1. peatükk: OSBPL7-le suunatud ühendid suurendavad ABCA{2}} sõltuvat kolesterooli väljavoolu, säilitavad neerufunktsiooni kahes neeruhaiguse mudelis

Rohkem informatsiooni:tina.xiang@wecistanche.com

Kahjustatud raku kolesterooli väljavool on progresseerumise võtmetegurneeru-, südame-veresoonkonnajaautoimmuunhaigused. Siin kirjeldame 5-arüülnikotiinamiidühendite klassi, mis tuvastati fenotüüpsete ravimite avastamise teel ja mis reguleerivad ABCA1-sõltuvat kolesterooli väljavoolu, sihites oksüsterooli siduvat valku nagu 7 (OSBPL7). OSBPL7 tuvastati nende ühendite molekulaarseks sihtmärgiks keemilise bioloogia meetodil, kasutades fotoaktiveeritavaid 5-arüülnikotiinamiidi derivaate rakulises ristsidumise/immunosadestamise testis. Kahe ühendi (Cpd A ja Cpd G) edasine hindamine näitas, et need indutseerisid ABCA1 ja kolesterooli väljavoolu podotsüütidest in vitro ning normaliseerisid proteinuuria ja hoidsid ära neerufunktsiooni languse proteinuurilise neeruhaiguse hiiremudelites: adriamütsiini poolt põhjustatud nefropaatia ja Alporti sündroom. Kokkuvõtteks näitame, et OSBPL7-le suunatud väikesemolekulilised ravimid näitavad alternatiivset mehhanismi ABCA1 ülesreguleerimiseks ja võivad kujutada endast paljulubavat uut terapeutilist strateegiat neeruhaiguste ja muude rakulise kolesterooli homöostaasi häirete raviks.

Klõpsake, et näha, kuidas cistanche tubulosa on kasulik, ja rääkige meile oma cistanche'i kogemusest 

Krooniline neeruhaigus (CKD) on Ameerika Ühendriikides suur terviseprobleem, mis mõjutab rohkem kui 30 miljonit inimest. CKD progresseerumise aeglustamisel on tehtud olulisi edusamme angiotensiini konverteeriva ensüümi inhibiitorite (ACEi) ja angiotensiini retseptori blokaatorite (ARB) ning naatrium-glükoosi kaastransporteri tüüpi 2 inhibiitorite (SGLT2i) kasutuselevõtu kaudu. Paljud kroonilise neeruhaigusega patsiendid arenevad siiski lõppstaadiumis neeruhaiguseks (ESRD)2-6. Kroonilise neeruhaiguse ravi parandamiseks tehakse olulisi teadusuuringuid. Uute haigusspetsiifiliste sihtmärkide ja uute varajast sekkumist võimaldavate ravimite tuvastamine on levinud (nt diabeetiline neeruhaigus), aga ka vähem levinud.neeruhaigused(nt fokaalne segmentaalne glomeruloskleroos ja Alporti sündroom).

Meie ja teised oleme näidanud, et diabeetilise neeruhaiguse (DKD)7-1l, fokaalse segmentaalse glomeruloskleroosi (FSGS)12-14 ja Alporti sündroomi (AS)13 ja on seotud ATP-d siduva kassetttransporteri (ABC Al) vahendatud kolesterooli väljavoolu allareguleerimisega. Samuti oleme näidanud, et ABCA1 geneetiline üleekspressioon päästab hiired FSGS-tüüpi glomeruloskleroosist4 ja et podotsüütide-spetsiifiline ABCA1 puudulikkus halvendab eksperimentaalset DKD-d. Hiljuti teatasime, et kolesterooli glomerulite kahanemine tsüklodekstriiniga on renoprotektiivne ka DKD9, FSGSl3, 14 ja AS13 mudelites. Kuigi kaitsev, soodustab tsüklodekstriin kolesterooli eemaldamist üsna ebaselektiivsel viisil ja selle manustamisviis (st parenteraalne) on ebamugav. Need andmed koos viitavad alternatiivsetele lähenemisviisidele ABCA{14}vahendatud kolesterooli väljavoolu ülesreguleerimiseks ning võivad pakkuda tõhusat ravi FSGS-i ja muude neeruhaiguste korral.

Varasemad ühendid, nagu T1317 ja GW3965, maksa-X-retseptorite (LXR) agonistid, indutseerivad märkimisväärselt ABCAl mRNA ekspressiooni ja soodustavad raku kolesterooli väljavoolu lipoproteiinidesse 5-17. Neeruhaiguse korral parandavad LXR agonistid rakulist kolesterooli transporti ja nürivad põletikulisi reaktsioone makrofaagides, mis puutuvad kokku mõõduka kuni raske kroonilise neeruhaigusega18 patsientide lipoproteiinidega. Diabeediga hiirtel vähendavad LXR agonistid proteinuuria,neerupõletikja neerude glomerulaarkolesterooli sisaldust, suurendades ABCA{0}}. Kahjuks on LXR agonistidel ebasoovitav toime plasma ja maksa triglütseriidide suurendamiseks, mis on takistanud kliinilist arengut22.

Selles töös kirjeldame fenotüüpsete ravimite avastamise (PDD) algatuse tulemusi, mis viisid ABCA1 (5-arüülnikotiinamiidide) väikesemolekuliliste indutseerijate klassi tuvastamiseni. Sihtmärgi dekonvolutsioon, kasutades keemilist bioloogiat, viis oksüsterooli siduva valgu-sarnase 7 (OSBPL7) tuvastamiseni molekulaarse sihtmärgina. Homoloogia modelleerimine ja ligandi dokkimine näitavad, et ühendid interakteeruvad otseselt prognoositava sterooli sidumistaskuga. Edasine optimeerimine viis ühendite A(Cpd A) ja G(Cpd G) tuvastamiseni, mis sobivad in vivo testimiseks. Nii Cpd A kui ka Cpd G suurendavad inimese kultiveeritud podotsüütides plasma membraani ABCAl ja suurendavad oluliselt ABCA1-sõltuvat kolesterooli väljavoolu. Tõhususe testimine proteinuurse neeruhaiguse hiiremudelites (adriamütsiinist põhjustatud nefropaatia ja Alporti sündroom) näitas, et Cpds A ja G normaliseerivad proteinuuria ning vähendavad oluliselt neerufibroosi ja neerufunktsiooni langust. Need tulemused näitavad, et väikese molekuliga ravimid, mis on suunatud OSBPL7-le, pakuvad alternatiivset lähenemisviisi ABCAl aktiivsuse ülesreguleerimiseks ja võivad kujutada endast tõhusat ja ohutut uut ravistrateegiat neeruhaiguste raviks.

Tulemused

5-arüülnikotiinamiidide kui ABCA1 indutseerijate avastamine. Tegime fenotüübilise skriinimise, kasutades kolesterooliga koormatud inimese makrofaage (THP1 rakke), et tuvastada ühendeid, mis on võimelised stimuleerima kolesterooli väljavoolu rakuvälisesse apoAI-sse. Tuvastasime uue plii seeria, mida esindab 5-arüülnikotiinamiidühend H (Cpd H). Cpd H suurendas radiomärgistatud kolesterooli väljavoolu kõige tõhusamalt lipiidide vaesesse HDL-i (HDL3) või apoAI-sse, mis viitab sellele, et seda toimet vahendab ABCA1 (joonis la). Cpd H pärineb varasemast metaboolsete häirete raviks mõeldud kannabinoidiretseptori tüüp 1 (CB1R) antagonistide ravimite avastamise programmist23. Selle struktuur ja tugevus CB1R-ga seondumisel on näidatud täiendaval joonisel 1 ja täiendaval tabelis 1.

Väljavoolukatsed viidi läbi inimese fibroblastidega, kellel oli Tangeri haigus24, ABCA1 geneetilisest kadumisest põhjustatud sündroom. Nii 5-arüülnikotiinamiidid Cpd H ja Cpd J kui ka LXR agonist T1317 suutsid suurendada kolesterooli väljavoolu apoAI-le normaalsetest, kuid mitte ABCA1-puudulikest fibroblastidest, mis näitab ABCA1 absoluutset vajadust. (Joonis 1b). Inimese THP1 makrofaagide lüsaatide Western blot analüüsid, mida töödeldi 5-arükotiinamiidide ja T1317-ga, näitasid, et kõik ained suurendasid raku ABCAl valku (joonis lc). Reaalajas kvantitatiivne PCR (RT-qPCR) näitas, et T1317 reguleeris ABCAl mRNA-d ~5- korda (joonis 1d), samas kui Cpd H ja Cpd J kuni 25 uM ei näidanud mingit mõju. Need andmed näitavad ühiselt, et 5-arüülnikotiinamiidid reguleerivad ABCA1 valku ja kolesterooli väljavoolu mittetranskriptsioonilise mehhanismi kaudu.

OSBPL7 tuvastamine 5-arüülnikotiinamiidide sihtmärgina. Me oletasime, et Cpd H aktiivsus ABCAl indutseerimisel võib olla sihtmärgist erinev toime, kuna sõltumatute CB1R ligandide ABCAl aktiivsus puudub. Siht-dekonvolutsiooni jaoks sünteesiti Cpd H derivaat fotoaktiveeritava asiidi funktsionaalsusega ja hinnati kolesterooli väljavoolu aktiivsust. See derivaat, Cpd K (5-(4-asido-3-klorofenüül)-6-(tsüklopropüülmetoksü)-N-[(1R,2R)-2-hüdroksütsükloheksüül]{ {11}}püridiinkarboksamiid), oli sama aktiivne kui Cpd H, et reguleerida ABCA1 väljavoolu in vitro (joonis 2a), kuid selle afiinsus hCB1R suhtes vähenes enam kui 200- korda. Cpd K asiidrühm võimaldab sellel UV-valgusega kokkupuutel kovalentselt ristsiduda lüsiinijääkidega. Cpd K kasutati sondina valgu sihtmärgi(te) tuvastamiseks.

Kandidaatsihtmärkide tuvastamiseks viisime esmalt läbi globaalse ekraani ühendi püüdmise massispektromeetria (CC-MS) abil. CC-MS-i tuvastatud valgud töötati välja teiste kandidaatide lisamisega, lähtudes nende osalemisest ABCA1 rajas, mille tulemuseks oli kuuskümmend üheksa huvipakkuvat sihtmärki. Saadi plasmiidid, mis ekspresseerisid igaüks C-terminaalse FLAG-märgisega täispika valguna. Plasmiidid transfekteeriti individuaalselt HEK293 rakkudesse ja inkubeeriti seejärel 3H-Cpd K juuresolekul, millele järgnes UV ristsidumine in situ, rakulüsaatide valmistamine, immunosadestamine anti-FLAG antikehaga ja seejärel paralleelne Western blot valgu ekspressiooni kinnitamiseks. ja autoradiograafia, et hinnata3H-Cpd K seondumist (joonis 2b). Nelikümmend üheksa kandidaati, sealhulgas ABCAl ise, elimineeriti esimesel ekraanil ristsidumise puudumise tõttu 5H-Cpd K-ga (joonis 2c). Kaheksa kandidaati said positiivse tulemuse interaktsiooni Cpd K-ga. Nende hulka kuulusid OSBPL7, CB1R, SCARB1, CAV1, ABCG4, ELOV1, TSPO ja STT3A (joonis 2c). Et hinnata, kas3H-Cpd Kbinding oli spetsiifiline, viisime läbi konkurentsikatsed ristsidumise teel. märgistamata Cpd K 50-kordse liia juuresolekul. Märgistamata Cpd K konkureeris tõhusalt 3H-Cpd K seondumise pärast OSBPL7 ja CB1R-ga, kuid mitte ülejäänud kuue kandidaadiga, kõrvaldades need mittespetsiifiliste sideainetena. Kordasime katset, et teha kindlaks, kas Cpd A ja Cpd G, mis mõlemad on tõhusad ABCAl-sõltuva kolesterooli väljavoolu esilekutsumiseks, konkureerivad3H Cpd K seondumise pärast OSBPL7-ga. Nii Cpd A kui ka Cpd G olid tõhusad konkurendid, mis näitab, et nad suhtlevad ka OSBPL7-ga (joonis 2d, täiendav joonis 2). Et suurendada usaldust OSBPL7 vastu, lisasime kolmanda filtri, hinnates 12 struktuurselt sarnase molekuli pluss rimonabanti komplekti (Cpds A, G, H, J, K, L, M, N, P, Q, R, S ). Näidati, et seitse ühendit reguleerivad ABCAl-vahendatud kolesterooli väljavoolu üles, ülejäänud viis ja rimonabant olid aga mitteaktiivsed (joonis 3a). Leidsime, et nende molekulide aktiivsus ABCAl väljavoolu stimuleerimisel korreleerus nende võimega konkureerida 3H-Cpd K seondumise eest OSBPL7-ga. See positiivne "aktiivsuse-aktiivsuse" seos OBPL7 seondumise vahel konkurentsianalüüsis ja ABC Al aktiivsuse ülesreguleerimisega viitab tugevalt sellele, et OSBPL7 on nende ABCAl-i indutseerivate väikeste molekulide farmakoloogiliselt oluline sihtmärk.

A potential contribution of CBIR remained, however, rimonabant, a structurally unrelated CBIR antagonist, did not induce ABCAl cholesterol efflux (Fig. 3a; Fig. 4a). Several other CBIR agonists/antagonists including AM251, WIN55-212-2, and arachidonic choloroethylamine (ACEA), were also inactive (Fig. 4a). Cpd A and Cpd G carried forward into animal studies, were active to induce ABCAl and to compete for Cpd K binding to OSBPL7, but had either no(Cpd A; Ki hCBIR=>10,000 nM) või madal (Cpd G; Ki hCBIR=13,20 nM) seondumisafiinsus CB1R-ga (joonised 2d ja 3a).

Tegime siRNA knockdowni katseid. OSBPL7 siRNA transfektsioon vähendas mRNA-d ligikaudu 60% võrra, stimuleerides kolesterooli väljavoolu olulist 50% suurenemist (joonis 4b, d). Seevastu CBIR-i vaigistamine vähendas mRNA-d ~80 protsenti, kuid ei mõjutanud kolesterooli väljavoolu ega mõjutanud Cpd G aktiivsust (joonis 4c-e). Need andmed kinnitavad OSBPL7 rolli ja välistavad CBIR-i 5-arüülnikotiinamiidide kolesterooli väljavoolu aktiivsuse vahendamisel.

Homoloogia modelleerimine näitab ühendeid, mis hõivavad OSBPL7 sidumistasku. Oksüsterooli siduva valguga seotud valgud, sealhulgas OSBPL7, sisaldavad väga konserveerunud oksüsterooli regulatoorset domeeni (ORD) oma karboksüotsas 2526. Ligandiga seonduva tasku ennustamiseks lõime OSBPL7 (UNIPROT: Q9BZF2) homoloogiamudeli, kasutades SVEITSI MUDELI veebiserver27(joonis 3c). Inimese ORP{11}}ORD kristallstruktuuril on kompleksis kolesterooliga homoloogia 42,5 protsenti ja seda kasutati mallina28. Esialgne mudel viidi esmalt miinimumini molekulaarmodelleerimispaketi abil PEAAEGU, et eemaldada võimalikud aatomite kokkupõrked, ja seejärel optimeeriti dokkimisarvutuste tegemiseks, kasutades Schrodingeri molekulaarse modelleerimise komplekti utiliiti "valgu ettevalmistamise viisard"29.30. Selline lähenemine tagas õige arvu vesinikuaatomite olemasolu, kõik aatomid on identifitseeritud, valgu puuduvad osad, mida ei olnud võimalik modelleerida, tuvastada ja lõpuks, et saab määrata kõikide aminohapete õige protoneerimisoleku.

Mudeli põhjal tuvastasime peamised aminohappejäägid, mis eeldatavasti vooderdavad OSBPL7 ligandi siduvat taskut, ja tutvustasime rea üksikuid mutatsioone. Iga mutant transfekteeriti rakkudesse ja testiti H-Cpd K seondumise suhtes. Lüsiini 636 mutatsioon alaniiniks vähendas Cpd K võimet ristsiduda OSBPL7-ga ~75 protsenti (joonis 3b). See näitas, et Cpd K seondub ennustatud steroolide sidumistaskus ja tähendab, et Lys636 on oluline selle kovalentse interaktsiooni jaoks OSBPL7-ga. Homoloogiamudel ennustab ka, et hüdrofoobne beeta-leht ääristab taskut, mis on määratletud aminohapetega, mis on konserveerunud teiste OSBP-de (Ile641, Val616, Val618 ja Lys636) ORD-des. Ile641 mutatsioon Ala vastu vähendas Cpd K seondumist; mis viitab sellele, et Cpd K hõivab kogu tasku (joonis 3b, täiendav joonis 3 ja joonis 3c). Val616 või Val618 asendamine Ala-ga vähendas samuti Cpd K seondumist, samas kui konservatiivsed asendused, nagu Val619lle ja Ile641Val, olid talutavad (joonis 3b, c). Need andmed näitavad, et ühend K seondub tihedalt OSBPL7 ennustatud steroolide sidumistaskus.

Seejärel viisime läbi ligandide dünaamilised dokkimissimulatsioonid OSBPL7 mudeliga, kasutades programmi Glide (Glide, Schrodinger, LLC, New York, NY, 2019)30. Määrati ruudustik, mille välimine kast on 30 A ja sisemine kast 10 A, mis oli tsentreeritud iga ligandi ümber ja mis olid praktiliselt koos matriitsiga kristallitud. Kuna Lys636 mängib võtmerolli Cpd K seondumisel OSBPL7-ga, analüüsiti selle jäägi orientatsiooni hoolikalt Maestro rotameeride valiku tööriista abil. Kõige tõenäolisemaks leiti kaks rotameeri; üks on orienteeritud seondumiskohale ja teine ​​valgu sisemuse poole. Kuna teine ​​orientatsioon ei võimaldanud koostoimeid ühenditega, valiti dokkimisuuringuteks Lys636 esimene rotameeriline olek.

Ühendi dokkimine viidi läbi ülitäpse protseduuri ja punktifunktsiooni (GlideScoreXP) abil.. Iga molekuli jaoks tuvastati GlideScore'i abil parim dokkimislahendus. Üksikute molekulide arvutatud sidumisenergiad on näidatud joonisel 3a. OSBPL7-ga seonduvate molekulide keskmine punktisumma on -8,2 kcal/mol, samas kui valguga mitteseonduvate või halvasti seonduvate molekulide keskmine on kõrgem;-6,8 kcal/mol. See näitab, et erinevate pooside energiad kajastavad kvalitatiivselt erinevate molekulide seondumisastet. Aktiivse Cpd M seondumine on näidatud joonisel 3c (vasak paneel), samas kui ühendi R parim poos, millel ei olnud aktiivsust, on näidatud joonisel 3c (parem paneel). Mõlemad ühendid teevad Lys636-ga selge T-katiooni interaktsiooni. Kuid R, millel on kõrgem GlideScore, sobib vähem hästi, kuna 4-püridiinitsükli metüülrühm on positiivselt laetud Arg550-le liiga lähedal. Samuti võrdlesime OSBPL7 mudelit ORP1-ORD (oksüsteroolituvastusdomeen) struktuuriga kompleksis kolesterooliga (pdb kood 5zm5). Me täheldasime, et I64 vastab V712-le ja et K636 vastab N707-le (joonis 3d). ORP1-ORD/kolesterooli kompleksi visuaalne kontroll näitab, et need kaks jääki puutuvad kokku substraadiga ja, eriti N707 puhul, moodustavad kolesterooliga H-sideme, aidates oluliselt kaasa seondumisele. Arvestades valiini ja isoleutsiini sarnaseid füüsikalis-keemilisi omadusi ning säilinud võimet moodustada lüsiini H-sidemeid asparagiini suhtes, on mõistlik järeldada, et I641 ja K636 annavad sarnase panuse kolesterooli seondumisse OSBPL7 ORD-ga.

5-arüülnikotiinamiid suurendab ABCAL-i kultiveeritud inimese podotsüütides. 5-arüülnikotiinamiidide seeriast uuriti Cpds A ja G mõju ABCAl ekspressioonile ja kolesterooli väljavoolule neeru podotsüütides, võrreldes LXR agonistiga Cpd C. Cpd C on samasse heksafluoroisopropanooli klassi tugevam LXR agonist. molekulidest kui T131731. ABCA1 ekspressiooni analüüsiti Western blot meetodil podotsüütide täisrakulüsaatides pärast ravimiravi. ABC Al indutseerijad Cpd G (joonis 5 vasak paneel, täiendav joonis 4a, c) ja Cpd A (joonis 5a parem paneel, täiendav joonis 4b, d) suurendasid oluliselt ABC Al valgu taset vastavalt kontsentratsioonidel 10 uM ja 5 uM , kuid vähemal määral kui LXR agonist Cpd C.

Seejärel mõõtsime apo Al-vahendatud kolesterooli väljavoolu podotsüütidest (joonis 5b). Cpd G, Cpd A ja Cpd C suurendasid märkimisväärselt apo Al-vahendatud kolesterooli väljavoolu vastavalt 10 μM, 5 μM ja 1 μM juures ligikaudu samal määral; 2-volditud vs. töötlemata rakud. Huvitaval kombel oli Cpd G ja Cpd A poolt indutseeritud väljavoolu suurenemine sarnane LXR agonisti Cpd C indutseeritud suurenemisega, vaatamata sellele, et viimane põhjustas WB katses koguraku ABCAl valgu kõrgema taseme (joonis 5a). Tegime rakkude fraktsioneerimise katseid, et hinnata ABCAl-i subtsellulaarset jaotumist pärast ravimiravi (joonis 5c, d, täiendav joonis 5). Need katsed näitasid, et 5-arüülnikotiinamiidid (Cpds G ja A) suurendasid ABCAl-i plasmamembraanis (joonis 5c), kuid erinevalt LXR agonistist ei suurendanud nad ABCAl-i mikrosomaalsetes fraktsioonides (joonis 5d). Organellivabas tsütosoolfraktsioonis ABCAl ei tuvastatud (täiendav joonis 5, parem paneel). Need tulemused viitavad sellele, et Cpd A ja Cpd G võivad stabiliseerida ABCAl plasmamembraanil.

Küsimuse lahendamiseks, kas ABC Al ja OSBPL7 füüsiliselt interakteeruvad, teostasime kaasimmunosadestamise (co-IP), transfekteerides HEK293 rakke plasmiididega, mis konstitutiivselt üleekspresseerivad OSBPL7-V5 ja ABCA1-FLAG-märgistatud valke. . Kasutasime ABCAl ja seotud valkude immunosadestamiseks anti-FLAG helmeid, mis eraldati SDS-PAGE-ga ja Western blot analüüsiti antikehadega, et tuvastada ABCAl ja OSBPL7-V5. Kuigi mõlemad valgud olid üleekspresseeritud ja me suutsime ABCAl-FLAG-i immunosadestada, ei tuvastanud me nendes katsetingimustes OSBPL7-V5 (täiendav joonis 6).

OSBPL7 ekspresseeritakse neeru podotsüütides. Western blot analüüs viidi läbi inimese podotsüütide ja neerukoe lüsaatides. Leidsime, et OSBPL7 esineb inimese neerudes ja inimese podotsüütides, aga ka teistes inimese rakuliinides (Caco2, HepG2, THP1 ja HEK293) (joonis 5e, täiendav joonis 7). Neerude ristlõigete immunovärvimine näitas, et OSBPL7 ekspresseerub neerukoores, sealhulgas glomerulites, kus see kolokaliseerub sünaptopodiiniga, podotsüütide spetsiifilise markeriga (joonis 5f).

Cpds G ja A vähendavad neerukahjustusi adriamütsiini poolt indutseeritud nefropaatia korral. Kokku sünteesiti ja hinnati THPI raku väljavoolu testides umbes 180 5-arüülnikotiinamiide. Nendest molekulidest valiti in vivo uuringute jaoks Cpds G ja A. See põhines ABCAl kolesterooli väljavoolu aktiivsusel, metaboolsel stabiilsusel roti ja inimese maksa mikrosoomides, madalal tsütokroom P450 interaktsioonipotentsiaalil ja madalal potentsiaalil kovalentsete valkudega seondumiseks. Need andmed ja Cpd G roti ühekordse annuse farmakokineetika on kokku võetud lisateabe tabelis S2. Cpd G ja Cpd A testiti adriamütsiini (ADR) indutseeritud neeruhaiguse mudelis. ADR-nefropaatia peegeldab proteinuurilist neeruhaigust ja on fokaalse segmentaalse glomeruloskleroosi (FSGS) kõige levinum eksperimentaalne mudel. ADR-mudeli peamisteks tunnusteks on sügav proteinuuria, kaalulangus ja FSGS-i meenutavad glomerulaarsed histoloogilised muutused32,3.

Tegime annuse leidmise uuringud efektiivsuse esialgseks hindamiseks ja annuse valikuks järgnevateks uuringuteks. ADR-ga nakatunud Balb/c hiiri raviti suukaudse sondiga ühendiga A või G annuses 30mg/kg või 100mg/kg üks kord päevas, alustades ühepäevasest päevast. -ADR süst. Võrdlusena kasutati LXR agonisti Cpd C annuses 10 mg/kg (täiendav joonis 8). Neerukahjustuse esilekutsumiseks manustati adriamütsiini annuses 12 mg/kg kehakaalu kohta. Uriini albumiini ja kreatiniini suhe (ACR) ja kehakaal määrati 7., 14., 21. ja 28. päeval pärast süstimist. ADR-ga nakatunud hiirtel ilmnes kõigil ajahetkedel tõsine mööduv proteinuuria ja kehakaalu langus. ACR väärtused paranesid oluliselt loomadel, keda raviti 30 mg/kg/päevas või 100 mg/kg/päevas Cpd A või 100 mg/kg Cpd G-ga ja vähemal määral 30 mg/kg Cpd G-ga (täiendav joonis 1). 8). Neerukoore lõikude immunofluorestsentsmikroskoopia näitas ADR-indutseeritud glomerulaardegeneratsiooni koos podotsüütide kadu ja ABC Al ekspressiooni kadumisega. Kõik need mõjud hoiti ära raviga Cpd G-ga (täiendav joonis 9). Pilootuuringu põhjal määrati Cpd A ja Cpd G optimaalseteks raviannusteks vastavalt 30 mg/kg/päevas ja 100 mg/kg/päevas. Teises uuringus kasutati suuremat arvu loomi ning albumiini ja kreatiniini suhe määrati 28 päeva pärast ravi (joonis 6a). Kooskõlas esialgsete tulemustega tekkis ADR-iga nakatatud hiirtel (ADR pluss V) tõsine proteinuuria. Ravi Cpd A-ga (ADR pluss A) (joonis 6a, vasakul) ja, mis veelgi silmatorkavam, Cpd G-ga (ADR pluss G) (joonis 6a, keskmine), näitas vastavalt 8 ja 30 korda madalamat ACR-i keskmise IQR-iga 2,3 (03-12mg albumiini/mg kreatiniini) Cpd A puhul ja 0,6 (01-3,6 mg albumiini/mg kreatiniini) Cpd G puhul. ADR-ga nakatunud kontrollhiirte IQR mediaan oli 19 (10-72 mg albumiini/mg kreatiniini). LXR agonisti Cpd C-ga ravitud hiirtel ilmnes ACR varieeruvam vähenemine (joonis 6a, paremal). Cpd A (joonis 6b, vasakul) ja Cpd G (joonis 6b, keskmine) vähendasid samuti oluliselt kaalulangust. 28-päeva jooksul pärast ADR-i väljakutset kaotasid vehiiklirühma hiired kuni 30 protsenti kehakaalust. Seevastu 7 hiirt 10-st, kes said Cpd G-d, ei näidanud kaalulangust, ülejäänud 3 hiire puhul oli see vaid väike, alla 5 protsendi (joonis 6b, vasakul). LXR agonist Cpd C ei avaldanud olulist mõju kaalulanguse ennetamisele (joonis 6b, paremal).

Kuna Cpd G-l oli suurim efektiivsus proteinuuria ja kaalukaotuse vähendamisel, teostasime neerulõikude histoloogilise analüüsi (joonis 6c). ADR-i väljakutse kutsus esile ulatuslikke histoloogilisi muutusi, sealhulgas suurel määral fokaalset ja segmentaalset glomeruloskleroosi, millega kaasnesid torukujulised mikrotsüstid, interstitsiaalne põletik ja mesangiaalne laienemine (joonis 6d). Cpd G vähendas oluliselt globaalset ja segmentaalset glomeruloskleroosi, podotsüütide hüpertroofiat ja hüperplaasiat ning tubulaarseid mikrotsüste ja interstitsiaalset põletikku (joonis 6d). Cpd G nüristas ka ADR-indutseeritud põletikku, mida peegeldavad vähenenud IL1 ja MCP-1 neerukoores (täiendav joonis 10). Need andmed näitavad, et Cpd G on väga tõhus FSGS-i tunnuste vähendamisel, eelkõige parandades ACR-i ja hoides ära ADR-indutseeritud kehakaalu languse (joonis 6).

Effects of Cpd G on plasma parameters and renal and liver lipids. Plasma lipids, hematological parameters, and liver trans-aminase levels were evaluated in all groups after 28 days of treatment. No significant differences in plasma total cholesterol or triglycerides were found. However, sporadically high cholesterol levels (>122mg/dL, 99.5th percentile of the healthy control group) were detected in 50% of ADR-challenged animals that received the vehicle,10% that received Cpd A,33% that received Cpd C, and none that received Cpd G (Supplementary Fig. lla, Supplementary Table 3). Hypercholesterolemia was observed only in mice with particularly severe proteinuria (ACR>15 mg albumiini/mg kreatiniini). Muutusi triglütseriidide tasemes ei täheldatud (täiendav joonis 11b). Hematokriti, hemoglobiini, valgete vereliblede arvu ning ALAT ja AST väärtused on näidatud laiendatud andmete tabelis 2. Vererakkude arvus erinevusi ei tuvastatud. Adriamütsiinravi suurendas ALAT ja AST aktiivsust, mida Cpd G osaliselt nõrgendas (täiendav tabel 4). Üldkolesterooli ja triglütseriidide sisaldus neerukoores jäi muutumatuks, kuigi kõrgemat triglütseriidide sisaldust täheldati umbes 30 protsendil loomadest, kes said LXR agonisti Cpd C (täiendav joonis 11c, d). Maksa üld- ja esterdatud kolesterooli (CE) tase jäi samuti ADR-i põdevatel loomadel muutumatuks. (Täiendav joonis lle, f). ADR-probleemist tingitud maksa triglütseriidide sisalduse vähenemist tõrjus uimastiravi. Cpd A ja Cpd C, kuid mitte Cpd G, suurendasid maksa triglütseriidide sisaldust võrreldes kandjaga töödeldud kontrollidega (täiendav joonis 11g).

Cpd G vähendab neerupuudulikkust Alporti sündroomi hiiremudelis. Paljud perekondliku steroidresistentse FSGS ja muud kroonilise neeruhaiguse vormid on põhjustatud Col IV geenide mutatsioonidest34-36. Hiljuti teatasime AS13 hiiremudeli Col4a3 knockout hiirte (Col4a3 KO) vähenenud ABCA ekspressioonist glomerulites. Col4a3 knockout hiired ei ekspresseeri IV tüüpi kollageeni. Nendel hiirtel tekib alates 4. elunädalast raske albuminuuria, kõrge vere uurea lämmastikusisaldus (BUN) ja seerumi kreatiniinisisaldus, mis areneb kiiresti lõppstaadiumis neeruhaiguse (ESRD) suunas. Loomad surevad neerupuudulikkusesse 8 nädala vanuseks37.

Cpd G (100 mg/kg) või vehiiklit manustati Col4a3 KO hiirtele suukaudse sondiga iga päev, alates 4 nädala vanusest, kui hiirtel ilmnesid esmakordselt neerupuudulikkuse nähud. Ravi jätkati 4 nädalat ja ellujäänud hiired surmati 8 nädala vanuselt. Albuminuuria (joonis 7a), seerumi kreatiniinisisaldus (joonis 7b), vere uurea lämmastik (joonis 7c) ja kaalukaotuse ulatus (joonis 7d) vähenesid oluliselt Col4a3 KO hiirtel, keda raviti Cpd G-ga. loomadel, kes said ramipriili eelnevast võrdse ülesehitusega uuringust38, vähenes albuminuuria oluliselt Cpd G-d saanud loomadel ning Cpd G mõju BUN-ile ja seerumi kreatiniinile ei olnud ramipriilist halvem (täiendav joonis 12). Neerulõikude histoloogiline analüüs näitas oluliselt vähem mesangiaalset laienemist Cpd G-ga töödeldud hiirtel (joonised 7e, f). Cpd G ei mõjutanud seerumi kolesteroolitaset (täiendav joonis 13a), kuid kaldus vähendama seerumi triglütseriide (täiendav joonis 13b). Cpd G ei mõjutanud üldkolesterooli ega triglütseriidide sisaldust neerukoores (täiendav joonis 13c, d).

Et uurida, kas Cpd G võib olla kasulik kaugelearenenud neerupuudulikkuse korral, viisime läbi suremusuuringu, kus ravi Cpd G või platseeboga alustati 6 nädala vanuselt, mil on tekkinud märkimisväärne neerupuudulikkus. Leidsime, et Cpd G vähendas Col4a3 KO hiirte suremust, mille tulemuseks oli kontrollrühmaga võrreldes pikenenud eluiga ligikaudu 15 protsenti (joonis 7g).

Cpd G vähendas neerude kolesterooli estri sisaldust mõlemas haigusmudelis. Glomerulaarne kolesterool ja lipiidide akumuleerumine on teadaolevalt seotud neeruhaiguse progresseerumisega7-10,12-14 Neerukoored hiirtelt, kes said pärast ADR-i nakatamist kandjat, kuid mitte nende hiirte, kes said Cpd G-d, näitasid lipiiditilgad, eriti glomerulites, ja kolesterooli estri sisalduse märkimisväärne suurenemine (joonis 8a, b). Suurenenud kolesterooli estri sisaldus korreleerus tugevalt albuminuuriaga (joonis 8c). Cpd G vähendas oluliselt ka kolesterooli estri sisaldust Col4a3 KO hiirte neerudes (joonis 8d). Vaatamata kolesterooli estri vähenemisele neerudes, ei muutunud plasma kolesteroolisisaldus Col4a3 hiirtel ja ainult umbes 50 protsendil ADR-hiirtel (täiendav joonis lla ja täiendav joonis 13a). Need andmed viitavad sellele, et Cpd G võib olla kaitsev, vähendades kolesterooli ja lipiidide sisaldust neerudes.