-i koostis ja molekulaarstruktuur teada. Seetõttu on vaja tulevasi uuringuid, et täiendavalt uurida CDPS-i regulatiivset rolli AD leevendamisel soolestiku mikrobiota-ajusignaali telje kaudu.

Kokkuvõtteks näitas meie uuring sedaCDPSparanenud kognitiivne võime D-gal-indutseeritudvananeminemodelleerida hiiri, taastades soolestiku mikrobiota homöostaasi, taastades seeläbi aminohapete tasakaalustamatuse, perifeerse põletiku ja oksüdatiivse stressi. Need leiud viitavad sellele, et CDPS on potentsiaalne ravimeetod õppimis- ja mäluhäiretega patsientidele, eriti neile, mis on seotud soolestiku düsbioosiga.

MATERJALID JA MEETODID

CDPS-i valmistamine

Umbes 1.0 kg puhastatudCistanche deserticolakuivatati õhu käes ahjus 40 kraadi juures ja pulbristati toorpulbriks. Pulbrit ekstraheeriti kuumas etanoolis 3 tundi. Jääk filtriti filtraadi eemaldamiseks läbi marli ja lahjendati seejärel veega (8x) ja keedeti püstjahutiga järjestikku 2 h, 1,5 h ja 1 h 90 °C juures. Igal ajahetkel lahust tsentrifuugiti, et eraldada supernatant ja kombineeritakse pruunikaspunase filtraadiga. Seejärel filtraat kontsentreeriti alandatud rõhul, jahutati toatemperatuurini, lisati aeglaselt 95% etanoolile (3x) ja lasti seista temperatuuril 4 °C 24 tundi. Seejärel tsentrifuugiti lahust kiirusel 6000 p/min 20 minutit temperatuuril 4 °C. Sade koguti pärast kolmekordset veega ekstraheerimist ja alkoholiga sadestamist. Sade lahustati vees, valguvaba, dialüüsiti ja külmkuivatati, et saada toorproduktCistanche deserticola polüsahhariid(CDPS). Ultraviolettspektrofotomeetriliselt hinnates oli polüsahhariidide sisaldus üle 90%.

Loomade rühmitamine ja ravi

Kaheksanädalased isased Kunmingi hiired (SCXK litsentsi nr.{2}}) osteti ettevõttelt SPF Biotechnology Co. Ltd (Peking, Hiina), neid hoiti valgusküllases ja kontrollitud temperatuuriga ruumis ning neid toideti toidu ja veega. Kõik loomkatsed viidi läbi vastavalt Sise-Mongoolia Meditsiiniülikooli institutsionaalse loomade hooldamise ja kasutamise komitee poolt heaks kiidetud protokollidele. Katsed viidi läbi vastavalt riiklike tervishoiuinstituutide (NIH) laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhendile.

Pärast 1-nädalast kohanemist uue keskkonnaga jagati 120 hiirt järgmisse 7 rühma: (1) metsiktüüpi kontroll (WT); mudelrühm (150 mg/kg/päevas D-gal; Mod); (3) CH: D-gal pluss 100 mg/kg CDPS; (4) CM: D-gal pluss 50 mg/kgCDPS; (5) CL: D-gal pluss 25 mg/kg CDPS; (6) ABX rühm: antibiootikumid pluss D-gal pluss 50 mg/kg CDPS; (7) Cy-rühm: tsüklofosfamiid pluss D-gal pluss 50 mg/kg CDPS.

Mudeli, ABX, Cy ja CDPS rühmade hiired said 2 kuu jooksul iga päev soolalahuses lahustatud 15{9}} mg/kg D-gal subkutaanse süsti. WT rühmale süstiti subkutaanselt võrdne kogus soolalahust 2 kuu jooksul. CDPS-rühma hiirtele manustati iga päev ka intragastraalseid süstimisi, mis sisaldasid 100 mg/kg, 50 mg/kg või 25 mg/kg CDPS-i 2 kuu jooksul. ABX rühma hiired said 2 kuu jooksul lisaks D-gal ja 0,5 mg/ml streptomütsiini joogivett.CDPSsüstid. Enne D-gali manustamist süstiti hiirtele 7 päeva jooksul 0,1 mg/ml ampitsilliini, 0,5 mg/ml streptomütsiini ja 0,1 mg/ml kolistiini ABX grupis. Cy rühma hiired said lisaks igapäevastele D-gal ja CDPS süstidele intraperitoneaalselt 20 mg/kg tsüklofosfamiidi igal teisel päeval (qod) 2 kuu jooksul.

Uudne objekti tuvastamise test

Viige läbi käitumiskatsed pärast viimast annust. Objekti tuvastamise test hõlmas tutvumise, koolituse ja testimise etappe. Tutvumisetapis harjutati hiiri tühjas testimiskambris 10 minutit kahe päeva jooksul. Seejärel asetati kolmandal päeval (koolituspäeval) kaks sama suuruse, kuju ja värvi eset (A1 ja A2) kambri vastasotstesse. Seejärel anti igale hiirele 10 minutit aega kahe sarnase objekti uurimiseks. Pärast 1-tunnist (kolmandal päeval) ja 24-tunnist (neljandal päeval) treeningu-testimise intervalli asendati üks sarnastest objektidest (A1 või A2) B või C-ga. objekt, mis on katsepäeval erineva suuruse, värvi ja kujuga. Testimisetapis testiti iga hiirt 5 minutit ja eelisindeks arvutati uudse objekti (B või C) tuvastamise mälu määramiseks järgmise valemi abil: Eelistusindeks=Aeg objektil B või C/( Aeg objektil B või C pluss Aeg objektil A) × 100 protsenti .

Morrise veelabürindi test

Morrise veelabürindi test viidi läbi ümmarguses basseinis, mille sügavus oli 45 cm ja läbimõõt 90 cm. Protokoll, mida on kirjeldanud Ruediger S et al. (2011) [55] ja Wood RA, et al. (2018) [56] töötas siin. Vee sügavus basseinis oli 30 cm ja vee temperatuur 20±1 kraadi C. Platvormi läbimõõt oli 6 cm ja veealune 1 cm. Koolituse ja testimise aeg oli kumbki 60 s. Treeningu jaoks viisime iga päev viie järjestikuse päeva jooksul läbi neli 60-sekundilise peidetud platvormiga katset. Kui hiired 60 sekundi jooksul platvormi ei avastanud, juhatati nad platvormile ja asetati platvormile 5 sekundiks. Testimisetapis registreeriti ja analüüsiti peidetud platvormile jõudmise latentsust koolitus- ja proovikatsetustes, eemaldatud platvormi asukoha ületamise arv ja sihtmärk (platvormi) kvadrandis veedetud aeg.

ELISA testid

Põletikueelsete tsütokiinide, nagu IL-2(), IL-4, IL-10 ja TNF-tasemeid seerumis analüüsiti iga hiirte rühma puhul, kasutades ELISA komplekte, mis osteti ettevõttelt Shanghai Yi Li. Biological Technology Co., Ltd. (Shanghai, Hiina) vastavalt tootja juhistele. Antioksüdantse ensüümi, superoksiiddismutaasi (SOD) aktiivsust ja lipiidide peroksüdatsiooniprodukti malondialdehüüdi (MDA) taset iga hiirte rühma seerumis analüüsiti Nanjing Jianchengi bioinstituudist (Nanjing, Hiina) ostetud testikomplektidega. . Hiire hipokampuse proovides hinnati täiustatud oksüdatsioonivalguproduktide (AOPP) tasemeid, kasutades ELISA komplekti ettevõttelt Shanghai Yi Li Biological Technology Co. Ltd. (Shanghai, Hiina) vastavalt tootja juhistele.

Oksüdatiivse stressi hindamine hiire ajus

Homogeniseerisime 100 mg hipokampuse kudet 0,9 ml jääga jahutatud soolalahusega ja homogenaati tsentrifuugiti kiirusel 12000 p/min 30 minutit temperatuuril 4 °C. Supernatandi valgusisaldust analüüsiti BCA Protein Assay Kit abil ( Beyotime Biotechnology, Shanghai, Hiina). Lipiidide peroksüdatsiooni (LPO) ja malondialdehüüdi (MDA) taset ning GSH-Px ja SOD aktiivsust hipokampuse proovides analüüsiti kolorimeetria abil, kasutades Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Hiina) komplekte vastavalt tootja juhistele.

Soolestiku mikrobiota koostis

Kõikidelt hiirtelt koguti väljaheiteproovid ja neid säilitati kohe temperatuuril -80 C. 16S rRNA geeni V3 pluss V4 piirkond sekveneeriti Illumina MiSeq (Beijing Novogene Co. Ltd., Peking, Hiina) abil ja analüüsiti QIIME abil. avatud platvorm soolestiku mikrobiota profiilide määramiseks.

Seerumi metaboliitide LC/MS analüüs

Valkude sadestamiseks inkubeeriti seerumiproove 1 0 minutit eeljahutatud metanooliga vahekorras 1:3. Proove tsentrifuugiti kiirusel 12{14}}00 p/min 15 minutit temperatuuril 4 °C. Supernatante analüüsiti Thermo Scientific Dionex UltiMate3000 kiire resolutsiooniga vedelikkromatograafia ja QExactive massispektriga. Kromatograafilised tingimused on näidatud tabelis 1. Analüüdid eraldati XBridge BEH Amide kromatograafilises kolonnis (2,1 × 100 mm; Waters Co., Milford, MA, USA), kasutades liikuvate faasidena A ja B 0,1 protsenti sipelghapet ja atsetonitriili. , vastavalt. Voolukiiruseks määrati 0,4 ml/min, süstimismaht oli 5 µl ja kolonni temperatuur määrati 25 °C peale (tabel 1). Massispektri signaalid saadi positiivsete ja negatiivsete ioonide skaneerimise režiimide abil. Ioonipihustuspinge ja muud spetsiifilised MS parameetrid on näidatud tabelis 2.

Statistiline analüüs

Statistical analysis was performed using the SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). The data plots were generated using GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, La Jolla, California, USA). Partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) of SIMCA-P+13.0 (Umetrics, AB, Umeå, Sweden) and Principal Components Analysis (PCA) were used to assess normalized GC-MS spectral data. Variable Influence on Projection (VIP) values were used to identify significant variables with VIP values >1.{1}} ja lk< 0.05.="" these="" significant="" variables="" were="" used="" to="" identify="" the="" spectral="" peaks.="" the="" student's="" t-test="" was="" used="" to="" analyze="" differences="" between="" two="" groups="" of="" data.="" the="" taxonomic="" rank="" differential="" between="" groups="" was="" determined="" using="" student's="" test="" (v3.1.2;="" r="" programming="" language).="" the="" correlation="" between="" genera="" abundance="" and="" mouse="" behavior="" was="" calculated="" using="" spearman="" correlation="" coefficients="" (r="" language).="" p="" <="" 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" the="" data="" are="" presented="" as="">