UPLC-Q-TOF-MSE töötlemata ja töödeldud Cistanche Deserticola keemiliste omaduste ja metaboliitide uuring rottidel

Kontakte-posti aadresstina.xiang@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Abstraktne

Taust: Hiina materia medica töötlemine on traditsioonilises hiina meditsiinis (TCM) silmapaistev ja ainulaadne farmaatsiatehnika, mida kasutatakse kõrvaltoimete vähendamiseks ja toorürtide terapeutilise efektiivsuse suurendamiseks või isegi muutmiseks. Ravimtaimede efektiivsuse suurenemise eest vastutavad eelkõige optimeeritud töötlemisprotseduurist põhjustatud muutused olulistes komponentides. Aurutatud riisiveini neeru-yangi kosutav toimeCistanche deserticola(C.deserticola) oli tugevam kui toores C.deserticola (CD).

meetodid: Töötlemise mõju määramiseks viidi läbi võrdlusanalüüs, kasutades UPLC-Q-TOF-MS'i koos UNIFl-i informaatikaplatvormiga. Koostisosade iseloomustamiseks viidi läbi ka in vitro uuringudmetaboliididin vivo. Keemilised komponendid määrati CD-s ja selle töödeldud toodetes. Mitme muutujaga statistilised analüüsid viidi läbi nende vaheliste erinevuste hindamiseks, samas kui paaripõhiseks võrdlemiseks kasutati OPLS-DA-d.

Tulemused: Selle uuringu tulemused näitasid fenüületanoidglükosiidide (PhG) jairidoididpärast töötlemist. CD ja selle töödeldud toote ekstraktides tuvastati kokku 97 ühendit. PhG-d, mille 4-O-kofeoüülrühm on 8-O- -D-glükopüranosüüli osas, nagu akteosiid, tsistanosiid C, kampneosiid Il, osmantusiid, vähenesid pärast töötlemist, samas kui PhG-d, millel on 6' -O-kofeoüülrühm 8-O- -D-glükopüranosüüli osas, nagu isoatsetosiid, isotsistanosiid C, isokampneosiid l, isomartynosiid, suurenes, eriti CD-NP rühmas. Suurenes ka ehhinakosiidi ja tsistanosiidi B intensiivsus, mille struktuur sisaldab 6'-O- -D-glükopüranosüülrühma. In vivo uuringus tuvastati roti plasmas, väljaheites ja uriinis 10 prototüübi komponenti ja 44 metaboliiti. Saadud tulemused näitasid, et töötlemine põhjustab CD keemiliste koostisosade märkimisväärset varieerumist ja mõjutab ühendite paiknemist in vivo ning faasi Ⅱ metaboolsed protsessid on iga ühendi võtmekaskaadid ning enamik metaboliite on seotud ehhinakosiidi või akteosiid.

Järeldused: See on esimene ülemaailmne töötlemata ja töödeldud CD võrdlusuuring. Need leiud täiendavad meie arusaamist CD töötlemise mõjust ja annavad olulisi andmeid tulevaste tõhususe uuringute jaoks.

Märksõnad: Cistanche deserticola, töötlemine, UPLC-Q-TOF-MS5, keemilised profiilid, in vivo metaboliidid

Sissejuhatus

Hiina materia medica (CMM) töötlemine on näidanud märkimisväärset rakendatavust traditsioonilise hiina meditsiini (TCM) kliinilises praktikas ja seda on peetud elujõuliseks raviks mitu sajandit. See on ainulaadne farmaatsiatehnoloogia, mis on tuletatud TCM-i teooriast. Pärast töötlemist on tuvastatud olulisi erinevusi igat tüüpi TCM-ide välimuses, keemilistes koostisosades, omadustes ja meditsiinilises tähenduses, mistõttu võib eeldada, et töötlemine võib parandada TCM-i efektiivsust või vähendada TCM-i toksilisi mõjusid.

Sadu aastaid,Cistanche deserticola(hiina keeles Rou Cong Rong, CD) kasutatakse tavaliselt TCM-i kliinilises praktikas neerufunktsioonide täiendamiseks. See aitab ka soolestikku niisutada, mis viib soolte lõõgastamiseni [1].Cistanchesalvestati esmakordselt ShenNongBencaoJingis. Seda leidub tavaliselt kuivades ja poolkuivades elupaikades kogu Euraasias ja Põhja-Aafrikas, sealhulgas Iraanis, Hiinas, Indias ja Mongoolias [2]. CD töötlemine on läbi viidud riisi-veiniga normaalrõhul aurutamisega, mis on Hiina farmakopöas dokumenteeritud valmistamismeetod (hiina keeles Jiucongrong, edaspidi "CD-NP"). Ja CD-aurutamine riisi-veiniga kõrge rõhu all on tõhusam valmistamismeetod (edaspidi "CD-HP") [3, 4]. Mitmed uuringud on näidanud, et CD farmakoloogilised toimed erinevad selle töödeldud toodetest [5]. CD võib toniseerida neeru-yangi ja lõdvestada soolestikku, samas kui pärast riisi-veiniga aurutamist tugevneb neeru-yangi täiendav toime. Meie varasemas uuringus leiti, et CD-NP võib suurendada neerude toniseerimist ja toetada yangi ning leevendada soolte niisutamise ja roojamise mõju [6–8]. Kliinilises praktikas on töödeldud tooted kõige sagedamini kasutatav vorm.

Siiani on mitmed uuringud analüüsinud CD keemilisi komponente, millele järgnes enam kui 100 ühendi [9–11], näiteks fenüületanoolglükosiidide (PhG) eraldamine ja identifitseerimine,iridoidid, lignaanid ja oligosahhariidid kui selle peamised keemilised koostisosad. Samuti on teatatud, et PhG-del on palju farmakoloogilisi toimeid, sealhulgas immunomoduleeriv, neuroprotektiivne, hepatoprotektiivne, põletikuvastane, antioksüdatiivne jne.[12–14]. Iridoididel on põletikuvastane toime [15, 16]. Varasemad uuringud on samuti näidanud, et mõned keemilised komponendid varieerusid töötlemise ajal [17–20]. Nende aruannete põhjal võib eeldada, et pärast töötlemist põhjustavad keemilise koostise kõikumised mitmesuguseid farmakoloogilisi toimeid, mida tuleb täiendavalt uurida.

Käesolevas uuringus viidi võrdlevaks analüüsiks läbi tundlik ja tõhus meetod, st ülikõrgefektiivse vedelikkromatograafia koos TOF-MSE-ga (UPLC-Q-TOF-MSE) ning ekstraktide kvalitatiivseks analüüsimiseks viidi läbi in vitro uuringud. CD, CD-NP ja CD-HP, et selgitada nende keemilisi profiile. Üldjuhul peeti tõhusateks komponentideks eksogeenseid kemikaale, millel on suur kokkupuude sihtorganitega. Seetõttu manustati rottidele suukaudselt CD-d ja selle töödeldud tooteid, millele järgnes nende iseloomustus. Olemasolev uuring näitab esimest korda toor- ja töödeldud CD võrdlevat uuringut (nii in vitro kui ka in vivo). Saadud tulemused laiendaksid meie arusaama CD töötlemise mõjust, mis võib olla abiks edasistes uuringutes.

materjalid ja meetodid

Materjalid

Ajugooli (180120) ja 2'-atsetüülatsetosiidi (M0601AS) standardühendid tarnis Chendu Pure Chem-Standard Co., Ltd (Chengdu, Hiina). Tsistanosiidi F(MUST-17022620), ehhinakosiidi (D1105AS), tsistanopoolset A(M0906AS) ja isoakteosiidi (M0106AS) tarnis Must ettevõte (Sichuani Hiina); akteosiid (O0618AS), salidrosiid (J0526AS), katalpol (S0728AS), geniposiid (A0407AS) ja geniposidhape (MB6001-S) hangiti ettevõttelt Dalian Meilun Bio.Co.,Ltd (Dalian, Hiina).8-Epide oksülogaanhape (B31123) oli saadud ettevõttelt Shanghai Yuanye Biological Technology Co., Ltd, Hiina. Metanool ja atsetonitriil olid MS-klassi ja saadi Merck KGaA-st, Darmstadt, Saksamaa. HPLC-kvaliteediga metaanhapet (CH, O,) tarnis Merck KGaA (Darmstadt, Saksamaa). Olemasolevas uuringus kasutatud vett töödeldi Milli-Q süsteemi kaudu (18,2 MQ, Millipore, Ma, USA). Riisiveini pakkus Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Hiina).

Cistanch deserticola koguti ettevõttest Neimenggu wangyedi cistanche Co.Ltd. Proovid tuvastas prof Yanjun Zhai (farmaatsiakool, Liaoningi ülikool TCM). Proovid esitati Liaoningi traditsioonilise hiina meditsiini ülikoolile.

Loomad

Sprague–Dawley isasrotid (SPF-klass) kogukehamassiga 180–220 g hankis Liaoning Changsheng biotechnology Co. Ltd. (Liaoningi provintsi laboratoorsete loomaressursside keskus, litsentsi number: SCXK-2015–0001). Neid rotte peeti ühe nädala jooksul hästi hoitud temperatuuri ja õhuniiskusega kasvatusruumis, st 20–26 kraadi, 50–70 protsenti. Enne katsetamist toideti rotte tavapärase laboratoorse toidu ja veega. Loomad paastusid üleöö, kuid vett anti ad libitum enne katset. Te rotid hukati 10-protsendilise kloraalhüdraadi anesteetikumiga. Hiina meditsiini Liaoningi provintsihaigla loomaeetika institutsionaalne komitee kiitis heaks kõik katseprotokollid (2019.03.25, 2019015).

CD, CD-NP ja CD-HP ekstrakti valmistamine

CD-NP, CD-HP töödeldi samast Cistanch deserticola partiist. CD-NP valmistamiseks niisutati kuivad CD-tükid (5 mm paksused, 100 g) riisi-veiniga (30 ml) ja aurutati 100 kraadi juures 16 tundi, millele järgnes kuivatamine 55 kraadi juures kuivatusahjus. Samal ajal kui CD-HP valmistati kuivade CD tükkide (5 mm paksused, 100 g) infiltratsiooni teel riisi-veiniga (30 ml), millele järgnes aurutamine 1,25 atmosfäärirõhul 4 tundi. ja seejärel kuivatati kuivatuskapis 55 kraadi juures.

100 ml mõõtekolvis sõeluti üks gramm pulbrit läbi sõela nr 4, millele järgnes 50% metanooli (50 ml) lisamine ning seejärel kaeti tihedalt ja segati. Seda segu kaaluti ja sellele järgnes pool tundi. leotamine. Pärast leotamist töödeldi segu ultraheliga (võimsus 250 W, sagedus 35 kHz) 40 minutit, millele järgnes jahutamine ja uuesti kaalumine. Kaalukadu täiendati 50% metanooliga, segati korralikult ja lasti seista, seejärel filtreeriti supernatant ja kasutati saadud filtraati testlahusena.

Aktiivsete komponentide MSE analüüs

Standardainete valmistamine: tubulosiid-A (3.02 mg), ehhinakosiid (3.00 mg), 2'-atsetüüllakteosiid (2,34 mg), akteosiid (2,45 mg), isoakteosiid (0,61). mg), tsistanosiid-F (2,14 mg), salidrosiid (3,39 mg), geniposiid (2,84 mg), ajugool (1,58 mg), katalpool (2,39 mg), geniposiidhape (2,56 mg) ja 8-epideoksülogaanhape hape (2,34 mg) lisati 10 ml mahumõõturisse, lisati konstantse mahuga metanooli skaala järgi ja konfigureeriti vastava kontsentratsiooniga võrdluslahuseks. Iga 100 μL konfigureeriti segatud võrdluslahuseks.

MS analüüsi tingimus: Massi väärtust korrigeeriti enne katset ja kasutati negatiivsete ioonide režiimi. Massivahemik oli 50–1200 Da ja proov süstiti läbi voolusüstepumba. Koonuse kiirus oli 100 l/h, lahusti voolukiiruseks määrati 800 l/h. Kapillaar- ja koonuspinge fikseeriti vastavalt 2500 ja 40 V. Iooniallika ja lahustava gaasi temperatuur oli vastavalt 100 kraadi ja 400 kraadi ning signaali vastuvõtusagedus oli 0,5 S−1.

CD ekstrakti UPLC-Q-TOF-MS analüüs (15–16 min), 65 protsenti kuni 55 protsenti A (16–18 min). Voolukiirus oli 0,3 ml min-1, samas kui automaatse proovivõtu ruumi ja kolonni temperatuur oli eraldi 30 kraadi ja 8 kraadi. Süstimismaht oli 1,0 μL.

Massispektromeetriline hindamine viidi läbi Waters XEVO G{{0}}XS QTOF MS (Waters Corporation, Milford, MA, USA) kaudu, mis sisaldas ESI allikat. Lämmastikgaasi voolukiiruseks määrati 800 L·hrs−1 temperatuuriga 400 kraadi, lähtetemperatuur fikseeriti 100 kraadi ja koonusegaasi kiiruseks 50 L h−1. Koonuse ja kapillaari pinge reguleeriti vastavalt 40 ja 2000 V peale. Kaldtee kokkupõrkeenergiat kasutati vahemikus 20–30 V. Kõikide proovide tsentreeritud andmed saadi vahemikus 50–1200 Da, 5-skaneerimisaeg 0,5 s 10-minutilise analüüsiaja jooksul. . Massi täpsuse kinnitamiseks kasutati LockSpray TM-i. Luku massina kasutati leutsiini enkefaliini te [M–H]-iooni (200 pg·μL–1 infusiooni voolukiirus 10 µL min–1) m/z 554,2615 juures. Täpse massi, prekursorioonide koostise ja fragmendi ioonide arvutamiseks kasutati tarkvara Te MassLynx V4.1 (Waters Co., Milford, USA).

Andmete analüüs Masslynxi platvormil

Lisaks loodi kirjanduse põhjal ettevõttesisene raamatukogu, mis sisaldab ühendi nime, selle struktuuri ja molekulaarset valemit (moolides). Kõik ühendid märgiti spetsiaalsesse Excelis tehtud mallisse. Lisaks salvestati kohalikku arvutisse ka mol-failid (Chemdraw Ultra 8.0, Cam-bridge soft, USA) ja kõigi üksikute liitstruktuuride Exceli failid. Loodud oluliste andmetega Exceli leht imporditi otse UNIFI teadusraamatukogusse

Struktuuriomaduste, eriti iseloomulike fragmentide ja MS killustumise hindamiseks kasutati UNIFI 1.8.2, Waters, Manchester, UK. 2D piigi tuvastamiseks määrati minimaalseks piigi pindalaks 500. 3D-piikide paljastamise ajal valiti madal energia piigi intensiivsus üle 300 loenduse ja kõrgendatud energia piigi intensiivsus üle 80 loenduse. Tuntud ühendite massiviga leiti olevat kuni ±10 ppm ja peetumisaja tolerants määrati vahemikku ±0,1 min. Valisime negatiivsed aduktid, mis sisaldavad -H ja HCOOH. MS-ist saadud toorandmete töötlemine viidi läbi täiustatud UNIFI-tarkvara abil, et ise ehitatud andmebaasi ja ettevõttesisese traditsioonilise meditsiini raamatukogu abil kiiresti kindlaks määrata standarditele vastavad keemilised komponendid.

Järgmiseks, et kontrollida iga sihtühendi keemilist struktuuri, eristati isomeere nende iseloomulike MS-i killustumise mustrite järgi, mis ilmnesid teatatud uuringutes, ja võrdlusstandardite retentsiooniaegu võrreldes.

Mitmemõõtmelisel statistilisel analüüsil põhinev metaboolne analüüs

Enne algandmete töötlemist määrati parameetrid, nagu mass vahemikus 150 kuni 1200 Da, retentsiooniaja vahemik (0 kuni 20 min), lävi intensiivsus ( 2000 loendust), massi taluvus, st 5 MDA, samas kui massi ja retentsiooniaja aken olid vastavalt 0,20 min ja 0,05 Da. Järgmises andmebaasi loendis oli ioonide identifikaator RT-m / paarid nende elueerimisaegade suhtes. Erinevate proovipartiide samu RT ja m/z väärtusi käsitleti sama ühendina.

Tõhusate biomarkerite hindamiseks viidi läbi mitme muutujaga statistiline analüüs, mis aitasid oluliselt kaasa erinevate rühmade erinevustele. Analüüsi käigus kasutati põhikomponentide analüüsi (PCA), et näidata maksimaalseid erinevusi ja mustrituvastust ülevaate ja klassifikatsiooni saamiseks. OPLS-DA on modelleerimistööriist, mis pakub OPLS-DA ennustava komponendi laadimise visualiseerimist, et aidata mudelit hinnata. Erinevate komponentide hindamisel kasutati projektsiooni muutuvat tähtsust (VIP).metaboliididwith VIP values>1.0 ja P-väärtus<0.05 were="" regarded="" as="" effective="" markers.="" furthermore,="" a="" permutation="" test="" was="" conducted="" for="" providing="" reference="" distributions="" for="" the="" r²/o²values="" that="" could="" show="" the="" statistical="">

Loomkatsed jaotati rotid juhuslikult nelja rühma (iga rühma jaoks n=6), millele järgnes erinevate ekstraktide suukaudne manustamine: (1) Tühi kontrollrühm: rottidele anti tavalist soolalahust (2 ml/100 g) ; (2) CD rühm: rottidele anti CD ekstrakti (2 ml/100 g); (3) CD-NP rühm: rottidele anti CD-NP ekstrakti (2 ml/100 g); (4) CD-HP rühm: rottidele anti CD-HP ekstrakti (2 ml/100 g). Kõigi rühmade edasine kategoriseerimine viidi läbi vastavalt plasma, uriini ja väljaheidete kolme alarühma. Kaks tundi hiljem manustati igale rotile suukaudselt sama ja võrdne kogus ekstrakte.

Pärast manustamist võeti vereproovid 1.0 h, 20 h ja 40 h hepariniseeritud 1,5 ml polüetüleentorudes (orbitaalveenidest) , millele järgnes kõigi proovide tsentrifuugimine (kiirusel 4500 pööret minutis) 15 minutit.

Uriini- ja väljaheiteproovide jaoks hoiti rotte ainevahetuspuurides ning seejärel võeti uriini- ja väljaheiteproove 24 tundi pärast manustamist. Uriiniproove tsentrifuugiti kiirusel 4500 pööret minutis 15 minutit, samal ajal kui väljaheiteproovid kuivatati varjus, jahvatati pulbriks, seejärel võeti 0,2 g ja lisati 0,5 ml soolalahusesse. lahust, ultraheli 5 minutit ja tsentrifuugiti kiirusel 12,000 pööret minutis 15 minutit. Kõiki bioproove hoiti kuni analüüsimiseni temperatuuril -80 kraadi.

Bioloogiliste proovide ettevalmistamine. Plasma-, uriini- ja väljaheiteproovide lisamine viidi läbi 3 mahu metanooliga, millele järgnes 3-minutise keerisega segamine. Järgmisena tsentrifuugiti segusid (kiirusel 12, 000 pööret minutis) 10 minutit, seejärel kanti supernatant EP katseklaasi ja kuivatati seejärel lämmastikuga 37 kraadi juures. Lisaks lisati 200 µl HCN-H2O (50 protsenti) lahust. Kümnes kasutati keerist segamiseks (1 min), millele järgnes tsentrifuugimine (12, 000 pööret minutis) 5 minutit. Töödeldud proovide supernatant (5 μL) süstiti UPLC-Q-TOF-MSE süsteemi.

Vedelikkromatograafilised ja massispektromeetrilised tingimused Analüüsi jaoksmetaboliididteostas ka Watersi UPLC instrument ESI liidese kaudu. Eraldamiseks kasutati Acquity UPLC HSS T3 kolonni (100 mm × 2,1 mm, 1,8 µm), liikuv faas oli 0,1 protsenti sipelghapet (A): atsetonitriil (B), gradiendi elueerimise tingimus oli 0-3 min (99,8 protsenti → 98 protsenti A).3-5 min (98 protsenti → 95 protsenti A),5-8 min (95 protsenti → 90 protsenti A), { {18}} min (90 protsenti → 85 protsenti A),12-17 min (85 protsenti → 70 protsenti A), 17-22 min (70 protsenti → 60 protsenti A), 22-23 min (60 protsenti → 58 protsenti A), 23-25 min (58 protsenti A), 25-32 min (58 protsenti → 45 protsenti A) ja 32-37 min (45 protsenti → 35 protsenti A ), voolukiirus oli 0,4 ml min{40}}. Kolonni ja prooviruumi temperatuuriks seati vastavalt 40 kraadi ja 8 kraadi. Kasutati ülalmainitud massispektromeetria tingimusi.

Bioproovides metaboliitide süstemaatilise analüüsi strateegia Andmetöötluseks kasutati UNIFI (1.8.2) tarkvara. Tõhusate metaboliitide tuvastamiseks kasutati funktsiooni Binary Compare. Hinnatud metaboliite samaväärses kontrollproovis ei esinenud või need esinevad madala iooniintensiivsusega. Suhtelise intensiivsuse lävi määrati 3 või 5 ja allajoonitud kriteeriumidele vastavaid metaboliite sai hinnata. Seejärel määrati EIC abil tavalised ja prognoositavad metaboliidid. Kahefaasiliste metaboliitide otsimiseks kasutati NLF funktsiooni. Näiteks UNIFI tarkvaras saab parameetriteks määrata 176.0321 võimalike glükuroonhappe konjugaatide otsimiseks. Järeltöötlusel saab meetodis määrata või tuvastada neutraalse kadu. MassFragmenti kasutati tuvastatud metaboliitide struktuuride määramiseks või iseloomustamiseks, UNIFI spektraaltõlgendusfunktsioon on peamine funktsioon, mida kasutatakse lähtekomponentide sekundaarse killustumise analüüsimiseks. Seda funktsiooni saab kasutada killustatuse tee kiireks kontrollimiseks, kas see on mõistlik.

Tulemused

Fenüületanoidglükosiidide ja iridoidide massi killustumise reegel

Fenüületanoidglükosiidid on CD peamised keemilised koostisosad. isoakteosiidi standardlahused,

Võeti tsistanosiid F, tubulosiid A, ehhinakosiid, akteosiid ja 2'-atsetüülakteosiid, millele järgnes kokkupõrkeenergia erineva taseme andmine (tabel 1) ja seejärel saadi vastavad MS2 kaardid (joonis 1).

Massispektromeetriline analüüs näitas, et fenüületanoidglükosiididel on sarnased massispektri fragmentatsioonimustrid, negatiivsete ioonide režiimis hõlmavad lõhustamisrajad peamiselt (1) estersideme lõhustumist: neutraalse kofeoüülrühma (C, H, O162.03) ja neutraalse atsetüüli kadu. rühm (C, H, O,42.00);(2) Glükosiidne lõhustumine: neutraalsete ramnoosijääkide (C.HIO, 146,05) ja neutraalsete glükoosijääkide (CgHO, 162,05) kadu. Kõrge eraldusvõimega massispektromeetriast saab eristada kofeoüüli (162,03) ja glükoosijääki (162,05).

Võeti iridoidide ajugooli, katalpoli, geniposiidhappe, geniposiidi ja 8-epide oksülogaanhappe standardlahused, millele järgnes erinevate kokkupõrkeenergiate andmine ning saadi vastavad MS-kaardid (joonis 2).

Iridoidglükosiididel on sarnased massispektri fragmentatsioonimustrid, negatiivsete ioonide režiimis on lõhustamisteed peamiselt (1) glükosiidne lõhustamine: neutraalse glükoosijäägi (CHoO, 162,05) kadu; (2) neutraalse CO (43,99) ja H kadu. , O(18,01).

Ühendite identifitseerimine CD, CD-NP ja CD-HP ekstraktides

UPLC-QTOF-MSE analüüs

Viidi läbi kromatograafiliste tingimuste optimeerimine. Järgmisena hinnati CistancheHerba ühendeid nii negatiivsete kui ka positiivsete ioonide režiimides nii kõrge kui ka madala CE-ga. Saadud tulemused näitasid, et nende ühendite puhul oli negatiivse režiimi ühilduvus suurem kui positiivse režiimiga. Joonisel fig 3 on näidatud MS-i aluselise piigi iooni (BPI) kromatogramm, mis on jälgitud nummerdatud piikidega. Iga tuvastatud iooni intensiivsus UPLC-Q-TOF-MS analüüsis normaliseeriti kogu ioonide arvu suhtes, et luua andmemaatriks, mis koosnes m/z väärtusest, normaliseeritud piigi pindalast ja retentsiooniajast.

CD ja selle töödeldud toodete komponentide hindamine UNIFl platvormil

CD-st ja selle töödeldud tootest (tabel 2) tuvastati -SEM (n=6) režiimiga kokku 97 ühendit, sealhulgas fenüületanoidglükosiidid (PhG), iridoidid, lignaanid ja oligosahhariidid. 95, 91 ja 94 komponenti tuvastati vastavalt CD-s, CD-NP-s ja CD-HP-s. Nende hulgas oli 64 fenüületanoide, 13 iridoide ja 20 muud tüüpi ühendit. CD ja selle töödeldud toote keemilises koostises esines sarnasusi, kuid komponentide kogus oli CD ja selle töödeldud toote lõikes erinev.

Töödeldud toodete keemiliste komponentide variatsioonid Mitme muutujaga andmemaatriksi analüüsimiseks kasutati tarkvara Simca-P 13.{2}}. Enne PCA-d olid kõik muutujad keskmise kesksed ja Pareto-skaala järgi, millele järgnes potentsiaalsete diskrimineerivate muutujate tuvastamine. PCA skoori graafikul näitas iga punkt individuaalset proovi. Proovid, mis näitasid oma keemiliste komponentide sarnasust, hajutati üksteise kõrval, samas kui need, mis näitasid nende komponentide erinevusi, jagati. Nagu näha PCA-st (joonis 4), eraldati CD-HP rühm CD ja CD-NP rühmadest.

To distinguish CD from CD-HP and CD-NP, OPLS-DA, permutation test, S-plot, and VIP value were developed. (Figs.5, 6,7)The obtained results revealed that many components were key characteristic components of each product. The screening condition was the VIP>1 ja P<0.05. from="" the="" date="" of="" the="" s-plot,="" the="" characteristic="" components="" were="" evaluated,="" which="" were="" commonly="" existing="" in="" the="" three="">

Jooniselt 8 leidsime akteosiidi (54), tsistanosiidi C (74), kampneosiidi I (43), osmantusiidi (75) ja 4'-O-kofeoüülrühma sisaldava 2'-aktüülakteosiidi (80) intensiivsuse. 8-O- -D-glükopüranosüüli osa (vt joonis 9) vähenes pärast töötlemist riisi-veiniga, samas kui isoatsetosiidi (60) intensiivsus on kastanosiid (71), iso-kampneosiid I (69), isomartynosiid (86), millel on 6'-O-kofeoüülrühm (vt joonis 9), on suurenenud, eriti CD-NP rühma puhul. Kuigi tubulosiidil B (72) on 6'-O-kofeoüülrühm, sama mis isoakteosiidil, vähenes intensiivsus selle 2'-atsetüülrühma tõttu. 6'-O- -D-glükopüranosüülrühma sisaldava ehhinakosiidi(38) ja tsistanosiidi B intensiivsus suurenes, kuid tubulosiidi A (55) intensiivsus vähenes ka selle 2'-atsetüülrühma tõttu.

Meie uurimisrühm uuris ka akteosiidi ja isoakteosiidi termilist stabiilsust ning leidis, et akteosid oli vees, metanoolis ja kollase riisiveini lahuses ebastabiilne ning seda saab kuumutamise tingimustes osaliselt isoakteosiidiks muuta. Kuid isoakteosiidi termostabiilsus oli parem, eriti kollase riisiveini lahuses. Joonisel 10 on näidatud PhG-de võimalikud muutused CD-s töötlemise ajal:

Metaboliitide identifitseerimine rottidel Kõrge eraldusvõimega massispektromeetria andmete põhjal analüüsiti ja võrreldi metaboliitide ja protomolekulide ühendite täpset molekulmassi ja elementide koostist. Kuna sama tüüpi ühendid TCM-is näitasid metaboolsete modifikatsioonide sarnasust, võivad fütokeemiliste koostisosade korrelatsioonid in vitro laieneda nende metaboliitidele in vivo . Vahepeal järeldati tavapäraste biotransformatsiooni radade põhjal mõistliku molekulmassi muutuse kohta. Lõpuks tuvastati metaboliidid, analüüsides metaboliitide ja protoühendite fragmentatsiooniraja MSE massispektreid massispektris [21, 22]. Võrreldes pimeprooviga tuvastati selle komponendid in vivo kromatogrammi-massispektri teabe, metaboolse reaktsiooni võimalikkuse, ühendi struktuuri omaduste ja selle massispektri killustumise reegli põhjal. Vt tabel 3.

Fenüületanoolglükosiididega seotud metaboliitide tuvastamine

Töötlemiseks kasutati UNIFI platvormi. Joonisel 11 on näidatud uriini, väljaheidete ja plasma TIC-kromatograaf CD ja selle töödeldud toodete jaoks. Võrreldes tühiproovidega tuvastati rottidel kokku 54 metaboliiti, sealhulgas 10 prototüübi komponenti ja 44 metaboliiti, millest 24, 49 ja 6 olid vastavalt väljaheites, uriinis ja plasmas.

Täpse massi, fragmentatsioonikaskaadi ja biotransformatsioonist tulenevate prognoositavate neutraalsete kadude põhjal hinnati esialgselt kokku 35 fenüületanoidglükosiididega seotud metaboliiti. Fenüületanoidglükosiidide sarnastel metaboliitidel on sarnased massispektri fragmentatsioonimustrid, nagu tüüpiline dekofeoüülfragment m/z 461,1605, seejärel hüdrolüüsitakse glükosiid- ja estersidemetega in vivo ja metaboliseeritakse hüdroksütürosooliks (HT) (m/). z153,0504, C.HO.4,73 min) ja kohvhape (CA) (m/z179,0389, CH, O0,77 min), vaata joonist 12A.

M11 on näidatud [MH]~ juures m/153,0504 valemiga st C.HO ja identifitseeritud kui HT. M16 esitas [MH]- m/z juures 329,0851, mis oli 176 Da kõrgem kui HT-l, mis näitab, et see võib olla HT glükuroniseeritud metaboliit. M26 [MH]- oli m/z juures 343,1037,14 Da kõrgem kui HT-glükuroniidil. Seetõttu tuvastati M26 HT-metüülitud glükuroniidina. M17 tuvastati HT-sulfaadina, võttes aluseks selle [MH]-m/z 233,0112,80 Da võrreldes HT-ga, mida sai edasi metüülida, seejärel saadi M22, mille m/z oli 247,0278, mis näitab, et see oli HT- metüülitud sulfaaditud metaboliit. M7 (m/167,0335) ja M5 (m/z 167,0762) loeti vastavalt oksüdatsiooniproduktiks ja metüleeritud HT-ks (joonis 12B).

M1 näitas [MH]- m/z 179,0389 juures, selgitatud molekulvalem oli CH-O ja identifitseeriti kohvhappena (CA). M25 näitas [MH]- m/355,0704 juures, mis oli 176 Da kõrgem kui CA oma, näitab et see võib olla CA glükuroniseeritud metaboliit. M27 m/z oli 258,994, mis oli 80 Da kõrgem kui CA oma, seega selgitasime selle CA-sulfaadina ja see võis toota M35 (m/z 273,0064). Kuna M4 annab [MH]7 m/z juures 193,0524,14 Da kõrgemal kui CA, tuvastati see CA-ga metüülitud metaboliidina. M39 oli CA dehüdroksüülatsiooni metaboliit, m/z 163,04 ja seda sai sulfaadida M32-ks (m/z 242,9951).

M33 (m/z 181.0491, C.HO, 9,06 min) oli CA ehk 3,4-dihüdroksübenseenpropioonhappe redutseerimisprodukt, mida sai metüülida M19-ks (m /z 195,0623, C10H12O4, 0,93 min). M33 saab dehüdreerida M43-ks, see on 3-HPP (m/z 165,0558, C9H10O3, 11,29 min) ja M31 (m/z 341,0942, C15H17O9, 8,90 min) ja M29 (m/z, H2564, C9H106 8,52 min) olid glükuronideeritud ja sulfaaditud tooted (joonis 12C).

Fenüületanoidglükosiididega seotud metaboliitide puhul olid peamised metaboolsed kaskaadid II faasi metaboolsed reaktsioonid, st glükuronisatsioon, metüülimine ja sulfatsioon. Kavandatavad fenüületanoidide metaboolsed kaskaadid on kujutatud joonisel 13.

Iridoididega seotud metaboliitide tuvastamine

Analüüsides metaboliitide elementaarset koostist, MSE fragmentatsiooni ja sellega seotud kirjandust, hinnati esialgselt kokku 19 iridoidiga seotud metaboliiti. Iridoidglükosiidid hüdrolüüsiti glükosiidsidemetega, moodustades neile vastavad aglükoonid. M/z 185,117 oli M8 puhul, 162 Da väiksem kui ajugoolil, mis saadi glükoosijäägi kadumise tõttu.

M40 (m/z 199,0641, Rt 10,91 min) oli katalpoli deglükosüülitud produkt. M45 m/z 169,0487, Rt 12,15 min) oli vähem kui 30 Da katalpoli deglükosüülitud metaboliidi omast ja tuvastati CH, O metaboliidi molekuli eemaldamisena. M34 (m/z 151,0352, Rt 9,08 min) oli H, O metaboliidi edasine kadu.

M44 (m/z 211,0665, Rt 11,31 min) oli geniposiidi deglükosüülitud metaboliit ja M37 (m/z 197,0833, Rt 15,03 min) oli 8-epideoksülogaanhappe deglükosüülimine. Iridoidide metaboolsed reaktsioonid võivad ilmneda deglükosüülimise I faasi metabolismina (joonis 12D).

Plasma, uriini ja väljaheidete metaboolse profiili võrdlus CD ja selle töödeldud toodete vahel

Võrreldi 2 prototüüpi plasmas, 7 uriinis ja 3 väljaheites. CD-s oli 7 prototüüpi, CD-NP-s 7 prototüüpi ja CD-HP-s 8 prototüüpi. M21 tuvastati ainult CD-NP väljaheidete rühmas ja M38 ja M51 tuvastati ainult CD-HP uriinirühmades. Võrreldes metaboliitidega oli plasmas, uriinis ja väljaheites identseid metaboliite vastavalt 4, 42 ja 21. CD-rühmas imendus 34 metaboliiti, CD-NP-s 39 ja CD-HP-rühmas 40 metaboliiti. M5, M7, M40 ja M52 tuvastati ainult CD-NP rühmades, samas kui M24, M4l ja M48 tuvastati just CD-HP rühmades.

Erinevates CD töödeldud toodetes täheldati toimeainete imendumise ja metabolismi erinevusi. Jooniselt 14 leidsime, et HT-sulfaadi konjugatsiooni (M17) intensiivsus oli kõrgeim uriinis, millele järgnes 3-HPP sulfaadi konjugatsioon (M29), metüülitud HT sulfaadi konjugatsioon (M22), dehüdroksüülitud CA sulfaadiga konjugatsioon (M32) ja 3,4-dihüdroksübenseenpropioonhappe sulfaadi konjugatsioon (M19). Töödeldud rühmas oli ainevahetusproduktide sisaldus kõrgem kui CD rühmas, eriti M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2 puhul. Nende prekursor 6'-O-kofeoüülrühm 8-O- -D-glükopüranosüüli osas, ühenditel, nagu hüdroksütürosool, on kasvajavastased, põletikuvastased, antibakteriaalsed, viirusevastased ja seenevastased omadused [ 23]. Kofeiinhappel on põletiku-, vähi- ja viirusevastane toime [24]. See oli kooskõlas CD ja selle töödeldud toodete kliinilise kasutamisega.

Arutelu

CD on TCM ja selle peamised bioaktiivsed komponendid, sealhulgas PhG-d, iridoidid, polüsahhariidid, on dokumenteeritud erinevate uuringute abil. TCM-i kliinilises praktikas on CD töödeldud tooteid laialdaselt kasutatud võrreldes toorproduktidega. Töötlemise käigus muutub keemiline koostis, mis võib kaasa tuua muutusi ravitoimes (joonis 14).

PhG-d on teatud tüüpi fenoolsed ühendid, mida iseloomustab -glükopüranosiidi struktuur, mis kannab aglükoonina hüdroksüfenüületüülrühma. Need ühendid sisaldavad sageli kofeiinhapet ja ramnoosi, mis on seotud glükoosijäägiga vastavalt estri- või glükosiidsidemete kaudu. Käesolevas uuringus on CD, CD-NP kvalitatiivsed analüüsid. ja CD-HP ning tuvastati kokku 97 ühendit, sealhulgas fenüületanoidglükosiidid (PhG), iridoidid jne. Saadud tulemused näitasid keemilise koostise erinevusi enne ja pärast töötlemist. PhG-de, mis sisaldavad 4'-O-kofeoüülrühma 8-O- -D-glükopüranosüüli osas, nagu akteosiid, tsistanosiid C, kampneosiid II, osmanthus-pool, intensiivsus vähenes pärast töötlemist, samas kui PhG-d koos

nagu isoatsetosiid, isotsistanosiid, isokampneosiid I, isomartynosiid suurenenud, eriti CD-NP rühmas. Suurenes ka ehhinakosiidi ja tsistanosiidi B intensiivsus, mille struktuur sisaldab 6'-O- -D-glükopüranosüülrühma. PhG-d, millel on 2'-atsetüülrühm, vähenesid sageli protsessi käigus toimuva hüdrolüüsireaktsiooni tõttu, nagu tubulosiid B, 2-atsetüüllakteosiid.

In vivo imendunud metaboliitide uurimine viidi läbi pärast CD ja selle töödeldud toodete suukaudset manustamist. II faasi metaboolsed protsessid olid võtmekaskaadid ja enamik metaboliite olid sulfaat, glükuroniid ja metüülitud konjugaadid. Fenüületanoolglükosiidide suukaudne imendumine ja kasutamine on madal. Neid on raske verre imenduda ja nad toimivad eellasrakkudena, et täita oma rolli pärast metaboolset aktiveerimist in vivo. Fenüületanolaglükooniks toodetud fenüületanoidid, nagu hüdroksütürosool (HT) ja kohvhape (CA) ning selle derivaat 3-hüdroksüfenüülpropioonhape (3-HPP), võivad need metaboliidid plasmas kergemini imenduda ja neil on parem ravitoime.

CD ja selle töödeldud tooted. HT-sulfaadi konjugatsioon (M17) on uriinis kõige intensiivsem, millele järgneb 3-HPP sulfaadi konjugatsioon (M29), metüülitud HT sulfaadi konjugatsioon (M22), dehüdroksüülitud CA sulfaadi konjugatsioon (M32) ja 3,{{ 7}}dihüdroksübenseenpropioonhappe sulfaadi konjugatsioon (M19). Töödeldud rühmas oli ainevahetusproduktide sisaldus kõrgem kui CD rühmas, eriti M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2 puhul.

Üldiselt võivad komponendid, millel on suur kokkupuude sihtorganitega, olla tõhusad. In vitro on hinnatud ja määratud piisav kogus fenüületanoide ja nende derivaate. Iseloomulik ühend on akteosiid, mille sisaldus vähenes peale töötlemist riisi-veiniga ning suurenes vastavalt isoakteosiidi, isotsistanosiidi C, isokampneosiidi I sisaldus. PhG-de, nagu CA ja HT derivaadid, lagunemissaadusi saab hinnata bioproovides ning riisi-veini töötlemine võib suurendada metaboliitide imendumist in vivo .

Järeldus

Selles uuringus tuvastati CD ja selle töödeldud toote ekstraktides 97 ühendit. Mõne glükosiidi lagunemine toimus kõrgendatud temperatuuril ja selle tulemusena sünteesiti mõned uued isomeerid ja kompleksid. In vivo uuringus määrati prototüübi komponendid (10) ja metaboliidid (44) või hinnati neid esialgselt roti plasmas, väljaheites ja uriinis. II faasi metaboolsed protsessid olid võtmekaskaadid, enamik metaboliite olid seotud ehhinakosiidi või akteosiidiga, nagu HT, CA ja nende derivaadid 3-hüdroksüfenüülpropioonhape 3-HPP. Need metaboliidid võivad plasmas kergemini imenduda ja neil on parem ravitoime. Saadud tulemused näitasid, et CD keemiline koostis oli erinev ja mõjutas ühendi dispositsiooni in vitro ja in vivo.

Lühendid

PhG-d: fenüületanoidglükosiidid; CD: Cistanche deserticola; CMM: Hiina Materia Medica; TCM: traditsiooniline hiina meditsiin; CD-NP: Gistanche deserticola Töödeldud aurutamisel koos riisi-veiniga normaalrõhul; CD-HP: Cistanche deserticola Töödeldud aurutamisel koos riisi-veiniga kõrge rõhu all; UPLC-Q-TOF-MS: ülikõrge jõudlusega vedelikkromatograafia koos TOF-MS-iga; PCA: põhikomponentide analüüs; VIP: projektsiooni jaoks muutuv tähtsus; CA: kohvhape; HA: Hüdroksütürosool.

Tänuavaldused

Ei kohaldata.

Autorite kaastööd

Käsikirja koostamisel, kirjutamisel osalesid LZ, LBN, SJ. RJ, LPP abistasid loomkatsetes ning koostasid ja viimistlesid kõik joonised ja tabelid. ZC, HY. ITZ aitas selle uuringu kavandamisel ja läbiviimisel ning vaatas käsikirja üle. Kõik autorid lugesid lõpliku käsikirja läbi ja kiitsid selle heaks.

Rahastamine

Seda tööd toetasid Hiina riiklik loodusteaduste sihtasutus (grandi nr: 81874345) ja Liaoningi provintsi loodusteaduste sihtasutus (toetuse nr: 2020-MS-223).

Andmete ja materjalide kättesaadavus

Käesoleva uuringu käigus kasutatud ja/või analüüsitud andmestikud on mõistliku taotluse korral kättesaadavad vastavalt autorilt.

Deklaratsioonid

Eetiline kinnitus ja nõusolek osaleda

Eetiline luba katseloomade kasutamiseks selles uuringus on saadud Liaoningi Traditsioonilise Hiina Meditsiini Ülikooli meditsiinieetika komiteelt (kinnitusnumber: 2018YS(DW)-044-01). Kõik selle uuringu eksperimentaalsed protseduurid järgisid eetikastandardeid. Liaoningi traditsioonilise hiina meditsiini ülikooli meditsiinieetika komitee.

Nõusolek avaldamiseks

Ei kohaldata.

Konkureerivad huvid

Autorid kinnitavad, et neil ei ole huvide konflikte avalikustada.

Autori üksikasjad

"Liaoningi traditsioonilise hiina meditsiini ülikooli farmaatsiaosakond, Dalian, Liaoning, Hiina." Monos Groupi ravimiuuringute instituut, Ulaanbaatar 14250, Mongoolia.

Saabunud: 31. mai 2021 Vastu võetud: 17. september 2021 Veebis avaldatud: 28. september 2021

Zhe Li1, Lkhaasuren Ryenchindorj2, Bonan Liu1, Ji Shi1*, Chao Zhang1, Yue Hua1, Pengpeng Liu1, Guoshun Shan1 ja Tianzhu Jia1

Viited

1. Hiina farmakopöa komisjon. Pharmacopeia of The People's Republic of China, vol. I. Peking: China Medical Science Press; 2020. Lk. 140.
2. Li Z, Lin H, Gu L, Gao J, Tzeng CM. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): üks traditsioonilise hiina meditsiini parimaid farmaatsia kingitusi. Front Pharmacol. 2016;7:41.
3. Liu BN, Shi J, Zhang C, Li Z, Hua Y, Liu PP, Jia TZ. Fresh Cistanche deserticola erinevate kuivatamismeetodite mõju selle koostisosade sisaldusele. J Chin Med Mater. 2020;10:2414–8.
4. Liu BN, Shi J, Jia TZ, Lv TT, Li Z. Cistanches Herba kõrgsurveaurutamisprotsessi optimeerimine. Chin Trad Patent Med. 2019;11:2576–80.
5. Fan YN, Huang YQ, Jia TZ, Wang J, La-Sika, Shi J. Cistanches herba mõju enne ja pärast töötlemist D-galaktoosist põhjustatud vananemisrottide vananemisvastasele funktsioonile ja immuunfunktsioonile. Chin Arch Trad Chin Med, 2017; 11:2882–2885.
6. Gao YJ, Jiang Y, Dai F, Han ZL, Liu HY, Bao Z, Zhang TM, Tu PF. Cistanche deserticola YMCA lahtistavate koostisosade uuring. Kaasaegne Chin Med. 2015;17(4):307–10.
7. Liu BN, Shi J, Li Z, Zhang C, Liu P, Yao W, Jia T. Uuring Cistanche deserticola ja selle riisiveini aurutamistoodete neuroendokriin-immuunfunktsiooni kohta glükokortikoidide indutseeritud rotimudelis. Evid Based Complement Alternatiivne Med. 2020;22:5321976.
8. Guo Y, Wang L, Li Q, Zhao C, He P, Ma X. Enhancement of neeru turgutav funktsioon hiiremudelis Cistanches herba kuivatatud kiiresti keskmisel kõrgel temperatuuril. J Med Food. 2019;22(12):1246–53.
9. Wang T, Zhang X, Xie W. Cistanche deserticola YC Ma, "Kõrbe ženšenn": ülevaade. Am J Chin Med. 2012;40(6):1123–41.
10. Fu Z, Fan X, Wang X, Gao X. Cistanches Herba: ülevaade selle keemilistest, farmakoloogilistest ja farmakokineetikalistest omadustest. J Etnopharmacol kol. 2018;219:233–47.
11. Lei H, Wang X, Zhang Y, Cheng T, Mi R, Xu X, Zu X, Zhang W. Herba Cistanche (Rou Cong Rong): ülevaade selle fütokeemiast ja farmakoloogiast. Chem Pharm Bull. 2020;68(8):694–712.
12. Geng X, Tian X, Tu P, Pu X. Ehhinakosiidi neuroprotektiivne toime Parkinsoni tõve hiire MPTP mudelis. Eur J Pharmacol. 2007;564:66–74.

13. Deng M, Zhao JY, Ju XD, Tu PF, Jiang Y, Li ZB. Tubulosiidi B kaitsev toime TNF-alfa-indutseeritud apoptoosile neuronaalsetes rakkudes. Acta Pharmacol Sin. 2004;25(10):1276–84.
14. Nan ZD, Zhao MB, Zeng KW, Tian SH, Wang WN, Jiang Y, Tu PF. Põletikuvastased iridoidid Tarimi kõrbes kasvatatud Cistanche deserticola vartest. Chin J Nat Med. 2016;14(1):61–5.
15. Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y, Tu PF. Põletikuvastase toimega fenüületanoidglükosiidid Tarimi kõrbes kasvatatud Cistanche deserticola vartest. Fitoteraapia. 2013;89:167–74.
16. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, Yoshikawa M, Hayakawa T, Muraoka O. Cistanche tubulosa iridoid ja atsüklilised monoterpeenglükosiidid, kankanosiidid L, M, N, O ja P. Chem Pharm Bull. 2010;58(10):1403–7.
17. Li SL, Song JZ, Qiao CF jt. Uudne strateegia potentsiaalsete keemiliste markerite kiireks uurimiseks töötlemata ja töödeldud Radix Rehmanniae eristamiseks UHPLC-TOF-MS abil mitme muutujaga statistilise analüüsiga. J Pharm Biomed Anal. 2010;51(4):812–23.
18. Peng F, Chen J, Wang X, Xu CQ, Liu TN, Xu R. Muutused fenüületanoidglükosiidide tasemes, antioksüdantide aktiivsuses ja muudes kvaliteediomadustes Cistanche deserticola viiludes auruga töötlemisel. Chem Pharm Bull. 2016;64:1024–30.
19. Ma ZG, Tan YX. Kuue fenüületanoidglükosiidi sisu muutub aurutamise ajal veiniga Desertliving Cistanche'is. Chin Trad Pat ent Med. 2011;33(11):1951–4.
20. Peng F, Xu R, Wang X, Xu C, Liu T, Chen J. Aurutamisprotsessi mõju koristusjärgse cistanche deserticola kvaliteedile meditsiiniliseks kasutamiseks päikesekuivatamise ajal. Biol Pharm Bull. 2016;39(12):2066–70.
21. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W. Toidu akteosiidi metaboliidid: profiilid, isoleerimine, tuvastamine ja hepatoprotektiivsed võimed. J Agric Food Chem. 2018;66(11):2660–8.
22. Cui Q, Pan Y, Bai X, Zhang W, Chen L, Liu X. Cistanche tubulosa ehhinakosiidi ja akteosiidi metaboliitide süstemaatiline iseloomustus roti plasmas, sapis, uriinis ja väljaheites UPLC-ESI-Q-TOF põhjal -PRL. Biomed Chromatogr. 2016;30(9):1406–15.
23. Bertelli M, Kiani AK, Paolacci S, Manara E, Kurti D, Dhuli K, Bushati V, Miertus J, Pangallo D, Baglivo M, Beccari T, Michelini S. Hüdroksütürosool: paljulubava farmakoloogilise toimega looduslik ühend. J Biotechnol. 2020;309:29–33.
24. Touaibia M, Jean-François J, Doiron J. Cafeic Acid, mitmekülgne farmakofoor: ülevaade. Mini Rev Med Chem. 2011;11(8):695–713.

Väljaandja märkus

Springer Nature jääb avaldatud kaartide ja institutsionaalsete seoste suhtes erapooletuks.