Tsistanche mõju neurotoksiini 1-metüül-4 -fenüülpüridiiniumi (MPP) poolt indutseeritud dopamiinergiliste neuronite apoptoosile

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Tian Jiyu, Chen Jianzong

(Traditsiooniline Hiina meditsiin ja Hiina Materia Medica uurimiskeskus Xijingi haiglas, FMMU, Xi'an 710032)

Abstraktne

Eesmärk: mõjude uurimiseksTsistanche esmase kultuuri dopamiinergiliste neuronite apoptoosirakkudel, mis on indutseeritud 1-metüül-4-fenüülpüridiiniumi (MPP pluss) poolt. meetod: Küüliku seerumi valmistamiseks, mis koosnebCistanchekasutab seerumi farmakoloogia meetodit. Seejärel analüüsige Cistanche'i mõju DA-neuronite apoptoosirakkudeleMPP plussindutseeritud mudelid, kasutades morfoloogilist, voolutsütomeetriat, TUNELi värvimist.Tulemus: 200 μmol/L töötlemineMPP pluss24 tundi või kauem indutseeritud apoptoos DA neuronites. PärastMPP plussravitud rühmas, mis sisaldab samaväärset Cistanche seerumi annust, on apoptoosi suhe 6,3 protsenti.MPP plussüksi ravitakse 30,2 protsenti . B- ja C-rühma apoptoosirakkude arv on oluliselt väiksem kui E-rühmas (P<0.05).>Järeldus: Sisaldunud seerumCistanchepoolt indutseeritud kaitstud apoptoosi DA neuronidMPP pluss.

Märksõnad: Cistanche;1-metüül-4-fenüülpüridiinium(MPP pluss ); dopamiinergilised neuronid; apoptoos

Praegu on peamiseks teraapiaksParkinsoni tõbion levodopa (L-dopa) ühendpreparaatide asendusravi, mis ei suuda haiguse arengut kontrollida. Haiguse edenedes annust suurendatakse ja üldiselt 3–5 aasta jooksul ravitoime väheneb, motoorsed sümptomid kõikuvad ja tekivad ravimitest põhjustatud düskineesiad. Hiljutised uuringud on leidnud, et L-dopa indutseerib apoptoosi in vitro kultiveeritud neuronites[1, 2] ja seejärel on tehtud ettepanek, et endogeense dopamiini neurotoksiline toime põhjustab dopamiinergiliste neuronite kadu.Parkinsoni tõbi. Üks põhjusi [3]. Pikaajalises kliinilises praktikas oleme kasutanud Hiina meditsiinimaksa ja neerude toitminekombineerituna levodopa preparaatidega PD raviks ja saavutas häid tulemusi [4-6]. Selles katses uuriti traditsioonilise hiina meditsiini kaitsvat toimet dopamiinergilisele neuronite apoptoosile ja selle mehhanismi molekulaarselt ja rakuliselt.

1. Materjalid ja meetodid

1.1 Materjalid

DMEM sööde,1-metüül-4-fenüülpüridiinium, MPP pluss, veise loote seerum, mis on ostetud firmalt Gibco.Tsütarabiin, polü-l-lüsiin, PLLosteti firmalt Sigma Company. 24-kaevu kultuuriplaat, 25 cm2

Plastikust kultiveerimiskolvidosteti ettevõttelt NUNC Company.Hiina meditsiinolime kasutatud, osteti Xi'an Decoction Piece Factory'st. Loomi, keda kasutasime, annab kooli loomakeskus.https://www.xjcistanche.com/products

1.2 Raviseerumi valmistamine ja eksperimentaalne rühmitamine

Cistanche valmistatakse külmkuivatatud pulbrina säilitamiseks ja lahjendatakse kasutamisel destilleeritud veega. Loomaseerum valmistati Uus-Meremaa suurekõrvalisest valgest küülikustseerum, kes kõik olid terved isased, kaaluga 2.5-3.0 kg. Loomade ekvivalentne doos arvutatakse ümber vastavalt kehapinna pindalale ja jagatakse juhuslikult kontrollrühma tühjaks seerumiks; 1/2 ekvivalentdoosirühma seerumit (Cistanche'i toorme ravimmaterjali sondidoos 0,8g/kg); samaväärse annuse rühmseerum(Sondiannus on Cistanche cistanche originaalravimmaterjal 1,6g/kg); 2 korda samaväärse annusegaseerum(sondiannus on Cistanche originaalravim materjal 3,2g/kg). Sondiga kaks korda päevas kokku 3 päeva, 1 tund pärast viimast sondimist, unearteri verelaskmine, üleöö 4 kraadi juures, tsentrifuugimine kiirusel 2500 p/min 25 minutit, seerumi hoolikas eraldamine, inaktiveerimine 56 kraadi juures kraadi 30 minutit ja imemine läbi 0,22 μm filtrimembraani Filtreerige bakterid ja säilitage -20 kraadi juures. Samadel tingimustel valmistati küüliku kontrollseerumi tühiproov sondiga võrdse koguse normaalse soolalahusega. Katse jagati 5 rühma. A-rühm oli tühi jänesseerumkultuuri kontrollrühm; B-grupp oli aseerumikultuur pluss MPPravirühm, mis sisaldab 2 korda samaväärset annust; C-grupp oli aseerumikultuur pluss MPPsamaväärset annust sisaldav ravirühm; Rühm D oli seerumikultuuri kontrollrühm, mis sisaldas 1/2 ekvivalentset doosi seerumikultuuri pluss MPP-ravi rühm; E rühm on tühi küüliku seerumikultuur pluss MPP-ga töötlemisrühm.

Cistanche kasu

1.3 Keskaju dopamiinergiliste neuronite kasvatamine

Valiti kolm 14-päevast tiinust SD-rotti ja tapeti õhuemboolia otsese süstimisega südamesse; embrüonaalsed rotid võeti aseptilistes tingimustes välja ja asetati jääga D-Hanksi lahusega täidetud Petri tassi. Roti loote ajukude lõigati lahti ja eraldati stereomikroskoobi all. Viitemeetodit [7] täiustati veidi. Ajukelme ja vaskulaarne kude kooriti maha ning eraldati ventraalse keskaju A8, A9 ja A10 piirkonna koed. Lisage 1 ml 0,125% pankreatiini ja asetage see umbes 20 minutiks 37-kraadisesse inkubaatorisse, lisage seedimise lõpetamiseks sobiv kogus söödet, mis sisaldab 10% veise loote seerumit, ja kasutage aspiratsiooni.

Pipeteerige toru ühtlaseks rakususpensiooniks, tsentrifuugige toatemperatuuril 5 minutit kiirusel 15{8}}0 p/min, eemaldage supernatant ettevaatlikult, pipeteerige õhukese kaelaga pipetiga 15 korda ja laske 5 minutit seista. Lisage 24-lüsiini süvendisse kultiveerimisplaadil igasse süvendisse kultiveerimissöödet, et reguleerida rakkude tihedust 2 × 105 rakku/ml, lisage söödet 0,5 ml-ni süvendi kohta ja lisage tsütarabiin pärast 3-päevast kultiveerimist ( lõppkontsentratsioon on 10μmol/L), pärsivad mitte-neuronite kasvu.

1.4 Türosiinhüdroksülaasi (TH) immunotsütokeemiline värvimine

SABC-meetodit kasutades sisaldab antikeha lahjendi veise seerumi albumiini 1g/100mL (Boster Company, Wuhan), 0,3 protsenti Triton-100 (Sigma, USA), NaN3 80mg/ 100 ml, lahjendatud PBS-ga 100 ml-ni, reguleerida pH väärtuseni 7,6. Kultiveerimine lõpetati 7. päeval, pesti D-PBS-ga 5 minutit 3 korda, värskelt valmistatud 4% paraformaldehüüdi fikseeriti toatemperatuuril 30 minutit ja pesti D-PBS-ga 5 minutit 3 korda; 1:1:8 vesinikperoksiidi, metanooli ja PBS lahusega Inkubeerida 30 minutit toatemperatuuril, loputada D-PBS-ga 5 minutit, lisada 5 protsenti blokeerivat kitse seerumit 30 minutiks toatemperatuuril, loputada D-PBS-iga 5 minutit. minutit ja lisage kitse hiirevastane TH antikeha, mis on lahjendatud antikeha lahjendiga (lahjendus 1:1000, Calbiochem)), öö läbi temperatuuril 4 kraadi, loputage D-PBS-ga 3 minutit 3 korda, lisage biotinüülitud hiire anti-roti IgG, mis on lahjendatud antikehaga. lahjendit (lahjendatud 1:200, Sigma USA), toimige toatemperatuuril 4 tundi, loputage D-PBS-ga 3 minutit 3 korda, lisage toatemperatuuril 2 tundi antikeha lahjendiga lahjendatud HRP kompleksi ja loputage D-PBS-iga. 3 minutit 3 korda. Loputage DAB-lahjendit 3 minutit, lisage rakkudesse kasutusvalmis DAB-kromogeenne reaktiiv (Wuhan Boster Company) ja jälgige värvi pöördmikroskoobi all.https://www.xjcistanche.com/

1.5 Narkootikumide käitlemine

Kultiveeritud neuronite morfoloogilisi vaatlusi viidi läbi iga päev faasikontrastmikroskoobi all ja muutused salvestati fotodega. Pärast 12-tunnist kultiveerimist vaadeldi rakke pöördmikroskoobi all ja ravimid lisati vahetult enne liitumist. Iga rühma seerumisisaldus oli 10 protsenti. Pärast 3-päevast kultiveerimist lisati MPP pluss lõppkontsentratsioonini 200 μmol/L. Pärast 24-tunnist inkubeerimist 37 kraadises 5% CO2 inkubaatoris tehke erinevaid kontrolle.

Cistanche

1.6 Voolutsütomeetria tuvastamine

Narkootikumide ravi oli sama, mis varem. Pärast iga rühma töötlemist digereeriti kleepuvad PC12 rakud 0,125% trüpsiiniga ja rakke võeti ligikaudu 1 × 106 PBS-iga. Rakke pesti kaks korda ja lisati 490 µl sidumispuhvrit ning rakud segati põhjalikult ja lisati 5 µl anneksiin V. FITC ja 10 μL lahustatud PI rakususpensioonis, segage õrnalt, asetage katseklaas 4 kraadini, inkubeerige 10 minutit pimedas ja testige COULTER EPICS voolutsütomeetriga (Beckman Coulter, USA).

1.7 In situ lõppmärgistus (TUNEL) raku apoptoosi tuvastamiseks

Kultiveeritud neuronite DNA in situ otsa märgistamisel kasutatakse Bosteri apoptoosi tuvastamise komplekti (MK1022) ja sammud on järgmised: Võtke iga rühma dopamiinergilised neuronirakud pärast MPP pluss töötlemist (slaid enne esmast kultuuri on eelkultiveeritud polümeeri lüsiiniga), fikseeritakse 4{{30}}g/l paraformaldehüüdiga 1 tund, värske 3-protsendilise äädikhappega (pH2,5) toatemperatuuril 10 minutit, neutraliseeritakse aluseline fosfataas, lisage 0,1 mol/L TBS (pH 7,5) 1:200 värskelt lahjendatud proteinaas K lagundamist 37 kraadi juures 20 sekundi jooksul, lisage igale objektiklaasile 1 μL TdT ja DIG-d-UTP ning 2 tunniks 37 kraadi juures 18 μL puhverlahust; lisage igale slaidile toatemperatuuril 30 minutiks 50 μL blokeerivat lahust; lisage 50 μL blokeeriva lahusega lahjendatud biotinüülitud anti-digoksigeniini antikeha; reageerida 30 min märjas kastis 37 kraadi juures ; lisage igale slaidile 50 μL SABC-AP, mis on lahjendatud 0,1 mol/L TBS-ga; Proovile lisati 30 minuti jooksul värvi saamiseks BCIP/NBT (0,1 mol pH 9,5 /L TBS, lahjendatud 1:20); samal ajal alternatiivset kontrolli (kasutati TdT/biotiini-dUTP segu asemel TdT puhvrit) fotomikrograafiaks ja pöördfaasikontrastmikroskoobiks (200×). Jälgige apoptootilisi rakke. Loendage positiivsed rakud faasikontrastmikroskoobi all, loendage igas rühmas 5 välja süvendi kohta, kokku 6 süvend.

2. Katsetulemused

2.1 Kultiveeritud neuronite morfoloogiline vaatlus

Vaadeldud OlympusIX70 faasikontrastmikroskoobiga: 5 tundi pärast nakatamist kinnitub suurem osa rakkudest seina külge, rakud on hajutatud, raku keha on ümmargune, tuum on nähtamatu ja murdumisnäitaja on tugev. Pärast 24-tunnist kultiveerimist kasvasid raku väljaulatuvad osad ja pikenesid järk-järgult. 48 tunni pärast ulatus enamik rakkudest välja hargnenud filamentsete eenditega. Rakkude morfoloogia oli mitmekesine, mis oli bipolaarne, tripolaarne ja multipolaarne ning moodustas järk-järgult hõreda võrgu. Rakukeha oli laienenud, ümmargune ja elliptiline. Pärast MPP pluss vigastust rakud esmalt paisusid, murdumisnäitaja suurenes, rakud olid degeneratiivses seisundis ning lõpuks rakud kahanesid ja kukkusid maha. Hiina meditsiini sisaldava seerumi erinevatel annustel on MPP-le ja vigastustele kaitsev toime. Pärast kultuuri värvimist TH-i immuunrakkudega oli näha, et TH-positiivsed rakud olid pruunid ja neuriitide väljakasvuga. Pärast traditsioonilise hiina meditsiini seerumi ekvivalentannuse lisamist on TH-positiivsete osakaalneuronidvõib ulatuda 55 protsendini -60 protsendini.

2.2 Voolutsütomeetria testi tulemuste analüüs (vt joonis 1)

Apoptoosi varases staadiumis rakumembraanis paiknev fosfatidüülseriin (PS) migreerub rakumembraani välisküljele. Fosfatidüüli siduv valk V (anneksiin V) on kaltsiumist sõltuv fosfolipiidi siduv valk, millel on kõrge afiinsus PS-i suhtes. Seetõttu saab anneksiin V-d kasutada sondina rakumembraani pinnal eksponeeritud PS tuvastamiseks. Samal ajal kombineerituna PI välistamismeetodiga kahekordseksvärvimineapoptootiliste rakkude puhul saab apoptootilisi rakke tuvastada voolutsütomeetria abil. Joonise 1 alumises parempoolses kvadrandis (FITC pluss /PI-) kuvatakse iga rühma apoptoosi üksikasjad. Rakkude osakaal, apoptoosi määr igas rühmas oli 4,1 protsenti, 5,8 protsenti, 6,3 protsenti, 28,6 protsenti, 30,2 protsenti.

2.3 TUNELi värvimistulemuste analüüs

Need, mille tuumas on sinakaslillad osakesed, on positiivsed rakud, st apoptootilised rakud. Apoptootiliste rakkude osakaal igas rühmas loendati valgusmikroskoobi all. Apoptootiliste rakkude arv vaatevälja kohta igas rühmas oli: Rühm A 2,13±0,34; B-rühm 4,92±0,67; rühm C 6,20±1,47; D-rühm 10,33±1,51; E rühm 12,74±2,51. Pärastt-testi analüüs,B- ja C-rühmi võrreldi E-rühmaga (P<0.05). the="">tulemusedon põhimõtteliselt kooskõlasvoolutsütomeetria tulemused.

3. Arutelu

Parkinsoni tõbikuulub hiina meditsiinis "treemori sündroomi" kategooriasse. Traditsiooniline hiina meditsiin usub, et PD tekkimine on enamasti eakate maksa ja neerude järkjärgulise ammendumise ja ajuüdi meridiaani toitumise vähenemise ilmingute jada. Peamine ravi ontoidavad maksa ja neere, rahustada maksa ja kõrvaldada tuul. Traditsiooniline hiina meditsiin võib mängida eesmärki "toksilisuse vähendamine ja tõhususe suurendamine"ravisParkinsoni tõbi, kuid selle toimemehhanism pole praegu väga selge. Suur hulk eksperimentaalseid tõendeid kaasaegses meditsiinis näitavad, et oksüdatiivne stress on üks teguritest, mis põhjustab PD närvirakkude surma [3]. Uuringud on leidnud, et tsistanši glükosiidid võivad tõhusalt eemaldada erinevaid reaktiivseid hapnikuvabu radikaale ja kaitsta DNA-d OH-st põhjustatud oksüdatsiooni eest[8]. Cistanche ekstrakti tubulosiid B võib nõrgendada tsütotoksilisust, mis on põhjustatudMPP pluss,nõrgendavad reaktiivsete hapniku liikide akumuleerumist rakus ja avaldavad antagonistlikku toimet apoptoosile ja oksüdatiivsele stressile, mis on põhjustatudMPP pluss[9]. Traditsiooniline hiina meditsiin suudab aktiveerida ja tugevdada oma kaitsesignaali rada, seista vastu välistele kahjustustele ja taastada oma tasakaalu. See on Hiina traditsioonilise meditsiini moderniseerimise üks eesmärke. Pärast dopamiini asendusravi väärtustavad inimesed praegu üldiselt neuroprotektiivset ravi, mida nimetatakse teiseks revolutsiooniks haiguste ravis.Parkinsoni tõbi. Selles katses kultiveeriti eraldatud keskaju dopamiinergilisi närvirakke seerumit sisaldava Hiina meditsiiniga ja leiti, et Cistanche'il on teatud neuroprotektiivne toime. Selles katses kasutati kahte voolutsütomeetria ja TUNEL-värvimise tuvastamismeetodit, et üheaegselt leida, et samaaegselt Cistanche'i ravimseerumikultuuri ekvivalentannuse rühma seerum ja 2-kordne ekvivalentdoosirühma seerum võivad vähendada primaarselt kultiveeritud keskaju dopamiininärvi, mis on põhjustatudMPP plussApoptootiliste rakkude arvul on apoptootiliste rakkude suhtes teatud kaitsev toime. Traditsiooniline hiina meditsiin suudab kaitsta dopamiinergilisi neuroneid varajases staadiumis kahjustuste eest, mis on teistest ravimeetoditest olulisem meede. Selles mõttes on Hiina meditsiini terviklik käsitlus ravi algpõhjuse vastu ja seda võib pidada üheks neuroprotektiivseks ravimeetodiks, mida inimesed praegu hindavad.

Viited

1. Ziv I, Zilkha-Falb R, Offen D jt. Levodopa indutseerib kultiveeritud neuronaalsetes rakkudes apoptoosi - kas Parkinsoni tõve nigrostriataalse degeneratsiooni võimalik kiirendaja? Mov Disord, 1997, 12(1):17

2. Jenner PG, Brin MF. Levodopa neurotoksilisus: eksperimentaalsed uuringud versus kliiniline tähtsus. Neurology, 1998, 50(6 Suppl 6): S39

3. Maruyama W, Naoi M. Rakusurm Parkinsoni tõve korral. J Neurol, 2002, 249 (lisa 2): II6

4. Chen Jianzong, Jiang Wen, Shi Jian jt. Kliiniline vaatlus Parkinsoni tõve ravi kohta maksa- ja neerufunktsiooniga: aruanne 60 juhtumi kohta. Chengdu traditsioonilise hiina meditsiini ülikooli ajakiri, 1999, 22(3): 14

5. Chen Jianzong, Chen Xiaoli, Li Junchang jne. Kliiniline vaatlus 40 Parkinsoni tõve juhtumi kohta, mida ravitakse maksa ja neerude toitmise meetodil. Research in Chinese Medicine, 1998, 14(3): 10

6. Chen Jianzong, Jiang Wen, Wu Baron jt. Pingchan nr 1 suukaudne vedelik 40 Parkinsoni tõve juhtumi ravis. Journal of Anhui College of Traditional Chinese Medicine, 1999, 18(2): 9

7. Shimoda K, Sauve Y, Marini A jt. Kõrge protsentuaalne türosiinhüdroksülaas-positiivsete rakkude saagis roti E14 mesentsefaalse rakukultuurist. Brain Res, 1992, 586 (2): 319

8. Wang Xiaowen, Jiang Xiaoyan, Wu Liya Yiming jt. Vabade radikaalide in vitro eemaldamine ja kaitsev toime OH-indutseeritud DNA kahjustustele, mis on põhjustatud tsistanche koguglükosiididest. Chinese Pharmaceutical Journal, 2001, 36(1): 29

9. Sheng G, Pu X, Lei L jt. Cistanche salsa tubulosiid B Päästab PC12 neuronaalsed rakud 1-metüül-4-fenüülpüridiiniumiioonide poolt indutseeritud apoptoosist ja oksüdatiivsest.Stress.Planta Med, 2002, 68(11):966