Cistanche polüsahhariidide apoptootiline toime leukeemiale

Autor:

LI Yan,Zhang Jin,Zhang Jing-Nan,et al.

Sise-Mongoolia, Hiina

Et uurida apoptootilist toimetCistanche polüsahhariidid( CDP) inimese pealäge leukeemiarakuliin Jurkat rakud.meetodidCDP mõju tuvastamiseks rakkude proliferatsioonile kasutati MTT testi, Kaspaasi-9 ja kaspaasi-3 aktiveerimise tuvastamiseks kasutati Western blottingut, ja testiti ka apoptootilisi signaalimolekule.ＲtulemusedT-rakkude proliferatsiooni inhibeeris 1 mg/ml ja 2 mg/ml CDP, T-rakkude apoptoosi kutsus esile 5 mg/ml CDPjaprokaspaasi-9 ja pro-kaspaasi-3 ekspressioon vähenes oluliselt. Rakupinna retseptorite CD45 ja CD71 ekspressiooni inhibeeris oluliselt 5 mg/ml CDP, Indutseeriti EＲK fosforüülimine, ja JNK fosforüülimine oli pärsitud.

Järeldused

【Võtmesõnad】Cistanche polüsahhariidid; Apoptoos; Ｒ retseptor; kaspaas-9; kaspaas-3

Äge lümfoblastne leukeemia (ALL) on lümfisüsteemi pahaloomuline kloonhaigus, millel on kõrge immunofenotüübi heterogeensus. , kergesti taastuv jne. Praegu on tavaliselt kasutatavad ravimeetodid luuüdi siirdamine, induktsioonravi, immunoteraapia, kombineeritud keemiaravi jne. Kuna enamikul keemiaravi ravimitel on piiratud võime kasvajaid sihtida ja tappa, võivad need põhjustada tõsist kahju seedesüsteemile, veresüsteemile, südame- ja tserebrovaskulaarsed jne. Ravi ajal kaasnevad sellega sageli suured kõrvaltoimed, millest mõned on isegi surmavad. Keemiaravi edenedes kipub organism arendama tolerantsust keemiaravi ravimite suhtes, mis suurendab haiguse kordumise ohtu.

Seetõttu on praeguse tähelepanu keskpunktiks saanud ülitõhusa, madala toksilisuse ja väga sihipärase leukeemiaravi või adjuvantravi otsimine.Cistanchenimetatakse mongoolia keeles Chagangaoya. See kuulub perekonda Ledangaceae ja perekonda Cistanche. See on parasiitne kõrbepuude juurtel ja omab "kõrbe ženšenni" mainet.

Cistanche peamised toimeained on fenüületanoidglükosiidid, lignaanid, betaiinid, steroolid, aminohapped ja polüsahhariidid. Põletikuvastane, viirusevastane, antioksüdant, immuunregulatsioon ja muud toimed.

Uuringud on leidnud, etCistanche polüsahhariid (CDP),kui üks selle peamisi aktiivseid komponente,omab kasvajavastast ja immunomoduleerivat toimet.Uurijad leidsid, et CDP-l on leukeemiarakkudele K562 ja THP{1}} märkimisväärne surmav toime, ning väitsid, et CDP-l on teatav rollleukeemia ennetamine või ravi. Lisaks on traditsioonilises hiina meditsiinis ühend cistanche ägedate haiguste raviksleukeemia, Cistanchemängib samuti rolli ühe olulise komponendina. Kuid spetsiifiline toimemehhanismCistancheei ole teada. Selles artiklis käsitletakse isoleerimist ja puhastamistCistanche CDPuuriti ning CDP surmavat toimet ja sellega seotud mehhanismi inimese ägeda leukeemia rakuliinil Jurkat.

1.1 Peamised reaktiivid ja instrumendid

Cistanche pulber osteti Sichuanist WecistancheGroup Co, Ltd., inimese ägeda leukeemia rakuliin Jurkat osteti Shanghai Rakubioloogia Instituudi rakupangast, tiasoolsinine (MTT) ja naatriumdodetsüülsulfaat (SDS) osteti ettevõttelt Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd., veise loote seerum (FBS) osteti ettevõttelt Hangzhou Sijiqing Bioengineering Materials Co., Ltd., tsüsteiini sisaldav kaspaas-3, kaspaas-9, CD71, CD45, fosforüülitud c-Jun aminoterminaalne kinaas (p -JNK) ja fosforüülitud ekstratsellulaarse signaaliga reguleeritud kinaasi (p-ERK) antikehad osteti ettevõttest Cell Signaling Technology, USA ja aktiini antikehad osteti ettevõttest Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. Elektrokeemia Luminestsentsi (ECL) substraat osteti ettevõttest Thermo. Scientific Company of the United States ja teised reaktiivid olid kodumaise analüütilise kvaliteediga. Gel-View 6000 pluss intelligentne pilditööjaam (Guangzhou Boluteng Biotechnology Co., Ltd. toode), Revolve FL tagurpidi fluorestsentsmikroskoop (Echo Laboratories, USA toode), EPOCH mikroplaadilugeja (Beijing Bo Teng Instrument Co., toode, Ltd.).

1.2 CDP eraldamine ja puhastamine Võtke 500 gCistanche ekstrakti pulber, leotage seda üleöö 95 protsendilises etanoolis, filtreerige marli abil, koguge filtrijäägid kokku, keetke kuuma veega 60 kraadi juures 2 h/kord, kokku 3 korda. Pärast lõppu ühendati filtraadid kolm korda, kontsentreeriti alandatud rõhul 2/3-ni esialgsest mahust, lisati 3 korda mahust 95% etanooli ja lasti seista 4 kraadi juures üleöö. Järgmisel päeval tsentrifuugige kiirusel 4 000 p/min 10 minutit, koguge sade, eemaldage valk Sevag-meetodil, sadestage absoluutse etanooliga, külmkuivatage CDP saamiseks.

1.3 Rakukultuur Inimese ägeda leukeemia rakuliini säilitati Jurkat laboris vedelas lämmastikus. Kasutamisel koguti rakud kiiresti 37-kraadises veevannis ja kultiveeriti RPMI1640 söötmes (mis sisaldas 100 U/ml penitsilliini ja 100 U/ml streptomütsiine) 10% FBS-iga. Rakke kultiveeriti 37-kraadises 5% CO2 rakuinkubaatoris, passeeriti iga 2–3 päeva järel ja katsed viidi läbi, kui rakud sisenesid logaritmilise kasvufaasi.

1.4 MTT katse Võeti logaritmilises kasvufaasis olevad Jurkat-rakud, tsentrifuugiti rakusademe saamiseks ja loendati 5 x 105 rakku/ml. Võtke 96-süvendiga rakukultuuri plaat, inokuleerige igasse süvendisse 100 ul rakku ja seejärel lisage kontrollrühmaks 100 ul RP-MI1640 täielikku söödet; katserühm jagati 3 rühma, kasutades esmalt RPMI1640 söödet CDP erinevate kontsentratsioonide valmistamiseks ja seejärel lisades igasse süvendisse 100 ul RP-MI1640 söödet. CDP lõppkontsentratsiooni määramiseks vastavalt 1, 2 ja 5 mg/ml kasutati ul Jurkat rakke ja 100 ul CDP lahust. Iga rühm moodustati 5 kahekordse süvendiga ja inkubeeriti 37-kraadises rakuinkubaatoris 48 tundi. Pärast inkubeerimist lisage igasse süvendisse 20 ul MTT-d (põhilahuse kontsentratsioon on 5 mg/ml), asetage see tagasi rakuinkubaatorisse ja jätkake inkubeerimist 4 tundi ning lõpuks lisage 100 ul 20 protsenti. SDS formazaani lahustamiseks 37 kraadi juures üleöö ja kasutage seda järgmisel päeval. Iga rühma neeldumine 570 nm juures tuvastati mikroplaadilugejaga ja CDP erinevate kontsentratsioonide pärssimise kiirus Jurkat rakkude proliferatsioonil arvutati valemiga.

1.5 Western blot analüüs Jurkat rakud logaritmilises kasvufaasis võeti ja külvati 6-süvendiga plaadile tihedusega 2 × 105 rakku/ml, 500 ul süvendi kohta ja 500 ul RPMI1640 täissöödet lisati kontrollile. Grupp. Moodustage 3 katserühma, 1, 2 ja 5 mg/ml polüsahhariidiga ravirühmad, CDP

Eelnevalt lahustatud RPMI1640 täissöötmes, lisati 6-süvendiga plaadile 500 ul rakke ja 500 ul erineva kontsentratsiooniga CDP lahuseid ja inkubeeriti 37 kraadi juures 48 tundi. Pärast kultiveerimist koguti iga rühma rakususpensioonid, tsentrifuugiti kiirusel 1 500 p/min 5 minutit, et saada rakupelletid, ja pesti kaks korda eeljahutatud fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS). Pärast pesemist lisati igale rühmale 20 ul rakkude lüüsipuhvrit ja rakke lüüsiti jääl 30 minutit. Kogu valk ekstraheeriti ja rakkude kontsentratsiooni reguleeriti Bradfordi meetodil. Igast rühmast võeti SDS-polüakrüülamiidgeelelektroforeesi (PAGE) jaoks 20 ug valku ja valk kanti elektroporatsiooniga polüvinülideenfluoriid (PVDF) membraanile. Blokeeriti rasvavaba piimapulbriga toatemperatuuril 1 tund, lisati küüliku anti-inimese kaspaas-3 ja kaspaas-9 antikehad lahjendussuhtega 1:1 000, inkubeeriti toatemperatuuril 1 tund. h, loputatakse 3 korda fosfaat-Tween puhvri (PBST) loksutiga (10 min/kord), lisatakse mädarõika peroksidaasiga (HRP) märgistatud sekundaarne antikeha (1:1 000), inkubeeritakse 1 tund toatemperatuuril, loputatakse 3 korda PBST-ga, loputa 1 kord PBS-ga, lisa ECL substraati ja kasuta Pildistamiseks kasutati intelligentset pilditööjaama ning iga rühma ribamuutusi võrreldi CDP poolt indutseeritud Jurkat rakkude apoptoosi uurimiseks. Apoptoosi rajaga seotud valkude tuvastamiseks olid rakukultuuri ja CDP-ravi tingimused samad, mis ülal. Pärast reaktsiooni rakud lüüsiti valgu kvantifitseerimiseks. Valk kanti PVDF membraanile SDS-PAGE ja elektroporatsiooni abil. Pärast 1-tunnist lõssipulbriga blokeerimist lisati anti-CD71, CD45, p-JNK ja p-ERK antikehad (1:1 000) ja inkubeeriti toatemperatuuril 1 tund. HRP-märgistatud sekundaarset antikeha (1:1 000) inkubeeriti 1 tund ja lõpuks kasutati intelligentset pilditööjaama pildistamiseks, et uurida CDP-indutseeritud Jurkat-raku apoptoosi signaalmolekule. Saadud eksperimentaalsed ribad muudeti kujutisega J (1.8.0) halliks.

Klõpsake siin, et teada saada Cistanche'i mõju kasvajavastasele ja vähivastasele toimele

1.6 Statistiline analüüs T-testi ja dispersioonanalüüsi jaoks kasutati tarkvara SPSS21.{3}}

2 tulemust funktsiooni Cistanche sisse lülitatudleukeemia

2.1 Rakkude proliferatsiooni tase

CDP isoleeriti edukalt, selle suhkrusisaldus oli üle 9{{20}} protsenti ja valgusisaldus alla 5 protsendi. Rakkude proliferatsiooni pärssimise kiirus 1 mg/ml CDP rühmas oli (19,1 ± 2,1) protsenti, samas kui 2 mg/ml ja 5 mg/ml CDP rühmas oli (44,2 ± 5,2). ) ) protsenti ja (47,8 ± 4,4) protsenti, mis näitab, et CDP võib annusest sõltuval viisil oluliselt pärssida Jurkat rakkude proliferatsiooni. 2.2 Võrreldes kontrollrühmaga (0,62±0.04, 0,56±{{40}}.{{49 }}7), põhjustas apoptoosi tase 5 mg/ml CDP-ga töödeldud Jurkat rakkudes kaspaas-9 ja kaspaas{{30}}. Pro-form pro-kaspaas-9 ( 0. 09 ± 0. 02) ja pro-kaspaas-3 ( {{ 63}}. 12 ± 0. 01) olid oluliselt vähenenud ning 1 mg/ml ja 2 mg/ml CDP rühmad olid prokaspaasi -3 suhtes rakkudes oluliselt vähem efektiivsed. Kaspaas-9 (0,58±0,04, 0,51±0,01) ja pro-kaspaas-3 sisaldus (0,48±0,04, 0,44±0,05) ei avaldanud olulist mõju, st madal. CDP kontsentratsioon ei indutseerinud Jurkat rakkude apoptoos, kuid pärssis peamiselt rakkude proliferatsiooni, nagu on näidatud joonisel 1.

1-4: võrdlusrühm,

1 mg/ml CDP rühm, 2 mg/ml CDP rühm, 5 mg/ml CDP rühm; sama mis järgmisel joonisel

Joonis 1 CDP mõju kaspaasile-9 ja kaspaasile-3 Jurkati rakkudes

Cistanche polüsahhariidide mõju leukeemiale

2.3 CD71 ja CD45 suhtelised ekspressioonitasemed apoptoosi retseptori kontrollrühmas olid 1.00±0.04, {{10}},54±54± 0.{{20}}2. 5 mg/ml CDP rühm võib oluliselt inhibeerida CD71 (0.05±0.02). 01) ja CD45 (0. 13 ± {{40}}. 03); 1 mg/ml ja 2 mg/ml CDP rühmad võivad teatud määral inhibeerida CD71 ekspressiooni (0,52 ± 0,06, 0,43 ± 0,07). CD45 ekspressioonile ei olnud olulist mõju (0,51). ±0,01, 0,48±0,02). Vaata joonist 2.

Joonis 2 CDP mõju retseptorite ekspressioonile rakumembraani pinnal

2.4 Apoptoosiga seotud teed

P-JNK ja p-ERK suhtelised ekspressioonitasemed võrdlusrühmas olid 1,20±0.08 ja 0,21±0 .03. 5 mg / ml CDP rühm kutsus esile apoptoosi ja vähendas oluliselt JNK fosforüülimise taset. ( 0. 32 ± 0. 04) , suurendas oluliselt ERK fosforüülimise taset (1, 13 ± 0. 05); 1 mg/ml, 2 mg/ml CDP suurendas JNK fosforüülimise taset (1,12 ± 0. 06 , 1.06 ± 0,06) ei avaldanud olulist mõju, kuid suurendas siiski ERK fosforüülimise taset (0, 54 ± 0, 04, 0, 63 ± 0, 02). Vaata joonist 3.

Joonis 3 CDP mõju JNK ja ERK fosforüülimisele

3 Arutelu

Viimastel aastatel on uuringud leidnud, et CDP-l on leukeemia rakuliinidele teatav inhibeeriv toime, kuid konkreetne toimemehhanism pole veel teada.

Apoptoosi protsessis on kaspaas -9 üks ülesvoolu signaalimolekule kaspaasist sõltuvas apoptoosiprotsessis. Pärast signaali stimuleerimist hüdrolüüsitakse prokaspaas-9 massiliselt, et tekitada lõhustatud kaspaas-9, mis jätkab apoptootiliste signaalide edastamist allapoole, et soodustada apoptoosi protsessi. Kaspaas-3 on efektor-tüüpi kaspaasimolekul ja võtmetähtsusega signaalmolekul raku kaspaasist sõltuva apoptoosi protsessis. Normaalsetes tingimustes eksisteerib see ka pro-ensüümi (pro-kaspaas-3) kujul. Pärast hüdrolüüsiga aktiveerimist tekib suur kogus lõhustatud kaspaasi. -3, lüüsib see rakkudes mitmesuguseid võtmevalgumolekule ja kutsub lõpuks esile apoptoosi. CDP kuulub bioloogiliste makromolekulide aktiivsete polüsahhariidide hulka ega saa läbi rakumembraani vabalt rakkudesse siseneda. Seetõttu indutseerib CDP apoptoosi, mõjutades retseptorite ekspressiooni ja jaotumist Jurkat rakumembraanide pinnal, edastades seeläbi signaale rakkude sisemusse ja lõpuks aktiveerides kaspaaside perekonna. valk, mis põhjustab raku apoptoosi. See uuring näitab, et CDP madal kontsentratsioon ei indutseeri Jurkat rakkude apoptoosi, vaid pärsib peamiselt rakkude proliferatsiooni. CD71, tuntud ka kui transferriini retseptor, on II tüüpi transmembraanne glükoproteiini retseptor, mis osaleb raua imendumises ning rakkude kasvu ja arengu reguleerimises. CD71 ekspresseerub tugevalt ägeda leukeemiaga patsientidel ja on seotud primaarse ravimiresistentsusega, st CD71 ekspressiooniga. Mida suurem väärtus, seda halvem on esimese keemiaravi mõju. Seetõttu on CD71 üks abidiagnoosi markereid. CD45 ekspresseeritakse igat tüüpi leukotsüütide pinnal, mida tuntakse ka leukotsüütide ühise antigeenina. See kuulub I tüüpi transmembraanse glükoproteiini hulka ja on tihedalt seotud T-rakkude arengu ja diferentseerumisega. CD45-l on erinevat tüüpi leukeemia korral erinevad ekspressioonitasemed ja allosteerilised tüübid, mistõttu saab seda kasutada ühe markerina leukeemia diferentsiaaldiagnostikas ja immunofenotüüpimisel. CD45 monoklonaalset antikeha on laialdaselt kasutatud leukeemia, eriti ravimresistentse leukeemia ravis. Friesen et al. leidis, et radionukliidid

Märgistatud CD45 mAb võib indutseerida apoptoosi ravimiresistentsetes leukeemia rakuliinides, aktiveerides kaspaaside perekonna valke (sh kaspaas-3, kaspaas-8 ja kaspaas-9). CDP indutseerib Jurkat rakkude apoptoosi, toimides esiteks rakumembraani pinnaretseptoritele CD45 ja CD71, mõjutades nende kahe ekspressiooni ja jaotumist, edastades rakkudesse apoptoosisignaale ning lõpuks aktiveerides kaspaasi-9 ja kaspaasi{{8 }}, käivitades apoptoosi. Kuid nii kaspaas-9 kui ka kaspaas-3 asuvad apoptootilisest rajast allavoolu ja ülesvoolu signaalimolekule tuleb täiendavalt uurida. Selles uuringus indutseeris CDP kontsentratsioonis 5 mg/ml Jurkat rakkude apoptoosi, inhibeerides samal ajal CD45 ekspressiooni, mis oli sarnane ülalkirjeldatud CD45 monoklonaalse antikeha omaga. Seetõttu apoptoosiga seotud retseptorite CD45 ja CD71 vaatenurgast,Cistancheomab teatud potentsiaali leukeemia raviks või adjuvantraviks.Mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi süsteemid (MAPK-d) ekspresseeritakse kõigis eukarüootsetes rakkudes.

Cistanche tabletid leukeemia ravi immuunsüsteemi parandamiseks

See on väga oluline teabe edastamise rada, mis viib rakuvälise stimulatsiooni signaali ülekande rakusisestesse ja koosneb seriini/treoniini proteiinkinaasidest, sealhulgas ERK, JNK ja p38MAPK. Selle fosforüülimine ja defosforüülimine on raku elutegevuse lülitid ja on seotud rakkude kasvu, proliferatsiooni, diferentseerumise, aktiveerimise ja apoptoosi protsesside reguleerimisega. See uuring viitab sellele, et JNK defosforüülimine osaleb CDP-indutseeritud T-rakkude apoptoosis, samas kui ERK fosforüülimine on seotud kahe protsessiga, kuna CDP inhibeerib rakkude proliferatsiooni ja indutseerib apoptoosi.

Kokkuvõtteks,Cistanche CDPomab tsütotoksilist toimet T-lümfotsütaarse leukeemia rakuliinile Jurkat, mis näitab, et madalad kontsentratsioonid (alla 2 mg/ml) inhibeerivad rakkude proliferatsiooni, kõrged kontsentratsioonid (5 mg/ml) aga indutseerivad apoptoosi.Cistanche CDPindutseerib Jurkat rakkudes apoptoosi peamiselt rakke mõjutades ja muutes.

Apoptoosiga seotud retseptorite CD71 ja CD45 ekspressioon membraani pinnal edastab signaale rakkude sisemusse, põhjustades veelgi ERK fosforüülimist ja JNK defosforüülimist ning lõpuks kaspaasi -9 aktivatsiooni, mis omakorda aktiveerib kaspaasi{{4} } apoptoosi esilekutsumiseks.