CaWRKY30 reguleerib positiivselt paprika immuunsust, sihtides CaWRKY40 Ralstonia Solanacearum'i inokulatsiooni vastu kaitsega seotud geenide moduleerimise kaudu, 2. osa

2.5. CaWRKY30 mööduv üleekspressioon stimuleeritud HR-sarnane rakusurm, H2O2 tootmine ja immuunsusega seotud markergeenide transkriptsiooniline ülesreguleerimine

VIGS-i katsed näitasid, et CaWRKY30 reguleerib positiivselt pipra immuunsust RSI suhtes. Mööduvad üleekspressioonikatsed viidi läbi 35S:00 (EV) või 35S: CaWRKY30 kandvate GV3101 rakkude infiltreerimisega paprika lehtedesse selle spekulatsiooni edasiseks kinnitamiseks. Uurisime CaWRKY30 mööduva üleekspressiooni rolli HR-sarnase rakusurma ja H2O2 akumulatsiooni esilekutsumisel paprikataimedes. CaWRKY30 ekspressioon paprikataimedes määrati kindlaks Western blot katsetega (joonis 5A).

HR-sarnast rakusurma ja H2O2 akumuleerumist kinnitati vastavalt trüpaansinise ja DAB värvimisega. Tulemused näitasid, et CaWRKY30 mööduv üleekspressioon põhjustas HR-sarnase rakusurma ja H2O2 akumuleerumise paprika lehtedes, mis väljendus tumedamas trüpaansinise värvumises ja tumepruuni DAB värvimises (joonis 5B). Juhtivus viidi läbi CaWRKY30 mööduvast üleekspressioonist põhjustatud rakunekroosi intensiivsuse uurimiseks ja tulemused näitasid, et CaWRKY30 mööduvalt üleekspresseerivad pipralehed näitasid 24 ja 48 tundi pärast agroinfiltratsiooni rohkem ioonide lekkeid võrreldes paprika lehtedega. väljendades tühja vektorit (joonis 5C). Kaitsega seotud markergeenide, nagu ET-biosünteesiga seotud CaPR1, SA-ga seotud CaNPR1, ABA-le reageeriv CaABR1 ja HR-ga seotud markergeen CaHIR1 suhtelised transkriptsiooni ekspressioonitasemed tuvastati qRT-PCR analüüsiga.

Meie tulemused näitasid, et CaWRKY30 mööduv üleekspressioon pipralehtedes võimendas märkimisväärselt CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 ja CaHIR1 transkriptsioonilist akumuleerumist pipras, võrreldes tühjade vektori paprikataimede mööduva üleekspresseerimisega 48 dpi juures (joonis 5D). Need tulemused näitavad, et CaWRKY30 toimib taime HR-sarnase rakusurma, H2O2 tootmise ja immuunsusega seotud markergeenide transkriptsioonilise ülesreguleerimise positiivse regulaatorina.

Joonis 5. CaWRKY30 indutseeritud HR-sarnase rakusurma mööduv üleekspressioon, H2O2 akumuleerumine ja immuunsusega seotud markergeenide ekspressioon paprika lehtedes. CaWRKY30-lipu edukat üleekspressiooni kinnitas Western blot katse (A), HR-sarnane rakusurm, mille põhjustas 35S mööduv üleekspressioon: CaWRKY30, mida kinnitas fenotüübi tuvastamine, kokkupuude UV-valguses ja DAB ja Trypan Blue värvimine vastavalt 48 hpi; Skaalariba=50 µm (B), elektrolüütide lekke (ioonijuhtivuse) mõõtmine, et hinnata rakusurma reaktsiooni paprika lehtede ketastes vastavalt 24 ja 48 tundi pärast agroinfiltratsiooni (C), qRT-PCR test kontrollige immuunsusega seotud markergeenide, sealhulgas CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 ja CaHIR1, transkriptsiooni ekspressioonitasemeid 35S-s: CaWRKY30 ekspresseeris pipra lehti vastavalt 48 dpi juures (D). Teadaolevate kaitsega seotud markergeenide suhteline ekspressioonitase tühja vektorit ajutiselt üleekspresseerivates pipralehtedes määrati väärtusele "1". Andmed, mis esindavad nelja bioloogilise korduse keskmisi ± SE. Vearibad on vahendite standardvead. Erinevad tähed tulpade kohal näitavad olulisi erinevusi vahendite vahel.

2.6. CaWRKY30 ja CaWRKY40 vahelised suhted

On teatatud, et erinevad WRKY TF-id moodustavad koos võrke ja varem teatasime, et WRKY TF-ide erinevad liikmed, st CaWRKY6, CaWRKY22 ja CaWRKY40, on üksteisega väljenduslikult ja funktsionaalselt seotud. Seetõttu oletame, et CaWRKY30 võib olla seotud teiste WRKY perekonna liikmetega, sealhulgas CaWRKY40-ga, mis on paprika RSI-vastase immuunsuse positiivne regulaator. QRT-PCR analüüs viidi läbi CaWRKY40 võimaliku tagasiside reguleerimise edasiseks uurimiseks CaWRKY30 poolt ja CaWRKY30 võimaliku modulatsiooni uurimiseks CaWRKY40 mööduva üleekspressiooni testiga või CaWRKY40 vaigistamisel VIGS-i abil.

CaWRKY40 on WRKY transkriptsioonifaktor, mis osaleb taimede reaktsioonides erinevatele biootilistele ja abiootilistele stressidele. Uuringud on näidanud, et CaWRKY40 indutseeritakse tomatites ja see võib suurendada taimede vastupidavust põua ja madala temperatuuriga töötlemise korral. Lisaks selgus uuringust ka, et CaWRKY40 üleekspressioon võib parandada tomatite põuakindlust ja leevendada soolastressist põhjustatud kasvu pärssimist, kuid resistentsus patogeenide suhtes vajab täiendavat uurimist. Seetõttu mängib CaWRKY40 olulist rolli taimede immuunvastuses ja sellel on teatav potentsiaal põllumajandusliku saagikuse suurendamiseks. Samal ajal peame pöörama tähelepanu ka oma immuunsusele. Meie keha immuunsus on väga oluline. Cistanche mõjutab oluliselt immuunsust. Cistanche on rikas mitmesuguste antioksüdantsete ainete poolest, nagu C-vitamiin, C-vitamiin, karotenoidid jne. Need koostisosad võivad eemaldada vabu radikaale, vähendada oksüdatiivset stressi ja parandada immuunsüsteemi vastupanuvõimet.

Klõpsake cistanche deserticola toidulisand

Meie tulemused väljendasid CaWRKY30 transkriptsioonitaset pipralehtedes, mis CaWRKY40 ajutiselt üleekspresseerivad, 24 ja 48 hj juures võrreldes taimedega, mis ekspresseerivad ajutiselt tühja vektorit (Joonis 6A), samas kui CaWRKY40 transkriptsioonitasemed tõusid nendes taimedes ajutiselt. üleekspresseerivad CaWRKY30, võrreldes taimedega, mis ekspresseerivad ajutiselt üle EV (joonis 6B). Vastupidiselt näitasid meie tulemused, et CaWRKY40 transkriptsiooniline kogunemine oli Ralstoniaga nakatunud CaWRKY{14}}vaigistatud taimedes võrreldes vaigistamata taimedega märkimisväärselt alla reguleeritud (joonis 6C). Lisaks suruti CaWRKY30 vaigistatud taimedes, mille käivitas CaWRK40, täielikult või osaliselt teadaolevate immuunsusega seotud markergeenide, nt CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 ja CaHIR1, transkriptsiooniline akumulatsioon (joonis 6D).

Need andmed näitavad CaWRKY40 transkriptsiooni reguleerimist CaWRKY30 poolt ja positiivse regulatsiooniahela olemasolu, mis hõlmab CaWRKY30 ja CaWRKY40.

Joonis 6. CaWRKY30 ja CaWRKY40 omavaheline seos. Transkriptsiooniline väljend lev. paprika lehtedes CaWRKY40 ajutine üleekspresseerimine ajaintervalliga 24 ja 48 dpi (A), CaWRKY30 transkriptsiooni ekspressioonitasemed paprika lehtedes, mis ajutiselt üleekspresseerivad CaWRKY40 intervalliga 24 ja 48 dpi (B), CaWRKY40 transkriptsioonilise ekspressioonitasemete gRT-PCR analüüs CaWRKY{16}}vaigistatud ja vaigistamata paprikataimedes 48 dpi juures (C)gRT-PCR testis kaitsega seotud markergeenide transkriptsioonitasemete kohta CaWRKY{21}}vaigistatud ja vaigistamata paprikataimed, mis 48 hpi (D) juures ajutiselt üleekspresseerivad 35S: CaWRKY40-HA ja 35S:00. Andmete keskmine pluss SE neljast bioloogilisest kordusest. Vearibad on vahendite standardvead. Erinevad tähed tulpade kohal näitavad olulisi erinevusi vahendite vahel.

2.7. CaWRY30 ja CaWRKY6, CaWRKY22 ja CaWRKY27 omavaheline seos

Meie varasemates uuringutes tuvastati, et CaWRKY40 on ekspressiivselt ja funktsionaalselt seotud erinevate WRKY TF-idega, nagu CaWRKY6 ja CaWRKY22. CaWRKY30 ja CaWRKY40 vaheline seos näitab, et CaWRKY30 on tõenäoliselt seotud erinevate WRKY TF-idega, mis on seotud pipra immuunsusega RSI vastu. Selle oletuse kinnitamiseks viidi läbi qRT-PCR analüüs, et uurida seost CaWRKY30 ja erinevate WRKY TF-ide vahel, millest on varem teatatud, et need on seotud pipra immuunsusega RSI vastu, sealhulgas CaWRKY6, CaWRKY22 ja CaWRKY27. Meie tulemused näitasid, et CaWRKY30 transkriptsiooniline akumuleerumine võimendus CaWRKY6, CaWRKY22 jaCaWRKY27 ajutiselt üleekspresseerivates paprikataimedes 48 dpi juures (joonis 7A), samas kui CaWRKY6, CaWRKY22 ja lehtede transkriptsiooniline akumuleerumine suurendas ka CaWRKY22 ja lehtede transkriptsiooni. CaWRKY30 eraldusvõimega 48 dpi (joonis 7B). Meie qRT-PCR testi tulemused viitavad sellele, et CaWRKY30 ja CaWRKY6, CaWRKY22 ja CaWRKY27 on ekspressiivselt ja funktsionaalselt omavahel seotud.

3. Arutelu

WRKY valk on üks suurimaid taimede transkriptsioonifaktorite (TF) perekondi. On teada, et rühm WRKY TF-i perekonnaliikmeid, kes on teatatud taimedest Arabidopsis thaliana ja Oryza sativa, osalevad ja mängivad olulist rolli taimede immuunsuse reguleerimises. On teatatud märkimisväärsetest funktsionaalsetest erinevustest WRKY-de tihedalt struktuursete homoloogide vahel [17, 48] ja WRKY TF-ide funktsioone mittemudeltaimede, näiteks pipra immuunsuses, ei ole piisavalt uuritud.

CaWRKY30, rühma Ill WRKY geen, on käesolevas uuringus funktsionaalselt iseloomustatud. Tulemused näitasid, et CaWRKY30 reguleerib positiivselt pipra immuunsust RSl vastu ja see on CaWRKY6, CaWRKY22CaWRKY27 ja CaWRKY40 sisaldava WRKY veebi oluline koostisosa. CaWRKY30 takerdumist pipra immuunsusse kinnitavad patogeenile reageerivad cis-elemendid, sealhulgas CaWRKY30 promootorpiirkonnas esinevad TGA-element, TGACG-motifIATC-box, TATA-box ja W-box. See eeldus oli kooskõlas CaWRKY30 transkriptsioonitasemete ülesreguleerimisega pärast ja pärast eksogeenselt manustatud ETH, ABA ja SA [49,50].

Kuna teatud stressifaktoriga kokkupuutest põhjustatud geenid on sageli teadaolevalt seotud sellele stressile reageerimisega [51], oletasime, et CaWRKY30 võib positiivselt reguleerida pipra immuunsust RSI suhtes. Seda spekulatsiooni toetasid andmed CaWRKY30 vaigistamise kohta VIGS-i poolt ja CaWRKY30 mööduva üleekspressiooni test. Selle CaWRKY30 funktsiooni kadumisest tingitud vähenenud immuunsusega kaasnes RSI võimendatud kasv ja immuunsusega seotud markergeenide, nagu SA-sõltuv CaPR1 (52CaNPR1 [53], JA-ga seotud CaDEF1 (54), ABA-ga seotud CaABR1) allareguleerimine [55]. ] ja HR-ga seotudCaHIR1 (561. Teisest küljest vallandas HR-sarnase rakusurma ja HO sekretsiooni CaWRKY30 mööduv üleekspressioon, millega kaasnes immuunsusega seotud markergeenide nagu CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, transkriptsiooniline ülesreguleerimine, CaABR1 jaCaHIR1. See viitab CaWRKY30 rollile HR-sarnase rakusurma positiivse regulaatorina ja pipra immuunsuse RSI vastu. Samuti on varasemates uuringutes täheldatud, et AtWRKY30, CaWRKY30 homoloog Arabidopsises, reguleerib positiivselt taimede imm. -munitv biootiliste ja abiootiliste stresside vastu 157 581. Sellest võib järeldada, et CaWRKY30 on Ralstonia infektsiooni korral ülesreguleeritud, mis viib pipra haavatavuse vähenemiseni bakteriaalse patogeeni infektsiooni suhtes.

Fütohormoonid nagu ET, ABA ja SA on olulised signaalmolekulid, mis on seotud taimede reageerimisega patogeenide rünnakutele ja kõrge temperatuuriga stressile. Need on seotud ka taimede biootilisele ja abiootilisele stressile reageerimise vahelise läbirääkimisega [59]. SA õhutab resistentsust biotroofsete patogeenide vastu, samas kui ET mängib olulist rolli taimede immuunsuses nekrotroofsete patogeenide vastu [60]. Üldiselt on SA, ET ja JA süntees seotud PAMP-käivitatud immuunsusega (PTI) või efektor-käivitatud immuunsusega (ETI). Need fütohormoonid võivad oma rolli täita nii sünergistlikult kui ka antagonistlikult, lähtudes nende kontsentratsioonist kaitsesignaalide edastamise ajal [61]. PTI-s on tuvastatud sünergistlik seos nende kolme signalisatsioonielemendi vahel, samas kui ETI-s on tuvastatud kompenseeriv seos [62]. CaWRKY30 indutseeriti pidevalt eksogeenselt tarnitud fütohormoonide poolt. Tuntud SA-, ET- ja ABA-sõltuvad immuunsusega seotud markergeenid, nagu CaPR1, CaNPR1, CaDEF1 ja CaABR1, vähendati CaWRK30 vaigistamise teel; neid aga reguleeris CaWRKY30 mööduv üleekspressioon piprataimedes, mis näitab, et CaWRKY30 osaleb SA, ET ja ABA sünergistlikult vahendatud kaitsesignalisatsioonis, mis viib PTI-ni.

Kogu genoomi hõlmav analüüs näitas mitme WRKY TF-i osalust taimede immuunsuses [63–65]. Funktsionaalse genoomika uuringute põhjal WRKY1 [66], -11 [67], -17 [67], -18 [68], -22 [69], {{13} } [70], -28 [71], -33 [72], -38 [73], -40 [68], -45 [74], -46 [75], -53 [76], -54 [75], -60 [68], -62 [77], -70 [75] ja -75 [78] on funktsionaalselt iseloomustatud Arabidopsise immuunsuse osas, mis reguleerib immuunsust positiivselt või negatiivselt. Nendel WRKY TF-idel on soovitatud korraldada end WRKY transkriptsioonivõrguks, mis koosneb pluss-ve- ja -ve-tagasisideahelatest ning edasisaatmismoodulitest [12]. Nende WRKY võrkude konfiguratsioon on siiski halvasti mõistetav.

Varasemates uuringutes avastasime, et CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 ja CaWRKY40 on paprika RSI suhtes immuunsuse positiivsed regulaatorid [9,44,45], samas kui CaWRKY58 on negatiivne regulaator [46]. Käesolevast uuringust järeldatakse, et CaWRKY30 toimib positiivse regulaatorina pipra HR-taolises rakusurmas ja pipra vastuses R. solanacearum'i infektsioonile. CaWRKY30 transkriptsiooni ekspressioonitasemed olid CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 ja CaWRKY40 mööduva üleekspressiooni korral ülesreguleeritud. Vastupidi, CaWRKY30 mööduv üleekspressioon reguleeris CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 ja CaWRKY40 transkriptsioonilist akumulatsiooni, mis viitab WRKY TF-võrkude olemasolule ja lisaks veel tagasisideahelatele CaWRKY6, CaWRKYRKY22, CaWRKYRKY47 ja CaWRKY47. Samuti arvatakse, et taimede immuunsusega on seotud pluss ve tagasisideahelad [47]. Samasugune pluss-side tagasiside silmus on olnud CaWRKY40 ja CaWRKY6, CaWRKY40 ja CabZIP63, CaWRKY40 ja CaCDPK15 puhul. Varasemates uuringutes on leitud, et CaWRKY6 [44] ja CabZIP63 [16] on otseselt ja transkriptsiooniliselt seotud CaWRKY40 ekspressiooni reguleerimisega RSI vastu. Neid tulemusi silmas pidades võib oletada, et CaWRKY40 võivad koordineerida erinevad TF-id. Kokkuvõtteks võib öelda, et CaWRKY40 ekspressiooni reguleerivad CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY30 ja CabZIP63 RSI korral ning CaWRKY40 ekspressiooni reguleerivad CaWRKY6 ja CabZIP63, kuid mitte CaWRKY30 pipraga pärast kokkupuudet kõrgel temperatuuril.

4. Materjalid ja meetodid

4.1. Taimsed materjalid ja kasvutingimused

Paprikasordi 'Mexi' ja Nicotiana benthamiana seemned saadi Ayubi Põllumajanduse Uurimisinstituudist, Faisalabadist, Pakistanist. Paprika ja N. benthamiana seemned istutati plastpottidesse, milles oli mullasegu [turbasammal ja perliit; 2/1 (v/v)] ja hoitakse kasvuruumis kontrollitud tingimustes, st temperatuuril 25 ◦C, 60–70 µmol footoneid m−2 s −1 valguse intensiivsus ja 70% suhteline õhuniiskus 16 h valguse all/8 h tume fotoperiood.

4.2. Vektorite genereerimine

Vektorite genereerimiseks kasutati lüüsi kloonimise tehnikat. Satelliitvektorite konstrueerimiseks klooniti CaWRKY30 täispikk ORF (terminaalse koodoniga või ilma terminaalse koodonita) sisenemisvektorisse pDONR207, kasutades BP reaktsiooni. Seejärel kanti see konstrukt sihtvektoritesse pMDC83, CD3687 (HA-märgis), CD3688 (lipumärgis) ja Pk7WG2, viies läbi LR-reaktsiooni, et genereerida vektoreid vastavalt subtsellulaarseks lokaliseerimiseks ja üleekspressiooniks.

VIGS-i vektorite konstrueerimiseks valiti 364 bps fragment CaWRKY30 30 -transleerimata piirkonnas (UTR) ja spetsiifilisust kinnitati BLAST-iga genoomi järjestuse suhtes CM334 andmebaasis (http://peppergenome.snu. ac.kr/ (kasutatud 29. oktoobril 2021)) ja Zunla-1 (http://peppersequence.genomics.cn/page/species/blast. jsp (kasutatud 29. oktoobril 2021)). Järgmisena viidi läbi BP reaktsioon selle fragmendi kloonimiseks pDONR207/201-sse, pärast seda, kui see konstrukt viidi LR-reaktsiooni läbi vektorisse PYL279.

4.3. Patogeeni kasvu ja inokuleerimise protseduurid

Isoleerisime Pakistanist Dera Ghazi Khanist pärit Ralstoniaga nakatunud piprataimedest ühilduva virulentse R. solanacearum tüve. Tetrasooliumkloriidi meetodit kasutati patogeeniga nakatunud taimede maapealsete vaskulaarsete kudede eksudaatide puhastamiseks [9, 45]. Eraldatud R. solanacearum kultiveeriti SPA söötmes termokontrolli loksutis (200 g kartulit, 20 g sahharoosi, 3 g veiseliha ekstrakti, 5 g trüptooni ja 1 L topeltdestilleeritud H2O) kiirusel 200 p/min ja 28 ◦C. üle öö. Järgmisena tsentrifuugiti kultiveeritud R. solanacearum tüve kiirusel 6500 pm ja temperatuuril 28 °C 10 minutit. Pärast tsentrifuugimist valati vedel supernatant välja ja tsentrifuugitoru põhjas olevad pelletid lahjendati steriliseeritud 10 mM MgCl2 lahuses. Bakterirakkude tihedus reguleeriti väärtusele 108 cfu ml-1 (OD600=0.8).

RSI mõju uurimiseks CaWRKY30 transkriptsioonitasemetele ja paprikataimede resistentsusele R. solanacearum'i rünnakule infiltreeriti piprataimede ülemine kolmas leht ilma nõelata süstlaga 10 µl R. solanacearum'i lahusega. Patogeeniga töödeldud lehtede proovid koguti kindlatel ajahetkedel histokeemiliste värvimiskatsete (nt DAB värvimine või trüpaansinise värvimine), elektrijuhtivuse, cfu ja RNA ekstraheerimise jaoks rohkemate katsete jaoks. CaWRKY30-vaigistatud ja vaigistamata taimede fenotüpiseerimise katses vigastati juuri klaaspulgaga ja infiltreeriti kokkusobiva virulentse R. solanacearum'iga. Taimi hoiti kasvukambris kontrolltingimustes temperatuuril 28 ± 2 ◦C, valguse intensiivsusega 60–70 µmol footoneid m−2 s −1, suhtelise õhuniiskuse juures 70 protsenti ja 16-hlight/{{12 }}h tume fotoperiood pärast R. solanacearum'i inokuleerimist. Fenotüübi pildid jäädvustati pärast RSI-d teatud ajavahemike järel.

4.4. Fütohormoonide kasutamine lehtedel

Fütohormoonide mõju uurimiseks pihustati terveid piprataimi neljal lehefaasil 100 µM ETH, 100 µM ABA ja 1 mM SA-ga. Näidistaimi (kontroll) töödeldi steriilse ddH2O-ga. Fütohormoonidega töödeldud proovid koguti soovitud ajahetkedel RNA ekstraheerimiseks ja edasiseks uurimiseks.

4.5. CaWRKY30 sub-rakulise lokaliseerimise uurimine

Agrobacterium rakke, millel oli 35S: CaWRKY30-GFP või 35S: GFP (kontroll), kultiveeriti üleöö LB söötmes, mis sisaldas vastavaid antibiootikume. Kultiveeritud söödet tsentrifuugiti kiirusel 6500 p/min, vedel supernatant valati välja ja põhjas olev pellet lahjendati induktsioonisöötmes (10 mM MES, 10 mM MgCl2, pH 5,7 ja 150 uM atsetosüringoon) ja määrati väärtusele OD{{ 10}}.8. Agrobakterid, mis sisaldavad 35S: CaWRKY30-GFP ja 35S: GFP, süstiti N. benthamiana lehtedesse, kasutades ilma nõelata süstalt. Eelnevalt kirjeldatud meetodit kasutati 4,6-diamidino-2-fenüülindooli värvimiseks (DAPI) [9]. 48 hp juures täheldati GFP ja DAPI fluorestsentssignaale ning pildid jäädvustati laserskaneeriva konfokaalse mikroskoobiga (TCS SP8, Leica, Solms, Saksamaa), ergastuse lainepikkusega 488 nm ja ribalaiuse emissiooniga 505–530 nm. filter.

4.6. Histokeemiline värvimine

Histokeemiline värvimine (trüpaansinine ja 3, 30 - diaminobensidiin) viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [9, 11, 79]. Trüpaansinise värvimistesti läbiviimiseks keedeti pipra lehti trüpaansinise lahuses (10 ml piimhapet, 10 ml glütserooli, 10 ml fenooli, 40 ml etanooli, 10 ml ddH2O ja 1 ml trüpaansinist) 30 minutit. Seejärel hoiti lehti 8 tundi toatemperatuuril, sukeldati kloraalhüdraadi lahusesse (2,5 g kloraalhüdraati lahustati 1 ml destilleeritud vees) ja värviti 30 minuti jooksul keetmisega. Fooni vähendamiseks muudeti kloorhüdraadi lahust mitu korda ja seejärel paigaldati proovid 70-protsendilisesse glütserooli. Lehed asetati DAB värvimise testi jaoks üleöö 1 mg/ml DAB lahusesse. DAB-värvitud lehti keedeti piimhappes: glütseroolis: absoluutses etanoolis [1:1:3 (maht/maht)] ja seejärel värviti üleöö absoluutses etanoolis [80]. Trüpaansinise ja DAB-värvitud lehtede pildid tehti kaameraga ja valgusmikroskoobiga (Leica, Wetzlar, Saksamaa).

4.7. CaWRKY30 vaigistamine viiruse poolt põhjustatud geenivaigistamise (VIGS) abil

CaWRKY30 vaigistamiseks piprataimedes viidi läbi varem kirjeldatud tubakakõristiviirusel (TRV) põhinev viirus-indutseeritud geenivaigistamise (VIGS) süsteem [47, 81, 82]. Agrobacterium GV3101, mis sisaldas PYL192, PYL279-CaWRKY30, PYL279 ja PYL279-PDS (OD600=0.8) konstrukte, segati vahekorras 1:1. See segu infiltreeriti ilma nõelata süstlaga 2-nädala vanuste paprikataimede idulehtedesse. Infiltreerunud taimi inkubeeriti kasvukambris 56 tundi pimedas temperatuuril 16 °C ja suhtelise õhuniiskuse juures 45 protsenti ning seejärel viidi kasvuruumi kontrollitud tingimustes temperatuuril 25 ± 2 °C, 60–70 µmol footoneid m-2. s -1 ja suhteline õhuniiskus 70 protsenti 16 h valguse/8 h pimeduse valgusperioodil.

4.8. CaWRKY30 mööduv üleekspressioon paprikalehtedes

CaWRKY30-Lippu ja EV-d sisaldavaid Agrobacterium'i rakke GV3101 kasvatati LB söötmes termokontrolli loksutis, mille OD600=1.0-ni olid üleöö vastavad antibiootikumid. Seejärel tsentrifuugiti neid Agrobacterium GV3101 10 minutit 6000 pm ja 28 °C juures. Pärast tsentrifuugimist eemaldati vedel supernatant ja põhjas olev tahke pellet lahjendati induktsioonikeskkonnas (10 mM MES, pH 5,4, 10 mM MgCl2, 200 uM atsetosüringoon) väärtuseni OD600=0,8. See segu imbuti lehtedesse ilma nõelata süstlaga. Neid ajutiselt üleekspresseeritud lehti täheldati HR-sarnase rakusurma suhtes või koguti proove DAB ja trüpaansinise värvimiskatsete tegemiseks ning RNA isoleerimiseks rohkemate katsete jaoks.

4.9. RNA ekstraheerimine ja kvantitatiivne reaalajas RT-PCR

Kogu RNA ekstraheerimiseks töödeldud paprikataimede lehtede proovidest ja prooviseemikutest kasutati TRIzol reagendi meetodit (Invitrogen). Seejärel kasutati ekstraheeritud RNA pöördtranskribeerimiseks Prime Script RT-PCR komplekti (TaKaRa, Dalian, Hiina). Sihtmarkergeenide suhteliste transkriptsioonitasemete uurimiseks viidi läbi reaalajas qRT-PCR analüüs. Andmetöötlus viidi läbi vastavalt eelnevalt kirjeldatud meetoditele [45, 82], spetsiifiliste praimeritega (täiendav tabel S3), kasutades tootja juhiseid Bio-Rad reaalajas PCR süsteemi jaoks (Bio-Rad, Foster City, CA, USA) ja SYBR eelsegu Ex Taq II süsteem (TaKaRa Perfect Real Time).

4.10. ELEKTRIjuhtivuse hindamine

Elektrijuhtivus (ioonileke) arvutati eelnevalt kirjeldatud meetodil väikeste muutustega [44,83]. Kuus lehtketast (laiusega 4 mm) saadi augustaja abil. Plaate pesti kolm korda steriliseeritud ddH2O-ga ja inkubeeriti koheselt 10 ml ddH2O-s. Pärast seda hoiti neid lehekettaid õrnalt loksutavas (60 pööret minutis) loksutis toatemperatuuril 1 tund. Elektrijuhtivuse andmete salvestamiseks kasutati juhtivusmõõturit (Mettler Toledo 326 Mettler, Zürich, Šveits).

4.11. Immunoblotanalüüs

Valgu ekstraheerimiseks pipralehtedest kasutati eelnevalt kirjeldatud valgu ekstraheerimispuhvri protseduuri [3]. Ekstraheeritud valku inkubeeriti üleöö antiHA-agaroosiga temperatuuril 4 °C (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Helmeste kogumiseks kasutati magnetpragu ja pesti kolm korda Tris-puhversoolalahusega (TBS) ja Tween 20-ga (0,05 protsenti). Elueeritud valku jälgiti immunoblotanalüüsi ja anti-HA-peroksidaasi abil (Abcam, Cambridge, UK).

5. Kokkuvõtted

Kokkuvõtteks oleme seisukohal, et CaWRKY30 aktiveerib transkriptsiooniliselt pipra immuunsuse RSI vastu. CaWRKY30 vaigistamine VIGS-i poolt vähendas paprika taimede immuunsust bakteriaalsete patogeenidega nakatumise suhtes, samas kui CaWRKY30 mööduv üleekspressioon kutsus esile resistentsuse R. solanacearum'i suhtes. Positiivse tagasiside ahela moodustumine ja selle funktsioon paralleelselt teiste TF-idega on kollektiivselt piisav tõend selle aktiveerumisest biootilise stressi all. Lisaks pakume välja CaWRKY30 stabiilsete transgeensete piprataimede ja CaWRKY30 sihtvalgu genereerimise, et põhjalikult selgitada selle geeni rolli bakteriaalsete patogeenide vastu ja ka erinevates metaboolsetes radades.

Autori kaastööd:

Kontseptualiseerimine, AH, MIK, MA, BSA, ZL ja ATKZ; Andmete kureerimine, AH, MIK ja AME-S.; Formaalne analüüs, ZL ja SF; Rahastuse omandamine, AH, MIK, MAAA, MA, BSA, AME-S. ja ATKZ; Projektihaldus, AH ja MIK; Ressursid, AH; Valideerimine, SM; Visualiseerimine, SM ja SF; Kirjutamine – originaal mustand, AH ja MIK; Kirjutamine – ülevaade ja toimetamine, IRN, MAAA, MA, BSA, AME-S., ZL, SF ja ATKZ Kõik autorid on käsikirja avaldatud versiooni läbi lugenud ja sellega nõustunud.

Rahastamine:

Peaautor on Pakistani kõrghariduskomisjoni ees väga tänulik rahalise abi eest selle uuringu läbiviimiseks SRGP grandi nr 21-2651/SRGP/HRD/HEC/2020 alusel. Praegust tööd rahastasid Taifi ülikooli teadurid, kes toetavad projekti numbrit (TURSP2020/245), Taifi ülikool, Taif, Saudi Araabia. Uuringut toetas ka Fujiani Põllumajandus- ja Metsandusülikooli Arengufondi projekt (CXZX2018114, CXZX2020008A ja CXZX2019024G).

Institutsioonilise läbivaatamise nõukogu avaldus: Ei kohaldata.

Teavitatud nõusoleku avaldus: Ei kohaldata.

Andmete kättesaadavuse avaldus: kõik andmed on käsikirjas ja selle lisafailides.4

Huvide konflikt: autorid ei deklareeri huvide konflikti.

Viited

1. Arif, M.; Atta, S.; Bashir, MA; Khan, MI; Hussain, A.; Shahjahan, M.; Alwahibi, MS; Elshikh, MS Fosetüülalumiiniumi pealekandmise ajastuse mõju leivanisu (Triticum aestivum L.) karnali pungi mahasurumisele ja majanduslikule tulule. PLoS ONE 2021, 16, e0244931.

2. Khalofah, A.; Khan, MI; Arif, M.; Hussain, A.; Ullah, R.; Irfan, M.; Mahpara, S.; Shah, RU; Ansari, MJ; Kintl, A. Lämmastikväetise sügav paigutamine parandab siirdatud peene riisi saagikust, lämmastiku kasutamise tõhusust ja majanduslikku tulu. PLoS ONE 2021, 16, e0247529. [CrossRef] [PubMed]

3. Noman, A.; Hussain, A.; Adnan, M.; Khan, MI; Ashraf, MF; Zainab, M.; Khan, KA; Ghramh, HA; Ta, S. Uudne MYB transkriptsioonifaktor CaPHL8 annab vihjeid pipra immuunsuse kujunemise kohta mullas leviva patogeeni vastu. Microb. Patog. 2019, 137, 103758. [CrossRef] [PubMed]

4. Hussain, A.; Noman, A.; Khan, MI; Zaynab, M.; Aqeel, M.; Anwar, M.; Ashraf, MF; Liu, Z.; Raza, A.; Mahpara, S. Paprika kaasasündinud immuunsuse ja stressitaluvuse molekulaarne regulatsioon: ülevaade WRKY TF-idest. Microb. Patog. 2019, 135, 103610. [CrossRef] [PubMed]

5. Reboledo, G.; Agorio, Ad; Vignale, L.; Batista-García, RA; de León, IP Transkriptsiooniprofiil näitab konserveerunud ja liigispetsiifilisi taimekaitsereaktsioone Physcomitrium patensi ja Botrytis cinerea koostoime ajal. Plant Mol. Biol. 2021, 1.–21. [CrossRef]

6. Aerts, N.; Mendes, parlamendiliige; van Wees, SC Taimekaitset reguleerivates hormoonvõrkudes esinevad mitmed läbirääkimise tasemed. Plant J. 2021, 105, 489–504. [CrossRef] [PubMed]

7. Liu, Z.; Shi, L.; Weng, Y.; Zou, H.; Li, X.; Yang, S.; Qiu, S.; Huang, X.; Huang, J.; Hussain, A. ChiIV3 toimib WRKY40 uudse sihtmärgina, et vahendada pipra immuunsust Ralstonia solanacearum'i infektsiooni vastu. Mol. Taimede ja mikroobide koostoime. 2019, 32, 1121–1133. [CrossRef] [PubMed]

8. Ul Haq, MI; Maqbool, MM; Ali, A.; Farooq, S.; Khan, S.; Saddiq, MS; Khan, KA; Ali, S.; Khan, MI; Hussain, A. Istutusgeomeetria optimeerimine odra-Egiptuse ristiku intercropping süsteemi jaoks poolkuivas subtroopilises kliimas. PLoS ONE 2020, 15, e0233171.

9. Hussain, A.; Li, X.; Weng, Y.; Liu, Z.; Ashraf, MF; Noman, A.; Yang, S.; Ifnan, M.; Qiu, S.; Yang, Y. CaWRKY22 toimib positiivse regulaatorina pipra vastuses Ralstonia solanacearum'ile, moodustades võrgustikud CaWRKY6, CaWRKY27, CaWRKY40 ja CaWRKY58-ga. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 1426. [CrossRef] [PubMed]

10. Mukhtar, MS; Liu, X.; Somssich, IE WRKY27 rolli selgitamine meessteriilsuses Arabidopsises. Taime signaal. Behav. 2018, 13, e1363945. [CrossRef] [PubMed]

11. Khan, MI; Zhang, Y.; Liu, Z.; Hu, J.; Liu, C.; Yang, S.; Hussain, A.; Ashraf, MF; Noman, A.; Shen, L. CaWRKY40b pipar toimib vastusena Ralstonia solanacearum'ile negatiivse regulaatorina, moduleerides otseselt kaitsegeene, sealhulgas CaWRKY40. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 1403. [CrossRef] [PubMed]

12. Eulgem, T.; Somssich, IE WRKY transkriptsioonifaktorite võrgud kaitsesignalisatsioonis. Curr. Arvamus. Plant Biol. 2007, 10, 366–371. [CrossRef] [PubMed]

13. Bakshi, M.; Oelmüller, R. WRKY transkriptsioonifaktorid: paljude taimede esindaja. Taime signaal. Behav. 2014, 9, e27700. [CrossRef] [PubMed]

14. Xu, Y.-P.; Xu, H.; Wang, B.; Su, X.-D. N-terminaalsete WRKY transkriptsioonifaktorite ja DNA komplekside kristallstruktuurid. Protein Cell 2020, 11, 208–213. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, X.; Li, C.; Wang, H.; Guo, Z. WRKY transkriptsioonifaktorid: evolutsioon, sidumine ja tegevus. Fütopatool. Res. 2019, 1, 13. [CrossRef]

16. Shen, L.; Liu, Z.; Yang, S.; Yang, T.; Liang, J.; Wen, J.; Liu, Y.; Li, J.; Shi, L.; Tang, Q. Pepper CabZIP63 toimib positiivse regulaatorina Ralstonia solanacearum'i või kõrge temperatuuri ja kõrge õhuniiskuse väljakutse ajal positiivse tagasiside ahelas CaWRKY40-ga. J. Exp. Bot. 2016, 67, 2439–2451. [CrossRef] [PubMed]

17. Schluttenhofer, C.; Yuan, L. Spetsialiseeritud ainevahetuse reguleerimine WRKY transkriptsioonifaktorite abil. Plant Physiol. 2015, 167, 295–306. [CrossRef] [PubMed]

18. Jiang, J.; Ma, S.; Jah, N.; Jiang, M.; Cao, J.; Zhang, J. WRKY transkriptsioonifaktorid taimede reaktsioonides pingetele. J. Integr. Plant Biol. 2017, 59, 86–101. [CrossRef]

19. Yu, K.; Pieterse, CM; Bakker, PA; Berendsen, RL Kasulikud mikroobid, mis lähevad juure immuunsuse maa alla. Taimerakkude keskkond. 2019, 42, 2860–2870. [CrossRef]

20. Noman, A.; Liu, Z.; Yang, S.; Shen, L.; Hussain, A.; Ashraf, MF; Khan, MI; He, S. CaZNF830 ekspressioon ja funktsionaalne hindamine pipra reaktsiooni ajal Ralstonia solanacearum'ile või kõrgele temperatuurile ja niiskusele. Microb. Patog. 2018, 118, 336–346. [CrossRef] [PubMed]

21. Noman, A.; Hussain, A.; Ashraf, MF; Khan, MI; Liu, Z.; Ta, S. CabZIP53 on CaWRKY40 sihtmärgiks ja toimib positiivse regulaatorina paprika kaitses Ralstonia solanacearum'i ja termotolerantsi vastu. Keskkond. Exp. Bot. 2019, 159, 138–148. [CrossRef]

22. Ashraf, MF; Yang, S.; Wu, R.; Wang, Y.; Hussain, A.; Noman, A.; Khan, MI; Liu, Z.; Qiu, A.; Guan, D.; et al. Capsicum annuum HsfB2a reguleerib positiivselt reaktsiooni Ralstonia solanacearum'i infektsioonile või kõrgele temperatuurile ja kõrgele niiskusele, moodustades CaWRKY6 ja CaWRKY40 transkriptsioonikaskaadi. Plant Cell Physiol. 2018, 59, 2608–2623. [CrossRef] [PubMed]

23. Wang, L.; Dossa, K.; Sina, J.; Zhang, Y.; Li, D.; Zhou, R.; Yu, J.; Wei, X.; Zhu, X.; Jiang, S.; et al. Kõrge eraldusvõimega ajaline transkriptoomide järjestamine harutab lahti ERF-i ja WRKY kui regulatiivsete võrkude peamised mängijad, mis on aluseks seesamile reageerimisele vettimisele ja taastumisele. Genoomika 2021, 113, 276–290. [CrossRef]

24. Yang, X.; Zhou, Z.; Fu, M.; Han, M.; Liu, Z.; Zhu, C.; Wang, L.; Zheng, J.; Liao, Y.; Zhang, W.; et al. WRKY perekonna geenide transkriptoomiline tuvastamine ja nende ekspressiooniprofiil salitsüülhappe suunas Camellia japonicas. Taime signaal. Behav. 2021, 16, 1844508. [CrossRef] [PubMed]

25. Pervez, M.; Babar, M.; Iqbal, J.; Hasnain, M.; Abbas, S.; Shah, S.; Ashraf, M. In Silico Wrky1 ja Wrky3 geenide struktuurne ja funktsionaalne analüüs valitud teraviljakultuurides. J. Anim. Plant Sci.-JAPS 2021, 31, 322–341.

26. Liu, Z.-Q.; Liu, Y.-Y.; Shi, L.-P.; Yang, S.; Shen, L.; Yu, H.-X.; Wang, R.-Z.; Wen, J.-Y.; Tang, Q.; Hussain, A.; et al. SGT1 on vajalik PcINF1/SRC2-1-indutseeritud pipra kaitsereaktsioonis SRC-ga suhtlemisel{10}}. Sci. Rep. 2016, 6, 21651. [CrossRef] [PubMed]

27. Srinivasan, K. Punase pipra (Capsicum annuum) bioloogiline aktiivsus ja selle terav põhimõte Kapsaitsiin: ülevaade. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2016, 56, 1488–1500. [CrossRef] [PubMed]

28. Liu, Z.; Shi, L.; Yang, S.; Lin, Y.; Weng, Y.; Li, X.; Hussain, A.; Noman, A.; Ta, S. ChiIV3, piprataime kitinaasi funktsionaalne ja promootori analüüs vastuseks Phytophthora capsici infektsioonile. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 1661. [CrossRef] [PubMed]

29. Ali, M.; Luo, D.-X.; Khan, A.; Haq, SU; Gai, W.-X.; Zhang, H.-X.; Cheng, G.-X.; Muhammad, I.; Gong, Z.-H. Paprika (Capsicum annuum L.) kitiini siduvate valkude geeniperekonna klassifikatsioon ja genoomi hõlmav analüüs ning Phytophthora capsici transkriptsiooniregulatsioon, abiootilised stressid ja hormonaalsed rakendused. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 2216. [CrossRef] [PubMed]

30. Noman, A.; Liu, Z.; Aqeel, M.; Zainab, M.; Khan, MI; Hussain, A.; Ashraf, MF; Li, X.; Weng, Y.; Ta, S. Leutsiini tõmblukkdomeeni põhilised transkriptsioonifaktorid: taimede immuunsuse esirinnas. Biotehnoloogia. Lett. 2017, 39, 1779–1791. [CrossRef] [PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com