Abstraktne

Sissejuhatus: Taruvaik on vaigune looduslik aine, mida mesilased koguvad erinevate puude ja taimede pungadest ja eksudaatidest; on laialt levinud seisukoht, et taruvaigu koostis sõltub kogumiskoha fütogeograafilistest omadustest.

Tistanche glükosiid võib samuti suurendada SOD aktiivsust südame- ja maksakudedes ning oluliselt vähendada lipofustsiini ja MDA sisaldust igas koes, eemaldades tõhusalt erinevaid reaktiivseid hapnikuradikaale (OH-, H2O₂ jne) ja kaitstes tekitatud DNA kahjustuste eest. OH-radikaalide poolt. Tsistanche fenüületanoidglükosiididel on tugev vabade radikaalide eemaldamisvõime, suurem redutseerimisvõime kui C-vitamiinil, nad parandavad SOD aktiivsust sperma suspensioonis, vähendavad MDA sisaldust ja omavad teatud kaitset sperma membraani funktsioonile. Tsistanche polüsahhariidid võivad suurendada SOD ja GSH-Px aktiivsust D-galaktoosi poolt põhjustatud eksperimentaalselt vananevate hiirte erütrotsüütides ja kopsukudedes, samuti vähendada MDA ja kollageeni sisaldust kopsudes ja plasmas ning suurendada elastiini sisaldust. hea puhastav toime DPPH-le, pikendab hüpoksia aega vananevatel hiirtel, parandab SOD aktiivsust seerumis ja aeglustab eksperimentaalselt vananevatel hiirtel kopsude füsioloogilist degeneratsiooni Raku morfoloogilise degeneratsiooniga on katsed näidanud, et Cistanche'il on hea antioksüdantne võime ja sellel on potentsiaal olla ravim naha vananemishaiguste ennetamiseks ja raviks. Samal ajal on Cistanche ehhinakosiidil märkimisväärne võime eemaldada DPPH vabu radikaale ja eemaldada reaktiivseid hapniku liike, takistada vabade radikaalide poolt indutseeritud kollageeni lagunemist ning samuti on sellel hea parandav toime tümiini vabade radikaalide anioonide kahjustustele.

Klõpsake valikul Cistanche Tubulosa Supplement

【Lisateabe saamiseks: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Eesmärgid: Selle uuringu eesmärk oli määrata Benini (põhja-, kesk- ja lõunaosa) ja Aafrika Kongo erinevates piirkondades kogutud kaheksa taruvaikupartii etanooliekstraktide fütokeemiline koostis.

Materjalid ja meetodid:Taruvaigu proovide iseloomustamiseks kasutati erinevaid sidekriipsuga kromatograafilisi meetodeid kombineerituna süsiniku-13 tuumamagnetresonantsi (13C NMR) dereplikatsiooniga MixONat tarkvaraga. Seejärel hinnati nende antioksüdantset või anti-arenenud glükatsiooni lõpp-produkti (anti-AGE) aktiivsust, kasutades vastavalt difenüülpikrüülhüdrasüüli ja veise seerumi albumiini teste.

Tulemused: Kromatograafilised analüüsid koos 13C NMR dereplikatsiooniga näitasid, et kaks Benini kesklinnast võetud proovi sisaldasid lisaks suurele hulgale pentatsüklilisi triterpeene, metoksüleeritud stilbenoide või fenantreene, mis vastutasid esimese ekstrakti antioksüdantse toime eest. Nende hulgas võib kombretastatiin olla tsütotoksiline. Teise puhul olid Macaranga-tüüpi taruvaigus tuntud prenüleeritud flavanoonid vastutavad nende olulise AGE-vastase toime eest. Kongost pärit proov koosnes paljudest Mangifera indica liikidesse kuuluvatest triterpeeni derivaatidest.

Järeldus: Seetõttu näib Benini kesklinnast pärit taruvaik oma antioksüdantsete ja AGE-vastaste omaduste tõttu erilist huvi pakkuvat. Sellegipoolest, kuna taruvaiku standardimine on troopilistes piirkondades selle suure keemilise mitmekesisuse tõttu keeruline, on enne taruvaigu toidu- ja tervisetoodetes kasutamise edendamist Aafrikas vaja süstemaatilist fütokeemilist analüüsi.

MÄRKSÕNAD

13C NMR dereplikatsioon, metoksüleeritud stilbenoidid või fenantreenid, pentatsüklilised triterpeenid, prenüülitud flavanoonid, taruvaik

1. SISSEJUHATUS

Taruvaik on looduslik vaigune aine, mida mesilased koguvad erinevate puude ja taimede pungadest ja eksudaatidest, segatuna mesilasvaha ja süljeensüümidega.1 Seda kasutavad mesilased sissepääsu kaitsmiseks sissetungijate eest, ummistavad augud, siluvad siseseinu, mumifitseerivad surnud loomi. (väikesed putukad) taru sees ja tasakaalustavad äärmuslikke niiskus- või põuatingimusi.2,3 Taruvaigu on rahvameditsiinis laialdaselt kasutatud iidsetest aegadest, kuna sellel on palju raviomadusi.4 Taruvaik koosneb üldiselt vaigust (50 protsenti ) , vaha (30 protsenti ), õlid (10 protsenti ), õietolm (5 protsenti ) ja täiendavad fenoolsed ühendid, nagu flavonoidid.5,6 Taruvaigu keemiline koostis on teadaolevalt keeruline ja varieerub vastavalt taru ümber kasvavatele taimeliikidele. , millest mesilased koguvad eksudaate.7 On aktsepteeritud, et mitmed tegurid, nagu piirkonna floristiline koostis, kogumise koht ja aeg, aastaaeg, koguja tüüp, kättesaadavus ja kõrgus merepinnast ning toiduaktiivsus, on aktsepteeritud. taruvaigu kasutamine avaldab mõju taruvaigu keemilisele koostisele.8,9 Taruvaiku on erinevat tüüpi, olenevalt tootmisgeograafilisest piirkonnast, botaanilisest allikast ja keemilisest koostisest. Kõige levinumad taruvaigutüübid on parasvöötme, kase-, troopilised, Vahemere ja Vaikse ookeani piirkonnad.10 Parasvöötme kliimavöönditest, nagu Euroopast, Põhja-Ameerikast või Aasia mittetroopilistest piirkondadest pärit taruvaik pärineb peamiselt Populus liikide pungade eksudaatidest ( Salicaceae) ning on seetõttu rikas flavonoidide ja fenoolhapete ning nende estrite poolest; troopiline taruvaik, mis pärineb piirkondadest, kus ei kasva pappel ega kask, on aga rikas p-kumaarhapete, bensofenoonide või terpenoidide prenüleeritud derivaatide poolest.11 Vaikse ookeani taruvaik, mis on tavaliselt rikas prenüleeritud flavanoonide poolest, on teine ​​oluline Taiwanis leiduv taruvaigu tüüp. , Jaapanis ja Saalomoni Saartel ning kase taruvaiku leidub just Venemaal.12 Troopilise Aasia taruvaigu uurimine on viinud Macaranga denarius L. ja Mangifera indica L. avastamiseni Indoneesia taruvaigu taimsete allikatena.13 Teisest küljest on Cupressaceae perekonda kuuluvad okaspuuliigid Vahemere piirkondades peamised taruvaigu botaanilised allikad.14 Keemilised analüüsid näitasid, et taruvaik sisaldab rohkem kui 300 erinevat looduslikku toodet (NP), sealhulgas fenoolhappe derivaate, kumariine, flavonoide, seskviterpene, diterpeene, triterpeenid, steroidid, lignaanid või prenüleeritud bensofenoonid.15 Taruvaigu bioloogilisi toimeid on kirjeldatud mitte ainult nende antioksüdantide,16–18 anti-AGE (st glükatsiooni arenenud lõpp-produkti [AGE] moodustumise pärssimise),19 antioksüdantide kohta. -põletikulised,20 ja kasvajavastased21–23, aga ka nende antibakteriaalsed,24–26 seenevastased,15 viirusevastased,27 ja parasiitidevastased28 toimed. Samuti on teada, et taruvaik stimuleerib antikehade tootmist, mis viitab selle potentsiaalsele kasutamisele vaktsiinide adjuvandina.29 Selle mitmekesise koostisega loodusliku aine laialdasem kasutamine ja seetõttu erinev bioloogiline aktiivsus farmaatsia-, kosmeetika- ja toiduainetööstuses äratab erilist huvi. teadusuuringutes, eriti mis puudutab selle keemilise koostise määratlemist. Enamik uuringuid on tehtud Euroopa19, 30–33 ja Ladina-Ameerika, täpsemalt Brasiilia 20, 23, 34–36 proovidega, samas kui Aafrikas on tehtud vähe uuringuid.37–41 Teavet Benini ja Kongo taruvaigu kohta42 on vähe.

Seega oli selle uuringu eesmärk iseloomustada Benini ja Kongo (Aafrika) erinevatest fütogeograafilistest tsoonidest kogutud taruvaigu proovide peamisi ühendeid, kasutades 13C tuumamagnetresonantsi (NMR) dereplikatsiooni MixONati tarkvaraga.43,44 Esialgne uuring andmebaasi (DB) abil, mis sisaldab Varem taruvaigu kohta teatatud NP-d koos nende 13C ennustatud keemiliste nihketega (δC) ei andnud mingeid kasutatavaid andmeid võrreldes rahuldavate tulemustega, mis tavaliselt saadakse taimeekstraktidega.43–45 Seda võib seletada taruvaigu keemilise koostisega, mis on suuresti sõltuv. kohalikule taimestikule, muutes kemotaksonoomilise DB konstrueerimise võimatuks. Seega teostasime Benini ja Kongo taruvaigu peamiste ühendite dešifreerimiseks käesolevas töös kõrgjõudlusega vedelikkromatograafiat koos ultraviolettkiirguse ja aurustuva valguse hajumise tuvastamise massispektromeetriaga (HPLC-UV-ELSD-MS) ja gaasikromatograafiat koos massispektromeetriaga ( GC-MS) analüüsib taruvaigu toorekstrakte, et tuvastada nende peamised struktuuriomadused ja luua MixONati tarkvara jaoks sobivad NP-de vastavad DB-d.46 Seejärel võimaldas pärast nende keemilise profiili järgi valitud taruvaigu proovide jämedat fraktsioneerimist 13C NMR-põhine dereplikatsioon. peamiste NP-de tuvastamine ilma täiendava puhastamiseta. Samuti viidi läbi antioksüdantide ja anti-AGE testid.

2. KATSEMEETODID

2.1 Kemikaalid

1,1-difenüül-2-pikrüülhüdrasüül (DPPH), Folin-Ciocalteu reaktiiv, sipelghape ja gallushape, kõik analüütilise kvaliteediga, osteti ettevõttelt Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier, Prantsusmaa). 6-Hüdroksü-2, - 5,7,8-tetrametüülkromaan-2-karboksüülhape (Trolox®) ja 50 - kofeoüülkiinhape (klorogeenhape) saadud firmalt Acros Organics (Geel, Belgia).

2.2 Taruvaigu proovid

Kaheksa Benine taruvaigu proovi koguti kolmes fütogeograafilises tsoonis mesitarudest kraapides (tabel 1 ja joonis SI-1). Kongo taruvaigu proov koguti Kongo Vabariigi kesklinnas Bateke platool asuvast akaatsiapuude tehismetsast (tabel 1).

2.3 Taruvaigu ekstraheerimine

Taruvaigu etanooliekstraktid (EEP-d) valmistati algselt järgmise ekstraheerimisprotokolli abil.19 Toores taruvaik pulbristati esmalt homogeenselt vedela lämmastiku juuresolekul. Kõigi proovide puhul leotati 1 g taruvaigu pulbrit 20 ml 95-protsendilises EtOH-s. Pärast 2-tunnist segamist toatemperatuuril filtriti segu, kasutades paagutatud klaasist ketaslehterfiltrit (poori suurus 16–40 μm). Jääk ekstraheeriti kaks korda uuesti, kasutades samu samme. Seejärel hoiti kolme kogutud filtraati öö läbi temperatuuril 18 C, filtreeriti vahade eemaldamiseks ja aurustati alandatud rõhul (40 C, 10 baari), et saada EEP-d.

8.0 g taruvaigu pulbrit BC1 (1) ja BC2 (2) või 10,3 g CG-d (3) ekstraheeriti uuesti 95% EtOH-ga (AÜE, 4 x 80 ml, 15 min). kiirkromatograafia.

2.4 Üldfenoolisisalduse määramine

Fenooli kogusisaldus määrati eelnevalt kirjeldatud Folin-Ciocalteu kolorimeetrilise meetodi abil 19 ja kohandati hiljuti otseseks kasutamiseks mikroplaatidel. Lühidalt, 10 ul igat taruvaigu ekstrakti MeOH-s (3,5 mg/ml BC1, 5 mg/ml BN2, BC2 ja CG jaoks, 7,5 mg/ml BN1, BS1a, BS1b ja BS2 puhul ja 10 mg/ml BS3 jaoks) segati 20 ul destilleeritud vee ja 10 ul Folin-Ciocalteu reagendiga 96-süvendiga mikroplaadil. 3 minuti pärast lisati 120 ul destilleeritud vett ja 40 ul 20% naatriumkarbonaadi vesilahust. Neeldumist mõõdeti TECAN® mikroplaadi spektrofotomeetriga (V6.5) lainepikkusel 760 nm pärast 30 minutit pimedas toatemperatuuril. Pimekatse valmistati samal viisil, kasutades ekstraktilahuse asemel MeOH-d ja kalibreerimiskõvera arvutamiseks kasutati gallushapet (0,04–0,328 mg/ml; y=2,7241x 0,0039; r2=0 .9982). Iga proovi analüüsiti kolmes eksemplaris. Fenooli üldsisaldus väljendati gallushappe ekvivalentidena (mg) ekstrakti grammi kohta (mg GAE/g).

2.5 Esialgsed kromatograafilised analüüsid

2.5.1 Analüütiline TLC

Analüütiline õhukese kihi kromatograafia (TLC) viidi läbi TLC-ga Alugram Xtra SIL G/UV254 (Macherey-Nagel, Düren, Saksamaa), kasutades eluendina tsükloheksaani:AcOEt segu. Kromatogrammi laigud visualiseeriti esmalt UV-valguses (254 nm) ja seejärel pihustades vanilliini-väävelhappe reagendiga (2 ml kontsentreeritud väävelhapet 98 ml 1:99 massi/maht vanilliini:95% etanooli lahuses) ja kromatogramme kuumutatakse 110 °C juures 5 minutit.

2.5.2 GC-MS protseduur

GC-MS analüüs viidi läbi derivatiseerimata proovidega, kasutades Shimadzu gaasikromatograafi GCMS-QP2010 SE (Noisiel, Prantsusmaa) ionisatsioonipingega 70 eV (elektrooniline). mõju). Proovid valmistati diklorometaanis (DCM) 2 mg/ml ekstraktide ja 1 mg/ml fraktsioonide jaoks. Eraldamised viidi läbi Phenomenex ZB5 kolonniga (30 m * 0,250 mm siseläbimõõt 0,25 mm kilepaksusega; Phenomenex, Le Pecq, Prantsusmaa). Temperatuur programmeeriti järgmiselt: 180 kraadi C (3 min), 180–280 kraadi C kiirusega 10 C/min ja 280 kraadi C (27 min). Heeliumi kasutati kandegaasina voolukiirusel 2,0 ml/min. Injektori ja detektori temperatuurid määrati vastavalt 250 °C ja 280 °C. Metaboliidid tuvastati, võrreldes nende retentsiooniaegu (Rt), nimimassi ja/või killustumismustreid autentsete proovide omadega ja/või nendega, mis sisalduvad seadmete fragmentatsioonimustrite teekides (NIST11, NIST11s ja FFNSC2).

2.5.3 HPLC-DAD-ELSD protseduur

Kromatograafilised analüüsid viidi läbi Shimadzu 2030C 3D vedelikkromatograafiga (Noisiel, Prantsusmaa), mis oli varustatud dioodide massiiviga.detektor (DAD) ja ELSD (Sedere®) koos Lichrospher® kolonniga 1{{10}}0 RP-18 (125 mm * 4 mm id, 5 μm, Merck, Darmstadt, Saksamaa ) kaitstud Lichrocart® 4–4 kaitsekassetiga (4 mm*4 mm sisekülg), kasutades voolukiirust 1 ml/min. Liikuv faas koosnes 0,1 protsendilisest sipelghappest vees (lahusti A) ja metanoolist (lahusti B) ning eraldamine viidi läbi järgmise lineaarse gradiendiga: 25–100 protsenti B (0–40 min), 100 protsenti (40–45). min). UV-vis spektrid registreeriti vahemikus 190–600 nm ja kromatogrammid saadi 254 ja 280 nm juures. ELSD-d kuumutati 30 kraadinikraadiC ja signaalile rakendati võimendust 4. Proovid valmistati ette kontsentratsiooniga 10 mg/ml MeOH-s ja tsentrifuugiti 13,000 g juures 10 minutit enne süstimist (10 ul), et eemaldada suspendeeritud materjali jäljed.

2.5.4 HPLC-UV-MS protseduur

HPLC-UV-MS analüüsid viidi läbi, kasutades 2795 Watersi eraldusmoodulit (Guyancourt, Prantsusmaa), mis oli varustatud Dual λ 2487 Waters detektoriga. Kolonn, liikuvad faasid ja gradient olid samad, mida on kirjeldatud ülal HPLC-DAD-ELSD puhul. Kromatogrammid saadi 254 ja 28{16}} nm juures. Massianalüüsid viidi läbi Brukeri (Bremen, Saksamaa) elektropihustusionisatsiooni/atmosfäärirõhu keemilise ionisatsiooni (ESI/APCI) Ion Trap Esquire 3000 pluss nii positiivses kui ka negatiivses režiimis järgmiselt: kokkupõrkegaas, He; kokkupõrkeenergia amplituud, 1,3 V; nebulisaator ja kuivatusgaas, N2, 7 L/min; nebulisaatori gaasi rõhk, 30 psi; kuivatustemperatuur, 340 C; voolukiirus, 1,0 ml/min; lahusti jaotussuhe, 1:9; skaneerimisvahemik, m/z 100–1, 000. Proovid valmistati ette kontsentratsiooniga 10 mg/ml MeOH-s, tsentrifuugiti 13 000 g juures 10 minutit ja filtreeriti enne süstimist (20 ul) läbi 045- μm polütetrafluoroetüleenist (PTFE) membraaniga süstalfiltri, et eemaldada jäljed. rippuvatest materjalidest.

2.6 EEP fraktsioneerimine kiirkromatograafiaga

Esiteks lahustati 3,8 g BC1 (1), 3,5 g BC2 (2) või 4.0 g CG (3) EEP-d minimaalses koguses DCM-is ja atsetoonis ning segati silikageeliga (ränidioksiid). geel: ekstrakti suhe, 2:1). Kõigi nende puhul lasti lahustil aurustuda, kuni saadi peen kuiv pulber. Seejärel viidi iga EEP jaoks läbi fraktsioneerimine, kasutades CombiFlash Teledyne ISCO aparaati (Lincoln, NE, USA) silikageelikolonniga (Chromabond® Flash RS 4{{20}} SiOH, 4{{83}). } g, Macherey-Nagel, Hoerdt, Prantsusmaa) voolukiirusel 25 ml/min tsükloheksaani (lahusti A) ja etüülatsetaadiga (EtOAc) (lahusti B), kasutades järgmist gradientelueerimist: (1) BC1 EEP jaoks, 5 protsenti B (0–10 min), 5–20 protsenti B (10–30 min), 20–30 protsenti B (30–60 min), 30–50 protsenti B (60–85 min) ja 50–100 protsenti B (85–110 min); Koguti 160 20 ml katsutit ja ühendati 14 fraktsiooniks (BC1_F1 kuni BC1_F14) nende TLC kromatograafiliste profiilide alusel (tsükloheksaani:EtOAc suhe, 90:10 kuni 50:50). ); (2) BC2 EEP puhul 5 protsenti B (0–10 min), 5–10 protsenti B (10–20 min), 10–30 protsenti B (20–40 min), 30–40 protsenti B (40–55 min) ja 40–100 protsenti B (55–70 min); Koguti 100 20 ml katsutit ja ühendati 8 fraktsiooniks (BC2_F1 kuni BC2_F8) nende TLC kromatograafiliste profiilide alusel (tsükloheksaani:EtOAc suhe, 90:10 kuni 60:40). ); (3) CG EEP puhul 5 protsenti B (0–10 min), 5–10 protsenti B (10–30 min), 10–20 protsenti B (30–50 min), 20–40 protsenti B (50–70 min), 40–60 protsenti B (70–80 min) ja 60–100 protsenti B (80–90 min); Koguti 135 20 ml katsutit ja ühendati 23 fraktsiooniks (CG_F1 kuni CG_F23) nende TLC kromatograafiliste profiilide alusel (tsükloheksaani:EtOAc suhe, 80:20 kuni 60:40). ).

BC{{0}}F7 fraktsiooniga viidi läbi täiendav fraktsioneerimisetapp: 200 mg lahustati minimaalses mahus MeOH-s ja segati C18-silikageeliga (C18-ränidioksiid). geel: ekstrakti suhe, 2:1). Eraldamine viidi läbi C18 kolonnis (Interchim® PF-C18HP, 4 g, Montluçon, Prantsusmaa) voolukiirusel 15 ml/min vee (lahusti A) ja MeOH (lahusti B) abil, kasutades järgmist gradientelueerimist: 50– 70 protsenti B (0–30 min) ja 70–100 protsenti B (30–40 min); Koguti 80 8 ml tuubi ja ühendati nende HPLC-UV (280 nm) profiilide põhjal 5 fraktsiooniks (BC2_F7-1 kuni BC2_F7-5). .

2.{1}} H ja 13C NMR analüüsid

Taruvaigu fraktsioonide (7–58 mg) või mõnikord NP-de TMR-spektrid (1D ja 2D) registreeriti deutereeritud kloroformis (CDCl3) või deutereeritud metanoolis (CD3OD) (500 ul) JEOL NMR-spektromeetril sagedusel 400 MHz 1 H ja 100 MHz 13C jaoks. TMR katsed (1H NMR, 13C NMR, DEPT-135, DEPT-90 ja 2D NMR) fraktsioonide ja puhaste NP-dega viidi läbi 298 K juures JEOL 400 MHz H spektromeetril (JEOL Europe, Croissy). -sur-Seine, Prantsusmaa), mis on varustatud pöördvõrdelise 5-mm sondiga (ROYAL RO5). Keemilised nihked (δH ja δC) on väljendatud ppm-des ja J väärtused Hz-des.

13C NMR (100 MHz) spektrite jaoks kasutati WALTZ-16 lahtisidumise järjestust, mille kogumisaeg oli 1,04 s (32 768 kompleksset andmepunkti) ja relaksatsiooniviivitus 2 s. Rahuldava S/N suhte saamiseks koguti 000 skaneeringut 1500–11. Enne Fourier' teisendust rakendati igale vabale induktsioonile (FID) 1 Hz eksponentsiaalset joont laiendavat filtrit. Spektrid faasiti käsitsi ja korrigeeriti baasjoont kasutades MestReNova tarkvara (Mestrelab Research, Santiago de Compostela, Hispaania) ning viidati deutereeritud lahusti keskresonantsile δC 77,16 ppm (CDCl3) ja δC 49,00 ppm (CD3OD) juures. Polarisatsiooniülekande (DEPT) katsete moonutusteta täiustamiseks oli vaja 512–5500 skaneerimist ja joondused 13C spektritega tehti antud δC abil. Seejärel kasutati minimaalset intensiivsuse läve, et käsitsi koguda positiivseid 13C NMR ja DEPT-90 signaale ning positiivseid ja negatiivseid DEPT-135 signaale, vältides samal ajal võimalikke müraartefakte.

Taruvaik DB1 loodi esmalt, otsides SciFindernis taruvaikus kirjeldatud ühendeid, 47 mille tulemuseks oli DB 1471 NP-d; δC väärtused ennustati Advanced Chemistry Development (ACD) NMR ennustajate (C, H) abil. Sellistest DB-dest, mis sisaldasid NP-sid koos nende δC-SDF väärtustega, lõi MixONatis sisalduv rutiin CTypeGen sobiva andmebaasi: see luges ruumiandmete faili (SDF) ja sorteeris keemilised nihked süsiniku tüübi järgi. Seejärel loodi vajalik c-tüüpi SDF, st c-tüüpi Propolis DB1.43,44

Loodi stilbenoidid_fenantrenoidid DB2. Ainete otsimine, kasutades märksõnu stilbenoidid ja fenantreenid 276 518 NP-d48 sisaldavas LOTUS DB-s (LOTUS, 2022), võimaldas SDF-ina saada 2681 NP-st koosneva stilbenoidide _fenantrenoidide DB2. Seejärel loodi Flavanones DB3: SciFindern47 otsing, kasutades 2-fenüülkromaan-4-üks alamstruktuuri, võimaldas valida 56 679 molekuli hulgast. Neid vähendati veelgi 2893-ni, viidates "looduslike toodete esinemisele", kasutades ainete analüüsi SciFinderni pakutud filtriga "Reference roll". Pärast täiendavat rafineerimist filtreerimisetapiga, mis põhines eeldataval molekulmassil (MW) (st 340 kuni 424 Da), eksporditi kõik asjakohased flavanoonid seejärel SDF-ina, et saada NP-d Flavanones DB3-st (684 NP-d). Iga DB2 ja DB3 NP jaoks ennustati δC-SDF väärtused ACD NMR ennustajate (C, H) tarkvara ja Nuzillard46 poolt eelnevalt kirjeldatud metoodika abil, et saada c-tüüpi SDF otse MixONati kasutamiseks valmis. Viimane sisaldab iga DB ühendi jaoks ennustatud δC väärtusi, mis on organiseeritud metüüli, metüleeni, metiini või kvaternaarsete süsinikidena.

Triterpeenid DB4 ehitati PNMRNP3 DB49,50-st, mis imporditi SDF-ina ACD NMR ennustajate (C, H) tarkvaras, otsides triterpeene, mille MW on vahemikus 100 kuni 500 Da (st otsinguandmed: triterpeenid; otsingu MW: 100 kuni 500) et saada otse 6623 triterpeenist koosnev DB nõutavas c-tüüpi failivormingus.

Alk(en)üülresortsinool ja fenooli derivaadid DB5 ehitati PNMRNP3-st DB49,50, mis imporditi SDF-ina ACD NMR ennustajate (C, H) tarkvaras, otsides NP-sid m-alk(en)üülfenooli karkassiga ja klassifitseeriti fenoolideks. (st 3-(heksadec-8-en-1-üül)fenool Alamstruktuuri otsing; Otsi Classyfire'i klass: fenool), et saada otse 44 NP-st koosnev DB nõutavas c-tüüpi failivormingus.

2.{1}}C-NMR-põhine replikatsioon MixONati tarkvara abil

Igast katsespektrist (13C NMR, DEPT-135 ja DEPT-90) saadud piikide loend ja intensiivsuse andmed eksporditi kui . csv-faili, kasutades Microsoft Exceli (Microsoft 16.45) tarkvara ja mida kasutatakse sisendfailina MixONati tarkvaras. Sellised failid koosnevad δC väärtuste loendist, mis on järjestatud kahanevas järjekorras, mis on seotud nende intensiivsusega samal real, eraldatuna komaga.

Data were then processed using MixONat, which exploits any dataset that provides molecular structures in the previously described SDF (i.e., c-type DB1–5 file format). Based on this information, MixONat was used to compare the experimental δC values of the fractions to the predicted δC-SDF values from the DB and made suggestions for specific NPs potentially present in the analyzed sample. In the end, MixONat provided NP proposals with scores ranging from 0 to 1, i.e., from 0% to 100% (where 1 corresponds to a perfect match and 0 indicates no similarity for a given compound from the used DB). Acceptable values for putative identification were >0.70. Seejärel võrreldi parimate tulemustega NP-de eksperimentaalseid andmeid kirjandusega.

2.9 Puhastamine

2.9.1 Preparatiivne HPLC

Fraktsioonid BC{{0}}F6 ja BC1_F8 (40 mg 2 ml MeOH-s) puhastati Shimadzu LC-20AP preparatiivse seadmega. vedelikkromatograaf, mis on varustatud UV-viskedetektoriga SPD-40 (Noisiel, Prantsusmaa), 2 ml süstimissilmuse ja fraktsioonikollektoriga FRC-10A, kasutades preparatiivset kolonni C18 (25{{39). }} mm 21,2 mm id, 5 μm) (Pursuit XRs 5, Agilent, Les Ulis, Prantsusmaa) voolukiirusel 21,24 ml/min. Liikuv faas koosnes 0,1 protsendilisest sipelghappest vees (lahusti A) ja metanoolist (lahusti B) ning eraldamisel kasutati järgmist gradienti: (1) BC1_F6 puhul 40 protsenti B (0–5) min), 40–70 protsenti B (5–20 min) ja 70–90 protsenti (20–30 min); (2) BC1_F8 puhul 40–70 protsenti B (0–15 min) ja 70–90 protsenti (15-25 min). Kromatogrammid saadi 254 ja 280 nm juures.

2.9.2 Tahkefaasi ekstraheerimine (SPE)

BC2-EPP kõige polaarsema fraktsiooni saamiseks (200 mg 5 ml MeOH-s segatuna 350 mg C18--silikageeliga pärast aurustamist) viidi läbi puhastamine, kasutades C18 tahke faasi ekstraheerimiskolonni. (2 g/15 ml, Thermo Scientific™, Villebon-sur-Yvette, Prantsusmaa) veega: MeOH 7:3 (10 ml) ja vesi: MeOH 6:4 (10 ml). Torud 4–10 ühendati, et moodustada nende HPLC-UV (330 nm) profiilide põhjal BC2 (BC2_SPE) polaarne fraktsioon.

2.10 Antioksüdantide ja anti-AGE testid

2.10.1 DPPH-radikaalide eemaldamine

Benini EEP-de DPPH-radikaalide eemaldamise hindamine viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud.51 Lühidalt öeldes lahjendati testitud proove absoluutses EtOH-s temperatuuril 0.02 mg/ml 1 mg/ml põhilahustest dimetüülsulfoksiidis. (DMSO). Nende lahjendatud lahuste alikvoodid (100 ul) asetati kolmes eksemplaris 96-süvendiga plaatidele. Umbes 25 ul värskelt valmistatud DPPH lahust (1 mM) lisati 75 ul absoluutsele EtOH-le, kasutades mikroplaadilugeja injektorit (Infinite® 200, Tecan, Prantsusmaa), et saada lõppmahuks 200 ul süvendi kohta. Pärast 30 minutit pimedas toatemperatuuril määrati neeldumine 517 nm juures. EtOH-d kasutati pimekatsena, samas kui kalibreerimiskõvera jaoks kasutati Troloxi (hüdrofiilse tokoferooli analoogi) 10, 25, 50 ja 75 µM lahuseid. Kvaliteedikontrolli standardina kasutati klorogeenhappe etanoolilahuse proovi (0,02 mg/ml). Tulemused väljendati Troloxi ekvivalentidena (mikromoolid TE-d ühe grammi ekstrakti kohta).

2.10.2 Anti-AGE test

Taruvaigu ekstraktide ja viie peamise eraldatud naringeniini derivaadi mõju AGE moodustumisele määrati nii, nagu eelnevalt kirjeldatud.51 Lühidalt, veise seerumi albumiini (BSA) (10 mg/ml) inkubeeriti D-riboosiga ({{). 13}},5 M) koos testitava ühendiga (3 µM kuni 3 mM) või ekstraktiga (1 ug kuni 1 mg) 50 mM fosfaatpuhvris pH väärtusel 7,4 (NaN3, 0,02 protsenti). Enne AGE fluorestsentsi mõõtmist inkubeeriti lahuseid 96-süvendiga mikrotiiterplaatidel temperatuuril 37 °C 24 tundi suletud süsteemis. Iga mõõtmise jaoks lahutati fluorestsents inkubeeritud proovist identsetes tingimustes ilma D-riboosita. Pentosidiinitaoline (ergastus lainepikkusel 335 nm, emissioon 385 nm juures) AGE fluorestsentsi mõõdeti fluoromeetriaga.52 IC50 väärtused määratleti kui ekstrakti (ug/ml) või positiivse kontrolli (μM) kogus, mis on vajalik AGE moodustumise vähendamiseks 50 protsenti. negatiivse kontrolli suhtes. Statistilise valideerimisanalüüsi53 kohaselt piisab IC50 täpseks määramiseks ühest analüüsist.

3. TULEMUSED JA ARUTELU

3.1 Kromatograafiline profileerimine

Kaheksa Benini ja Kongo EPP üldine LC-profiil, kasutades kvaasiuniversaalset ELSD-detektorit, näitas, et kõik proovid sisaldasid mittepolaarseid ühendeid, mis elueeriti kromatogrammide lõpus (joonis 1). BC1 esitles ka suures koguses polaarsemaid ühendeid ja BC2 näitas mõningaid keskmise polaarseid ühendeid väiksemates kogustes. CG EEP mittepolaarsed ühendid tundusid olevat üsna erinevad benini omadest.

Seega viis ELSD-profiilide koostamine kolm erinevat ja originaalset proovi, mille koostist uuriti täiendavalt: BC1, BC2 ja CG.

Esiteks viidi läbi GC-MS analüüsid, milles võrreldi MS killustatust NIST DB-ga, et iseloomustada keemilisi klasse ja võimalusel tuvastada koostisosi. Oletatav identifitseerimine (vastavuse protsendi alusel NIST DB-ga) ja ühendite keemilised klassid on esitatud tabelis 2 (GC – kogu ioonvoolu [TIC] profiilide andmed on näidatud joonisel SI-2).

Kõik Benini EEP-d esitasid samasuguseid mittepolaarsete ühendite profiile, mis on märgistatud tähtedega A kuni F, kuid nende kogused võivad erineda. Need identifitseeriti kui - või -amrinoon (A), -amüriin (B), lupenoon (C), -amüriin (D), - või -amüriinatsetaat (E) ja lupeoolatsetaat (F) (vt joonis SI). -3), mida on juba kirjeldatud kui peamisi NP-sid Mehhiko taruvaikus.54 Zhang et al. (2014) ja Tamfu jt. (2020) kirjeldasid triterpenoide ka amüriini/lupeooli ja amüriini/lupeoolatsetaatidena erinevates Aafrika taruvaigu proovides.41,55 Ainult BC1 esitas täiendavaid NP-sid, mis elueeriti Rt 10 ja 15 minuti vahel, mida soovitati nende killustumise mustri järgi metoksüülitud stilbenoididena või fenantreenidena. Kongo EEP profiil erines Beniini omadest: C16 ja C18 happe etüülestrid olid lenduvamad ühendid, mis olid seotud hea sobivusega 94 protsenti, fenooli derivaat Rt juures 13,1 min, kolm resortsinooli derivaati vahemikus 14–14. 17 min ja erinevat tüüpi triterpeeni derivaadid pärast Rt 21 min.

Lisaks analüüsiti EPP-sid HPLC-DAD-MS abil, et visualiseerida mittelenduvaid NP-sid (vt joonis SI-4). Erinevad profiilid näitasid, et BC1 EEP-l oli suur hulk keskmise polaarseid ühendeid, mille kromofoorid neelasid lainepikkusel 280 nm, samuti BC2 väiksemates osades, ja CG-l oli 280 nm juures väga halb UV-profiil.

3.2 BC1 ja BC2 keemiline koostis

Nende peamiste NP-de tuvastamiseks, kasutades MixONatil ja sobivatel DB-del põhinevat 13C NMR dereplikatsiooni, saavutati seejärel kiirkromatograafia abil BC1 ja BC2 EEP jäme fraktsioneerimine. Tõepoolest, BC1 puhul näitas GC-MS analüüs metoksüülitud stilbenoidide või fenantreenide olemasolu, mis ajendasid meid looma spetsiifilisi stilbenoide _fenantrenoidid DB2. BC2 puhul, välja arvatud polaarsemad ühendid Rt 3,8 minuti juures, näitasid kõik ühendid flavanoonide-dihüdroflavonoolide UV-spektreid, mis viitas Flavanones DB3 loomisele.

Nagu on kujutatud tabelis 3, soovitas MixONat BC1 EEP-s dihüdrofenantreene 1 ja 3–5, fenantreene 2 ja 6 ning dihüdro stilbeeni 7 (joonis 2) ja kinnitas need kirjanduse andmetega võrreldes (vt toetavat teavet). Vajadusel kasutati HPLC-MS andmetel põhinevat MW filtrit.

Täpsemalt soovitas MixONat 9,10-dihüdrofenantreeni derivaadi hulgast DB2 2681 NP-st 6-metoksükoeloniini (2,7-dihüdroksü-3, 5-dimetoksü{ {10}}, dihüdrofenantreen; 3, 1. koht, skoor 0,75, joonised SI-13 ja SI-14) eKr{{ 18}}F5 ja selle olemasolu kinnitati avaldatud NMR andmetega võrreldes. Seda on veel tuvastatud Combretaceae liikidest56 ja orhidees Bulbophyllum vaginatum; 57 ja 2, 7-dihüdroksü-3,4,6-trimetoksü- 9,10-dihüdrofenantreen (4, 1. järg, skoor 0,88, joonised SI{{33 }} ja SI-16) oletati BC1_F2-s. Ühendit 4 on juba kirjeldatud Senegali taruvaikus58 ja selle olemasolu kinnitati Pettiti jt esitatud andmete põhjal. Aafrika puult Combretum caffrum59 ja Lu et al. Dioscorea nipponica Makino.60

13C NMR-põhine dereplikatsiooniprotsess ennustas ka 2,6-dihüdroksü-3,4,7-trimetoksü-9,10-dihüdrofenantreeni (5, 8. punkt, skoor 0.76, joonised SI-15 ja SI-16) BC1_F2 ja 2,6,7-trihüdroksü{{20 }}, 4-dimetoksü-9, 10-dihüdrofenantreen (1, 2. järg, skoor 0,5, joonised SI-5 ja SI-6 ) BC{{30}}F6-1, kui kasutati molekulaarfiltrit MW 288 Da. 1 puhul oli tulemus üsna madal (0,5); seetõttu viidi läbi täiendavad 2D NMR-katsed (heterotuumalised mitmikkvantkorrelatsioonid [HMQC], heteronukleaarne mitmiksidemeühendus [HMBC], tuuma Overhauseri efekti spektroskoopia [NOESY], vt joonised SI-7–SI-10). teostatakse struktuuri kinnitamiseks; 5 puhul oli skoor 0,76, st kõrgem kui 0,70. Neid kahte NP-d (1 ja 5) mainisid esmakordselt Letcher et al. Combretum liikides61,62 ja 1 on juba leitud Senegali taruvaikust.58

Fenantreeni derivaatide hulgas oletas MixONat 2,6, 7-trihüdroksü-3, 4-dimetoksüfenantreeni (2, 1. positsioon, skoor 0,88, joonised SI-11 ja SI{{10}}) BC1_F8-1-s, mida kinnitas võrdlus selle spektriandmetega, mida kirjeldasid Letcher et al. aastal Combretum apiculatum. 61 2,7-Dihüdroksü-3,4,6-trimetoksüfenantreen (6, 5. koht, skoor 0,94, joonised SI-17 ja SI-18) varem eraldatud Photolida Chinensis63-st soovitati eKr1_F4.

Kombretastatiin B{{0}} (7), dihüdro stilbeen, soovitas MixONat BC1 EPP kasutamisel esimesel kohal (skoor 1,0, joonised SI-17 ja SI-19). MW filter (MW 304 Da) ja valideeritud võrreldes Pettit et al. kirjeldatud NMR andmetega. aastal Combretum caffrum. 59

Ühendid 2, 6 ja 7 on Senegali taruvaigus juba tuvastatud.58

1H ja 13C NMR andmed 1–7 on saadaval lisateabes.

BC2 puhul tuvastati seitse ühendit, mis kuuluvad kahte polüfenoolide struktuuriklassi, kromoon-C-glükosiidi ja prenüülflavanooni derivaate (8–14), millest mõnda kirjeldati esimest korda taruvaigus (joonis 3).

13C NMR-põhine protsess, milles kasutati MixONati ja DB1 kuni DB5, ei andnud asjakohaseid tulemusi, mis viitaksid originaalsetele NP-dele. Kaks peamist toodet (8–9) iseloomustati täielikult seguna, kasutades massispektreid ning 1D ja 2D NMR andmeid (1H, 13C, HMQC, HMBC, vt joonis SI-20–SI-23) ja identifitseeritakse kui floriin (8) ja isobifloriin (9), kaks kromanoon-Cglükosiidi, mida on äsja kirjeldatud taruvaikus, mida on varem kirjeldatud vastavalt Pancratium biflorum64 ja Eugenia caryophyllata nelk.65

Mis puudutab flavanooni derivaate, siis 688 NP-st DB3-s pakkus MixONat välja 6-prenüülnaringeniini (10, 1. koht, skoor 0,95, joonised SI- 24 ja SI{{8 }}) on juba kirjeldatud Nigeeria punases taruvaigus66 eKr{{10}}F7-1. 6,8-Diprenüüllaromadendriin (12, paremusjärjestus 1, skoor 1.0, joonised SI-28 ja SI-29) ja 6, 8-diprenüülnaringeniin (lonhokarpol A ) (13, järjestus 10, skoor 0,84, joonised SI-30 ja SI-31), mida varem leiti Kameruni taruvaigu proovidest,42 valideeriti eKr2_F{ {30}} ja BC2_F5 vastavalt. 6-Geranüülnaringeniin (14, paremusjärjestus 1, skoor 0,84, joonised SI-32 ja SI-33), mida on varem kirjeldatud Saalomoni Saarte taruvaigus,67 püstitati ja kinnitati aastal eKr{{41 }}F7-5. Lõpuks soovitas MixONat BC2_F6-s 6-dimetüülallüülnaringeniini (11) teisele positsioonile (2. koht, skoor 0,65, joonised SI-26 ja SI- 27). Esimesel positsioonil pakuti välja 8. positsiooni isomeer, kuid võrdlus kirjanduse andmetega 68,69 näitas, et see on positsioonis 6 olev isomeer. Ühend 11 oli taruvaikus uus, kuid seda on juba kirjeldatud Monotes africanuse orgaanilistes ekstraktides. 70 1 H ja 13C NMR andmed 8–14 on saadaval toetavas teabes.

【Lisateabe saamiseks: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】