Kalretikuliini defitsiit häirib ribosoomi biogeneesi ja põhjustab embrüonaalse neeru arengu pidurdumist

edmund.chen@wecistanche.com

Abstraktne

Nefrogeneesi juhivad keerulised signaalirajad, mis kontrollivad rakkude kasvu ja diferentseerumist. Endoplasmaatiline retikulum chaperone kalretikuliin (Calr) on hästi tuntud oma funktsiooni poolest kaltsiumi säilitamisel ja glükoproteiinide voltimisel. Selle roll sellesneerudarengust pole ikka veel aru saada. Pakume selles uurimises tõendeid Calri pöördelise rolli kohta nefrogeneesis. Näitame, et Calr defitsiit põhjustab puutumatu nefrogeense tsooni moodustumise häirimist ja nefrogeneesi pidurdumist, mida tõendab koma- ja s-kujuliste kehade moodustumise häired. Proteoomika ja transkriptoomika lähenemisviise kasutades näitasime, et lisaks Wnt-signaali andvate võtmevalkude muutumisele on embrüoneerudCalr // näitas ribosomaalsete valkude ekspressiooni üldist häiret, mis näitab häireid valgusünteesis ja nefrogeneesis. CRISPR / cas9 vahendatud knockout kinnitas, et Calri puudulikkus on seotud mitme ribosomaalse valgu ja ribosoomi biogeneesi võtmevalkude puudulikkusega. Meie andmed näitavad otsest seost Calri ekspressiooni ja ribosoomi biogeneesi vahel.

Sissejuhatus

Neerorganogeneesi iseloomustab morfogeneetiliste sündmuste jada, mida juhib rakkude kasv ja diferentseerumine. Nefrogeneesi ajal on nefroni moodustumise liikumapanev jõud mesenhümaal-epiteeli üleminek (MET) ja kusejuhade (UB) hargnemine, mis on UB ja metanefrilise mesenhüümi (MM) vahelise vastastikuse induktsiooni tulemus [1]. Selle protsessi käigus on epiteeli diferentseerumise ja nefroni moodustumise korraldamiseks vajalik erinevate signaaliradade kompleksne ja vastastikune koostoime [1–3]. Selle protsessi peamiste radade hulgas on gliast tuletatud neurotroofse faktori (Gdnf) signaaliülekanne selle Ret-retseptori kaudu keskset rolli protsessis, mida nimetatakse kusejuha tekkeks. Selle signaali katkemine võib põhjustada emakavälist kusejuha võineeru-agenees, kui signaalimine puudub täielikult [4]. Lisaks Gdnf/Ret signalisatsioonile koordineerib kanooniline Wnt/-catenin signaalimine mitmeidneeru-areng nii MM-is kui ka UB-s [5] ning kanoonilise Wnt-signaali pärssimine kusejuha pungade liinis ja nefroni eellasrakkudes põhjustavadneeru-agenees [6]. Transkriptsiooni ümberprogrammeerimise säilitamine nefrogeneesi ajal sõltub kromatiini ligipääsetavusest [7]. Näitasime, et heterokromatiini valgud, mis teadaolevalt osalevad geenide vaigistamise epigeneetilises regulatsioonis, on asendamatud, et säilitada tasakaal hargnevate aktivaatorite ja inhibiitorite vahel varases arengujärgus [7].

CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU FUNKTSIOONI

Kalretikuliin (Calr) on suure kaltsiumi sidumisvõime ja madala afiinsusega endoplasmaatilise retikulumi (ER) vale kaperoon, mis on ülioluline Ca2 ja ER-i sekvestreerimise ning erinevate rakuprotsesside, sealhulgas signaaliülekande, geeniekspressiooni ja valgukaubanduse jaoks. [8,9]. Mehhanismid, mis käsitlevad Calri rolli haigustes, põhinevad peamiselt Ca2 pluss kelaatimisel Calri Ca2 plussiga seonduva C-terminaalse domeeni poolt ja selle rollil voltimata valgu vastuses (UPR) [10,11]. UPR võib mängida tsütoprotektiivset rolli valesti volditud valkudega kokkupuute ajal või olla rakkudele kahjulik, kuna pidev UPR-signaali indutseeritud apoptoos. Kuigi vähesed uuringud käsitlesid Calri võimalikku rolli haigustes transkriptsiooni reguleerimise kaudu, jääb Calri ER chaperone funktsioon raku saatuse üheks oluliseks mehhanismiks [9, 12]. Pikaajaline ER-stress ja valkude väärvoltimine on paljudes silmapaistvadneeruhaigusednagu glomerulopaatiad, ägedadneerukahjustus, diabeetiline nefropaatia,neeru-fibroos ja kroonilineneeruhaigus[13,14]. Calri roll embrüo arengus pole endiselt selge. Calr knockout põhjustab embrüonaalset letaalsust arengustaadiumis E14.5 südamearengu halvenemise tõttu [15]. Calri puudulikkuse tagajärjed molekulaarsetele mehhanismideleneerudembrüonaalset arengut ei ole aga veel täielikult mõistetud. Käesolevas uuringus teostasime embrüo võrdlevaid transkriptoomilisi ja proteoomilisi analüüseneerudkolmest genotüübist Calr plus / plus , Calr plus // ja Calr // ning tõstis esile Calr knockouti mõju nefrogeneesile ja ribosomaalsete valkude ekspressioonile.

Märksõnad:kalretikuliini puudus; nefrogenees; ribosomaalne biogenees, neerud, neerud

2. Tulemused

2.1. Kalretikuliini väljalangemise tagajärjed neerude morfoloogiliste ja histoloogiliste kõrvalekallete ning neerude hargnemise kahjustuse korral

Calri geneetiline väljalülitamine hiirtel põhjustab varajase embrüonaalse letaalsuse vatsakeste vaheseina defektide tõttu [15]. Et uurida, kas Calri väljalöök mõjutabneerudArengu ajal valmistati hiire embrüod etapis E13.5 Calr plus // tiinetest hiirtest (joonis 1A). Calr// embrüod näitasid olulisi kasvumuutusi võrreldes Calr plus / plus ja Calr plus // ning näitasid olulist embrüo arengu kahjustust. Embrüote üldine morfoloogia janeerudnäitas Calr plus / plus ja Calr-// hiirte suuruse olulist vähenemist, kusjuures Calr// hiirtel oli suurim kõrvalekalle (joonis 1A). Et illustreerida Calri nokauti mõju kohtaneerudareng ja struktuur, embrüod kolmes erinevas arengufaasis (E13.5, E14.5, E16.5) ja kolmest genotüübist (Calr plus / plus , Calr plus // ja Calr//) ohverdati ningneerudsaadi. Kudelõigud näitasid erinevaid arenguetappeneerud,mis kulgeb läbi keeruliste morfoloogiliste struktuuride, mida tõendab koelõikude PAS- ja HE-värvimine.Neerudsamast embrüonaalsest staadiumist erinevate genotüüpidega näitasid erinevat arengutaset (joonis 1B). Lisaks on olulisi erinevusineerudstruktuure täheldati eriti Calr // võrdlemisel Calr plus / plus ja Calr plus //. Need erinevused jäävad ka nefrogeneesi kaugelearenenud staadiumisse (joonis 1B). Calr//neerudnäitavad tugevat kahjustust võrreldes Calr plus / plus ja Calr plus // (joonis 1B). Etapil E13.5 Calri suurus//neerudoli väiksem ning kusejuha pungade ja kusejuhi pungade okste arv oluliselt väiksem. Sarnased vaatlused tehti etappidel E14.5 ja E16.5. Embrüo organkultuurneerudkolmest embrüo genotüübist paljastas olulise häire UB hargnemises janeerudkasvu. Et visualiseeridaneeru-Struktuure, kultiveeritud alged värviti basaalmembraani markerina laminiiniga ja UB visualiseerimiseks Dolichos biflorus agglutinin (DBA) lektiiniga.

Kultiveeritava kombineeritud FL-fluorestsentsvärvimineneerudalged näitasid olulist hargnemise kahjustust, mis kaasnes Calri puudulikkusega ja mille tulemuseks oli üldine aeglustumineneerudarengut (joonis 2A,B). Isolatsiooni ajal Calr//neerudalged näitasid 6–10 UB vihjet, samas kui Calr plus / plus ja Calr plus // alged 20–30 UB vihjet. Calr plus / plus ja Calr plus // kultiveeritud alged arenesid kultiveerimisperioodi (72 h) jooksul normaalselt ja näitasid hästi hargnevat UB-d (mõlemad 85 ± 9, n=6) ​​ning erinevaid teadaolevaid struktuure aastast. vivo arenev neer. Kultiveeritudneeruddemonstreeritud torueelseid agregaate,neeru-vesiikulid ja kaane mesenhüüm (joonis 2A, B). Seevastu Calr// alged ei arenenud normaalselt ja näitasid olulist muutust UB hargnemises (15 ± 3 n=6) (joonis 2B).

Joonis 2. Calr−/− hiirneerudalgetel ilmneb tõsine muutus kasvus ja UB hargnemises. (A):NeerCalr plus/plus Calr plus /− ja Calr−/− (E13.5) alged eraldati ja kultiveeriti ex vivo kolm päeva. Calr−/−neerudrudiments näitas üldist muutust kasvus ja olulist muutust kusejuhade pungade hargnemises. (B): Immunofluorestsentsvärvimineneerudalgelised pärast kolmepäevast kultuuri. Rudimentide erinevate struktuuride visualiseerimiseks viidi läbi laminiini (punane) ja DBA lektiini (roheline) kaasvärvimine. Hargnemise kvantifitseerimine saavutati kusejuha pungade okste arvu loendamisega. Kvantifikatsioon on esitatud vearibadega tulpdiagrammina. Iga riba tähistab haru keskmisi arvu ± sd kuuest kultiveeritud algelisest. Olulised erinevused: (*) p < 0.05,="" (***)="" p="">< 0,001.="" 2,5="" ×="" 2,5="" ×="" 2,5="" ×="" sisemine="" j.="" mol.="" sci.="" 2021,="" 22,="" 5858="" 4="" 21="" joonis="" 2.="" calr悆="" hiire="" neeru="" algelised="" näitavad="" tõsist="" muutust="" kasvus="" ja="" ub="" hargnemises.="">NeerCalr plus / plus Calr plus // ja Calr / (E13.5) alged eraldati ja kultiveeriti ex vivo kolm päeva. Calr /neerudrudiments näitas üldist muutust kasvus ja olulist muutust kusejuhade pungade hargnemises. (B): Immunofluorestsentsvärvimineneerudalgelised pärast kolmepäevast kultuuri. Rudimentide erinevate struktuuride visualiseerimiseks viidi läbi laminiini (punane) ja DBA lektiini (roheline) kaasvärvimine. Hargnemise kvantifitseerimine saavutati kusejuha pungade okste arvu loendamisega. Kvantifikatsioon on esitatud vearibadega tulpdiagrammina. Iga riba tähistab haru keskmisi arvu ± sd kuuest kultiveeritud algelisest. Olulised erinevused: (*) p < 0.05,="" (***)="" p=""><>

2.2. Calr defitsiit on seotud suurte ja oluliste transkriptsioonimuutustega

Morfoloogilised ja histoloogilised uuringud näitasid kahjustusineerudarendus Calr/ hiire embrüote puhul võrreldes Calr plus / plus ja Calr plus // . Selleks et uurida, kas Calri väljatõrjumine mõjutas nefrogeneesi võtmevalkude ja radade ekspressiooni, viidi läbi täielikud transkriptsioonianalüüsid.neerudalged viidi läbi kolmest embrüo genotüübist. Et hinnata erinevalt ekspresseeritud geene Calr plus / plus , Calr plus // ja Calr / vahelneerudproovide puhul viidi läbi lugemisloendustel põhinevad kvantitatiivsed testid, kasutades Fisheri täpset testi koos Benjamini-Hochbergi korrigeerimisega mitme testi jaoks. Täiendavad joonised S1 ja S2 näitavad geeniekspressioonide võrdleva analüüsi soojuskaarti.neerudalged Calr plus / plus , Calr plus // ja Calr / . Põhjaliku ülevaate saamiseks geeniekspressiooni muutustest Calr plus/plus ja Calr/neeru vahel loodi MA-diagramm, milles kasutati ekspressiooni transformeeritud kordamuutust (FC) Calr plus/pluss ja Calr / kuni log2 transformeeritud. iga geeni keskmine ekspressioonitase kõigis proovides (joonis 3A, täiendav joonis S1). MA-diagramm näitab erinevalt reguleeritud geene Calr pluss / pluss võrreldes Calr / . Reguleeritud geenide funktsionaalne klassifikatsioon vastavalt bioloogilisele protsessile näitas arenguprotsessi muutust Calr /neerud(Joonis 3B, täiendav tabel S1). Reguleeritud geenide raja annotatsiooni täpsem uurimine näitas kahe peamise protsessi aberratsiooni: Wnt signaaliülekanne ja valgu voltimine, kuna leiti, et enamik reguleeritud valkudest on seotud nende kahe peamise rajaga (joonis 3B). Hierarhiline klasterdamine ja k-keskmiste rühmitamine ekspressiooniprofiilidel kinnitasid, et embrüonaalneneerudCalr plus / plus ja Calr plus // transkriptoomid on väga sarnased, kuid erinevad oluliselt Calr / transkriptoomidest (joonis 3C, täiendavad joonised S1 ja S2).

CISTANCHE PARANDAB NEeru-/NEERUNEKTSIOONI

Meie transkriptoomianalüüsi andmed näitasid, et Calri väljalangemisega kaasnes muutus peamiste valkude ekspressioonisneerudareng (joonised 3C ja 4A, täiendav tabel S2) koos Wnt signaaliülekande võtmevalkudega ja suur hulk nefrogeenseid geene olid Calr / -s allareguleeritud või neid ei tuvastatud.neerudalgelised (joonis 3C, joonis 4A). Muuhulgas olid Calr// embrüonaalses neerus oluliselt allareguleeritud transkriptsioonifaktorid, nagu Six1 ja Six2, millest varem teatati, et nad toimivad nefrogeneesi erinevates etappides. Osr1 on üks geenidest, mille ekspressioon on vajalik Eya1, Pax2, Six2, Sall1 ja GDNF jaoks ning selle geeni ekspressioon Calr / -s peaaegu puudus. Et uurida Wnt signaaliülekande ja nefrogeensete võtmegeenide muutumise mõjuneerudareng Calr knockout hiirtel viidi läbi immunofluorestsentsvärvimine embrüonaalse arengu markeriteganeerudlõigud embrüote staadiumis E14.5. Värvimine kinnitas selgelt uuritud geenide muutumist Calr / (joonis 4B). Lisaks, võrreldes Calr plus / plus ja Calr plus // , on Calr /neerudpuudub selge nefrogeenne tsoon (joonis 4B), nagu näitab värvimine ja see kinnitab tõsist häiretneerudareng Calri/ embrüote puhul.

2.3. Võrdlevad proteoomilised analüüsid tuvastasid olulisi muutusi calri / embrüonaalse neeru proteoomis

Morfoloogilised ja histoloogilised analüüsid näitasid, et Calri piiramine on embrüonaalse arengu jaoks problemaatiline.neerud. Et paremini mõista Calri rollineerudembrüonaalset arengut, embrüonaalsetes analüüsides viidi läbi laialdased proteoomianalüüsidneerudkasutades kahte strateegiat. Esimeste katsete käigus kasutasime embrüonaalse võrdlemiseks 2D-geelelektroforeesineerudproteoomid Calr plus / plus ja Calr plus // hiire embrüotest etapist E13.5. 2D-muster näitas olulist muutust Calr plusi proteoomis //neerud(p < 0,05)="" (täiendav="" joonis="" s3a).="" erinevalt="" rohkete="" valkude="" identifitseerimine="" näitas="" muutust="" stressiradades="" ja="" rna="" metabolismis="" osalevate="" valkude="" ekspressioonis="" calr="" pluss="">neerud(Täiendav joonis S3B, C). Proteoomide muutuste paremaks uurimiseks Calr pluss // ja Calr悆 / võrreldes Calr plus / plusiganeerud, viisime läbi massispektromeetriapõhise proteoomiprofiilide koostamise (joonis 5, täiendavad tabelid S3–S8). Kattumisanalüüs näitas valkude tuvastamise kõrget reprodutseeritavust genotüüpide vahel (joonis 5A). Statistiline analüüs näitas olulisi muutusi valgu ekspressioonis Calr plus / plus vs Calr 悆 / (joonis 5A, täiendavad tabelid S3 ja S4, lisajoonis S4A.), Calr plus // vs Calr / (joonis 5A, täiendavad tabelid S5 ja S5 S6, lisajoonis S4B) ja Calr plus / plus vs. Calr plus // (joonis 5A, täiendavad tabelid S7 ja S8, täiendav joonis S4C). Immunofluorestsentsvärvimine kinnitas Calri väljalangemist Calris //neerud. Lisaks kinnitasime proteoomika leiud kahe allareguleeritud valgu kohta Calr / : Calbindin 1 (Calb-1) ja Superoksiidi dismutaas 1 (Sod1). Sod1 puhul näitasid nii proteoomilised kui ka transkriptoomilised andmed Sod1 väljatõrjumist Calr'i embrüo //neerudja immunofluorestsentsvärvimine kinnitas Sod1 puudulikkust Calr / embrüonaalsesneerud(Joonis 5B). Sod1 on antioksüdantne metalloensüüm, mis mängib olulist rolli reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) detoksifitseerimisel, muutes vabad superoksiidi radikaalid vesinikperoksiidiks, et raku katalaasid saaksid detoksifitseerida, vältides seega toksilisust. Calb-1 on peamine intratsellulaarne kaltsiumi siduv valk distaalses keerdtorukeses (DCT) ja mängib võtmerolli transtsellulaarses Ca2 pluss reabsorptsioonis. Intratsellulaarse Ca2-pluss-puhvrina ja Ca2-pluss-transiitvalguna transpordib Calb{9}} Ca2-plussi tipust basolateraalsele poolele ilma rakusisese Ca2 pluss-kontsentratsiooni oluliste muutusteta. Seos Calri väljalangemise ja mõlema valgu ekspressiooni muutumise vahel ei ole selge ja vajab täiendavat uurimist.

Joonis 3. Kalretikuliini knockout hiirte geeniekspressiooni võrdlev analüüs. (A): MA graafik, mis näitab laiaulatuslikke üles- ja allareguleeritud geene Calr plus / plus hiirtel versus Calr /. Voldi muutuse kvantitatiivsed testid (normaliseeritud logaritmiliselt teisendatud lugemiste arvu alusel) viidi läbi Fisheri täpse testiga Benjamini-Hochbergi korrektsiooniga (p < 0,05)="" ja="" mitteolulised="" geenid="" on="" kujutatud="" halliga.="" ma="" diagrammi="" kasutatakse="" erinevalt="" ekspresseeritud="" geenide="" kuvamiseks="" calr="" plus="" plus="" vs.="" calr="" (b):="" allareguleeritud="" geenide="" bioloogiliste="" protsesside="" jaotus="" calr/võrreldes="" calr="" pluss="" pluss="" -ga.="" tuvastatud="" geenide="" klassifitseerimine="" viidi="" läbi="" david-i="" bioinformaatika="" tööriista="" abil.="" geenisümbolit="" kasutati="" geeniontoloogia="" annotatsioonide,="" nt="" bioloogiliste="" protsesside="" kategoriseerimiseks.="" (c):="" kolme="" genotüübi="" (calr="" plus="" plus,="" calr="" plus="" ja="" calr/)="" vahel="" on="" leitud="" olevat="" märkimisväärselt="" reguleeritud="" tippgeenide="" rikastamise="" analüüs.="" võrdlev="" analüüs="" on="" esitatud="" soojuskaardina="" (fc=""><2 and="" fc="" >="">

2.4. Geeniontoloogia klassifikatsioon ja valgu-valgu interaktsioonivõrgustiku analüüsid

Vulkaani graafikud ja sektordiagrammi analüüsid näitasid, et Calri ekspressiooni muutused põhjustavad globaalseid muutusi embrüonaalsesneerudproteoom (täiendav joonis S4). Et saada rohkem teavet embrüonaalsega seotud bioloogiliste mehhanismide kohtaneerudarengu muutused Calr / hiirtel, ühendasime DAVID-i bioinformaatika teabega UniProti ja GenBanki andmebaasides leiduvate valkude oletatava funktsiooni kohta. Tuvastatud valkude klassifikatsioon vastavalt nende osalemisele bioloogilistes protsessides andis tulemuseks kakskümmend kategooriat, millest üheksa kõrgelt esindatud kategooriat (täiendav joonis S4D). Üks peamisi kategooriaid oli arenguprotsess, sellesse rühma kuulus enam kui 1000 tuvastatud valku. Kuna valk-valk interaktsioonid on peamised mehhanismid peaaegu kõigi bioloogiliste protsesside jaoks, kaasa arvatud areng, teabe hankimine võimalike valkude ja valgu interaktsioonide kohta ning raja reguleerimine, mis ühendab reguleeritud valke Calr plus // ja Calr/ embryonic.neerudvõib anda olulist teavet protsesside kohta, mis on Calr defitsiidi tingimustes kahjustatud. Sel eesmärgil uurisime reguleeritud valkude vahelisi interaktsioonivõrke, kasutades STRING 11.0 (http://string.embl.de, juurdepääs 24. märtsil 2021). Ainult Calr pluss / pluss ja Calr pluss // ekspresseeritud valkude edasine analüüs näitas kahte tugevat interaktsioonisõlme valkudest, mis osalesid kahes põhiprotsessis, milleks on RNA-metabolism ja oksüdatiivne fosforüülimine (täiendav joonis S5A). See viitab sellele, et Calr / embrüonaalneneerudvõivad kannatada RNA-metabolismi häirete ja energiapuuduse all. Calr pluss / pluss ja Calr pluss // üleekspresseeritud valkude interaktsioonivõrkude uurimine võrreldes Calriga / toetab tugevalt meie eeldusi, kuna võrgud näitavad kolme tugevat interaktsioonisõlme. Kaks sõlme akumuleerisid valke, mis osalesid RNA-metabolismis ja oksüdatiivses fosforüülimises, samas kui kolmas sõlm hõlmab ribosomaalseid valke ja näitasid häireid ribosoomide moodustumisel ja valkude ringluses (täiendav joonis S5B). Reguleeritavate ribosomaalsete valkude põhjalik uurimine näitas nii suurte kui ka väikeste ribosomaalsete subühikute valkude olulist muutust ja see näitas ribosomaalse biogeneesi ja valkude sünteesi tõsiseid häireid (joonis 6A–D).

2.5. Calr Knockout põhjustab ribosomaalse valgu ekspressiooni muutumise 

Transkriptoomiliste ja proteoomiliste andmete analüüsid näitasid olulist muutust ribosomaalsete valkude ekspressioonis Calr/hiirte embrüonaalsetesneerud. Western blot analüüs ja embrüo MS kvantifitseerimineneerudkolme genotüübi valguekstraktid kinnitasid Rps10, Rps19 ja Rps26 olulist allareguleerimistneerud(joonis 7A) ja Rps12, Rps13, Rps14 Rps15, Rps17 ja Rps19 (täiendav joonis S6A, B) Calr/ . Lisaks embrüo värvimineneerudlõigud kinnitasid ribosomaalsete valkude ekspressiooni muutuse ulatust; Rps10 ega Rps6 ei tuvastatud Calr/ embryonic-isneerudsektsioonid (joonis 7B). Calr knockouti ja ribosomaalse valgu ekspressiooni vahelise seose uurimiseks lõime MDCK-s in vitro Calr knockout mudelineeru-tuubulirakud, kasutades CRISPR/cas9 endonukleaasisüsteemi. Western blot analüüsid kinnitasid Calri ekspressiooni annusest sõltuvat allareguleerimist MDCK rakkudes ja näitasid valke Rps10 ja Rps19 kodeerivate 40S ribosomaalsete subühikute olulist ammendumist, mis näitas häireid ribosoomi biogeneesis. Veelgi enam, valgusünteesi jaoks oluliste komponentide, nt pikenemise, ekspressioon näitas, et initsiatsioonifaktor eEIF5a vähenes märkimisväärselt Calr knockout MDCK rakkudes (joonis 7C). Calri väljalangemisega kaasnesid olulised morfoloogilised, proteoomilised ja transkriptoomilised muutused. Meie in vivo ja in vitro uuringud rõhutasid veelgi, et nende kõrvalekalletega kaasnes ribosoomi biogeneesi märkimisväärne langus. Ribosomaalse valgu ekspressiooni vähenemine Calri knockoutisneerudei piirdunud ainult embrüonaalsete staadiumidega, vaid seda võis näidata ka täiskasvanud rakkudesneerud, mis näitab Calri potentsiaalset rolli ribosomaalses biogeneesis.

Joonis 7. Calr defitsiit on seotud ribosomaalse valgu ekspressiooni vähenemisega. (A): ribosomaalsete valkude Rps10, Rps19 ja Rps26 Western blot analüüsid Calr plus / plus , Calr plus // ja Calr // embryonic valguekstraktidesneerud. Embrüonaalsed neerud koguti kolmelt erinevalt tiinetelt Calr plus /- hiirelt. Pärast genotüpiseerimist rühmitati samast emast ja genotüübist pärit embrüod kokku ja nende embrüonaalsedneerudvalguekstraktid ühendati. Pärast valgu hindamist viidi Western blot analüüsid läbi kolmes korduses iga uuritud valgu kohta. Proovide võrdlevaks analüüsiks kasutati ühesuunalist ANOVA-d. Tulemused on esitatud keskmisena ± sd vähemalt kolmest sõltumatust katsest. Erinevusi peeti statistiliselt olulisteks, kui p < 0.05.="" (b):="" immunofluorestsentsvärvimine="" rps10="" ja="" rps6="" vastu="" calr="" plus/plus="" ja="" calr悆="" mbrüonaalse="" neerukoe="" lõikudes="" suurendusega="" 20×.="" (c):="" mdck="" rakkude="" valguekstrakti="" western="" blot="" analüüs="" (vasakul)="" ja="" mrna="" kvantifitseerimine="" pärast="" calri="" väljalülitamist="" mdck="" rakkudes="" (paremal).="" calr="" löödi="" välja,="" kasutades="" crispr="" cas9="" süsteemi="" kahe="" erineva="" sgrna-ga.="" western="" blot="" analüüsiti="" calri,="" gapdh,="" rps10,="" rps19="" ja="" eif5a="" antikehadega.="" calr="" ja="" rps10="" mrna="" kvantifitseerimine="" sgcalr-2="" proovis="" viidi="" läbi="" qpcr="" abil.="" calri="" alareguleerimine="" crispr="" cas9="" süsteemi="" abil="" näitas="" seost="" calri="" puudulikkuse="" ja="" ribosomaalse="" valgu="" ekspressiooni="" muutumise="" vahel.="" olulised="" erinevused:="" (**)="" p="">< 0,01,="" (***)="" p="">< 0,001,="" (****)="" p=""><>

3. Arutelu

Theneerudarenevad hargneva morfogeneesi kaudu, mis on protsess, mis hõlmab keerulisi kasvu- ja diferentseerumisprotsesse ning mida juhivad signaalid, mis tulevad tärkava mesenhümaalse sektsiooni ümbritsevatelt rakkudelt [16]. Viimaste aastate jooksul on sisenenud mitmed võtmegeenid ja -teedneerudareng on tuvastatud. Troofilised tegurid, eriti GDNF, luu morfogeneetilised valgud (BMP) ja fibroblastide kasvufaktorid (FGF) on seotudneeru-kasvu ja diferentseerumist. Need reguleerivad signaaliülekannet, mis on seotud UB hargnemise morfogeneesiga, samuti nefrogeense mesenhüümi säilitamise ja diferentseerumisega embrüonaalsesneerud[17]. Calr knockout põhjustab düsfunktsionaalse südame arengu tõttu embrüonaalset letaalsust [15]. Südame müofibrillogeneesi käivitamiseks on normaalsetes kardiomüotsüütides vaja suurendada tsütoplasma Ca2 pluss kontsentratsiooni. See hädavajalik muutus Ca2 pluss kontsentratsioonis sõltub Calr'ist ja puudub Calri puudulikkuse tingimustes [18]. ER chaperone ja kaltsiumi siduva valgu Calr funktsionaalset rolli nefrogeneesis ei ole veel uuritud. Et uurida Calri võimalikku rolli embrüonaalses elusneerudarengut ja Calri puudulikkuse mõju nefrogeneesile, teostasime võrdleva transkriptoomilise ja proteoomilise analüüsi. Üldiselt põhjustas Calri puudulikkus neerude arengu pidurdumise ning ebaolulisi transkriptoomi ja proteoomi muutusi. Veelgi enam, meie andmed näitasid, et Calr puudulikkus vallandas tõsiseid häireid nefrogeneesi radades, kuna tuvastati olulised Wnt signaaliülekande võtmevalkude (nt Wnt7a, Wnt11, Wnt10b, Fzd10, Fzd9, Prkcb, Prkcq ja Kremen2) ekspressioonimuutused. Induktiivset signaaliülekannet kusejuhade epiteeli ja metanefrilise mesenhüümi vahel reguleerib peamiselt Wnt tagasiside signaalimine [19, 20]. Kuigi Calr on rakulise kaltsiumi homöostaasi põhiosa, on see samaaegselt oluline ER-saperoon raku signaaliülekandes ja geeniekspressioonis osalevate glükoproteiinide ja valkude voltimisel ja kaubitsemisel [21]. Calri katkestamine võib põhjustada valgu voltimise ja ER-i stressi katkemist, mis põhjustab translatsioonimasinate häireid. See võib seletada homosügootsete hiirte neerude arengu peetust.

Üks üllatav ja huvitav aspekt, mida meie andmed rõhutavad, on ribosomaalsete valkude ekspressiooni muutus. Näitasime 40S ja 60S ribosomaalsete subühikute mitmete valkude peaaegu täielikku ammendumist. Veelgi enam, meie in vitro katsed kinnitasid korrelatsiooni Calri alareguleerimise ja ribosomaalse valgu ekspressiooni halvenemise vahel. Ribosoomi biogenees on hästi organiseeritud ja läbib range reguleerimise. Uued uuringud on näidanud, et ribosoomil on oluline roll mitte ainult normaalses rakufüsioloogias, vaid ka reaktsioonis stiimulitele ja haiguste patogeneesis. Veelgi enam, ribosoomi biogenees kontrollib rakkude kasvu ning proliferatsioon ja muutused ribosoomides kajastuvad rakkude proliferatsiooni aberratsioonis, rakutsükli peatamises, apoptoosis ja patoloogilistes ilmingutes [22,23].

Lisaks oma rollile ribosoomi biogeneesis on leitud, et ribosomaalsed valgud täidavad erinevaid ribosoomiväliseid funktsioone, nt rakkude kasvus ja proliferatsioonis, DNA parandamises ning rakkude diferentseerumises ja arengus [24–31]. Ribosomaalsete valkude funktsioonide halvenemist seostati hematoloogiliste ja metaboolsete häiretega ning see võib põhjustada südame-veresoonkonna haigusi ja vähki [32–36]. Ribosomaalseid valke kodeerivate geenide mutatsioon on seotud erütropoeesi ebanormaalsusega, mis põhjustab kliinilisi sündroome, nt Diamond-Blackfani aneemia (DBA) [37] ja 5q-sündroom [38]. RPS10 mutatsioonid on seotud Diamond-Blackfani aneemiaga ja 30 protsendil neist patsientidest on hobuseraua või sigmoidne aneemianeerud[39]. Huvitaval kombel on Diamond-Blackfani patsientidel suurem tõenäosus müelodüsplastilise sündroomi tekkeks, mis on seotud Calri geeni eksoni 9 mutatsiooniga [40–42]. See translatsioonimehhanismi ümberkujundamine põhjustab arenguprotsessis suuri kõrvalekaldeid ja mõjutab mitte ainult urogenitaal-, vaid ka vereringe- ja reproduktiivsüsteeme, põhjustades lõpuks embrüonaalset letaalsust kalretikuliini puudulikkuse korral. Meie andmed näitasid häirivat ribosoomi biogeneesi Calri / embrüonaalses piirkonnasneerudja rõhutas Calri olulist rolli valgu biogeneesis. Usume, et Calri puudulikkuse ja ribosomaalse valgu ekspressiooni muutuste vaheliste seoste parem mõistmine annaks uusi teadmisi, et mõista, kuidas Calr mõjutab ribosoomi biogeneesi ja embrüonaalsetneerudarengut ja võimaldada uudseid vaateid elundite arengut reguleerivatele protsessidele.

4. Materjalid ja meetodid

4.1. Loomad

Kalretikuliini heterosügootsed (Calr plus //) ja metsiktüüpi (Calr plus / plus) pesakonnakaaslased hiired, kellel on identne C57BL/6J geneetiline taust, saadi professor Marek Michalakilt Alberta ülikoolist Edmontonist Albertast Kanadas. Hiiri kasvatati spetsiifilistes patogeenivabades pidamistingimustes ja genotüüpiti, nagu on eelnevalt kirjeldatud artiklis Michalak et al. [15]. Meie uuringu jaoks surmati tiined Calr plus // hiired embrüonaalse arengu erinevatel etappidel (embrüopäevad 13.5: E13.5; 14.5: E14.5; ja 16.5: E16.5), embrüod koguti janeerudlahkati. Genotüpiseerimiseks kasutati embrüo saba tükki. Theneerudvalmistati edasi kas histokeemilise värvimise või transkriptoomika või proteoomika analüüsi jaoks. Kõik katseprotseduurid viidi läbi vastavalt Saksamaa loomahooldus- ja eetikaseadustele (NIH standardid) ning need kiitis heaks Saksamaal Göttingeni ülikooli meditsiinikeskuse kohalik eetikakomitee (33.14-42502-04-11/0598).

CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU VALU

4.2. Histokeemiline värvimine

Embrüo histoloogiliseks värvimiseksneerud, välja lõigatudneerudfikseeriti üleöö 4-protsendilises puhverdatud formaldehüüdi lahuses ja sisestati seejärel parafiiniplokkidesse. Parafiiniga manustatud sektsioonid deparafineeriti ja rehüdreeriti ning värviti hematoksüliinilahuse Gill III ja eosiin Y lahusega (Merck, Darmstadt, Saksamaa) vastavalt tootja protokollile.

4.3. Embrüonaalse neeru endine elundikultuur

Ex vivo elundikultuur viidi läbi vastavalt Davies et.al [43]. Rasedad hiired ohverdati embrüonaalse arengu etapis E13.5, embrüod koguti janeerudlahkati. Pärast genotüpiseerimist 6neerudiga genotüübi alged (Calr plus/plus, Calr plus // ja Calr/) plaaditi läbipaistvale PET-membraanile, mille pooride suurus oli 0,4 µM (24 süvend, BD Falcon). Membraan asetati 24 süvendiga plaadi ühte süvendisse, mis sisaldas 400 uineerudsööde (KCM, DMEM, 10 protsenti inaktiveeritud FCS). See võimaldasneerudmeediumiga ühendust võtma ilma seda uputamata. Nendel tingimustel oli võimalik säilitadaneerudkultiveeritud temperatuuril 37 ◦C ja 5% CO2 juures vähemalt 144 tundi.

4.4. Kultiveeritud neerude immunofluorestsentsvärvimine ja neerulõikude immunohistoloogiline analüüs

Embrüonaalneneerudkultiveeriti ex vivo 72 tundi, seejärelneerudalged fikseeriti külmas metanoolis temperatuuril t 20 ◦C 30 minutit. Fikseerimisetapile järgnes 3 pesemisetappi, millest igaüks kestis 5 minutit PBS-is. Primaarse antikeha küüliku monoklonaalne laminiinivastane antikeha (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) lahjendati PBS-is ja inkubeeriti 4 °C juures üleöö. Kultiveeritudneerudalgeid pesti PBS-s 4 tundi ja sekundaarne antikeha (Molecular Probes Alexa Fluor 555 kitse küülikuvastane IgG (1:500)) lisati üleöö temperatuuril 4 °C. UB värviti lektiini Dolichos biflflorus aglutiniini (DBA) abil vähemalt 3 tundi. Pärast inkubeerimist,neerudpesti PBS-s 3 tundi ja sisestati mikroskoopiliseks analüüsiks. Deparafineeritud ja rehüdreeritud embrüo immuunvärvimineneerudsektsioonid viidi läbi, et tuvastada mitme valgu ekspressioon ja jaotus. Sektsioone töödeldi antigeeni otsimislahusega (1,8 uM sidrunhape ja 8,2 uM naatriumtsitraat), mis oli eelsoojendatud toiduaurutis 25 minutit. Sektsioonid blokeeriti 10% kitse seerumiga PBS-s 1 tund ja inkubeeriti üleöö 4 °C juures primaarsete antikehadega (kasutati järgmisi primaarseid antikehi: küüliku monoklonaalne anti-Calbindin-1, anti-Wt1, anti- Six2, anti-Pax2, anti-Calr (Abcam, Cambridge, UK), küüliku monoklonaalne anti-Rps6, antiRps10 (Invitrogen) ja küüliku monoklonaalne anti-Sod1 antikeha (Abnova, Taipei, Taiwan). Primaarsed antikehad tuvastati fluorestsentsiga märgistatud sekundaarseid antikehi (Molecular Probes Alexa Fluor 555 kitse hiirevastane IgG antikeha ja Alexa Fluor 555 kitse küülikuvastane IgG) 1 tund toatemperatuuril. Negatiivsete kontrollide jaoks inkubeeriti koelõike ainult sekundaarse antikehaga. Slaidid paigaldati katteklaasidega Vectashieldi paigalduskeskkonnas koos DAPI-ga tuumade värvimiseks (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA).

4.5. Rakukultuur

Madin-Darby koerneerud(MDCK) rakud saadi American Type Culture Collectionist (ATCC) ja paljundati Dulbecco modifitseeritud kotkasöötmes (DMEM), 10 protsendis veise loote seerumis (FBS), 1 protsendis penitsilliinis/streptomütsiini ja 1 protsendis L-glutamiinis temperatuuril 37 ◦C. 5% CO2-atmosfääris. Rakke kultiveeriti T25 kolbides ja jagati kaks korda nädalas. Rakkude passaažiks trüpsiiniti MDCK rakke lühikese aja jooksul, et vältida raku struktuuri muutumist.

4.6. Knockout-rakkude genereerimine

Canis luupuse liikide Calr (XM8622117) sgRNA järjestused kavandati veebitööriista BlueHeronBio (Origene, Herford, Saksamaa) abil. SgRNA järjestus 50 GTAGATGGCGGGTTCGGCAG 30 sisestati pLenti-Cas-Guide plasmiidi (Addgene plasmiidid #3931646) koos BamHI ja BsmBI restriktsiooniensüümidega, et genereerida pLenti-Cas{7}} Calr konstruktsioon, mida hiljem kinnitati ka Sangeri järjestuse kinnitamine. Carli väljatõrjumiseks MDCK rakkudes viidi läbi pLenti-Cas9-Calr transientne transfektsioon. Üks päev enne transfektsiooni külvati 6 süvendiga plaatidele MEM söötmega 200,{11}} rakku/ml. Enne transfektsiooni vahetati sööde FCS-vaba Opti-MEM söötme vastu. Rakkude transfekteerimiseks kasutati Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Lipofektamiini plasmiidi DNA segu valmistati OptiMEM-iga juhendaja protokolli alusel. 6 süvendiga plaadi transfektsiooniks lisati 4 ug plasmiidset DNA-d eraldi 250 ui Opti-MEM söötmele ja inkubeeriti 10 minutit toatemperatuuril. Seejärel lisati DNA segu Lipofectamine 2000 segule ja inkubeeriti 30 minutit enne rakkudesse lisamist. Transfektsiooni edukust hinnati Western blot abil.

4.7. Transkriptsiooni analüüs

Transkriptoomiuuringuteks kasutati 3 tiine Calr plus // hiirt. Embrüod (8–10/tiine hiir) koguti janeerudolid isoleeritud. Pärast genotüpiseerimist,neerudsamast genotüübist ja samast emast pärit ained ühendati kokku ja töödeldi RNA ekstraheerimiseks. Kogu RNA-d eraldati rakkudest Calr plus / plus , Calr plus // ja Calr / embryonicneerudkasutades Trizol (Invitrogen) meetodit vastavalt tootja soovitustele. Seejärel töödeldi proove DNA-ga saastumise eemaldamiseks DNAse I-ga (Sigma). RNA kvaliteeti tehti kindlaks, kasutades Agilent 21{{10}}0 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) mikrofluidset elektroforeesi. Sekveneerimiseks valmistati RNA proovid "TruSeq RNA Sample Prep Kit" abil vastavalt tootja protokollile (Illumina, San Diego, CA, USA). Ühe lugemisega (50 bp) sekveneerimine viidi läbi, kasutades HiSeq 2000 (Illumina, San Diego, CA, USA). Järjestused joondati Mus Musculluse genoomi võrdlusjärjestusega (Ensembl genome assembly 3.2.1; https://www.ensembl.org/info/genome/genebuild/assembly. html, juurdepääs 24. märtsil 2021), kasutades STAR joondust. tarkvara (Cold Spring Labaro tory, Cold Spring Harbor, USA) (versioon 2.3.0e, https://github.com/alexdobin/STAR, juurdepääs 24. märtsil 2021) [44], mis võimaldab 50 baasi piires kahte mittevastavust. Unikaalsete tabamuste filtreerimiseks ja loendamiseks kasutati paketti SAMtools (versioon 0.1.18) ja HTSeq (versioon 0.6.1p1) [45,46]. Kandidaatgeenid filtreeriti minimaalse 2-kordse muutuseni ja FDR-iga korrigeeritud p-väärtuseni < 0,05.="" geeni="" annotatsioon="" viidi="" läbi,="" kasutades="" mus="" muscullust="" ettevõttest="" ensembl="" v78="" (www.ensembl.org,="" juurdepääs="" 1.="" märtsil="" 2019)="" biomart="" paketi="" (versioon="" 2.24.0)="" kaudu="" [47].="" kandidaatgeenide="" go="" rikastamise="" analüüs="" viidi="" läbi="" goseqi="" paketiga="" (versioon="" 1.2)="" [48],="" kasutades="" standardseid="">

4.8. Neeru lüüs, valgu ekstraheerimine ja kahemõõtmeline geelelektroforees (2-DE)

2D geelelektroforeesi jaoks kasutati 6 tiine Calr plus // emase embrüot (8–10 embrüot/emast). 2D-geelelektroforeesi (2-DE) valgu ekstraheerimiseksneerudsamas embrüonaalses staadiumis ja samast genotüübist ja emasloomadest pärinevad embrüod (8–10 embrüot raseda emase kohta) ühendati, purustati lüüsipuhvriga (9,5 M uurea, 2 protsenti CHAPS (mass/maht), 2 protsenti amfolüüte (mass). /v), 1% DTT) ja segati keerisega. Pärast lüüsipuhvri lisamist inkubeeriti proove 4 °C juures 30 minutit. Rakujäänuste eemaldamiseks tsentrifuugiti 30 minutit 13,000 × g ja 4 ◦C juures. Maksimaalse puhtuse saavutamiseks fuugiti supernatanti veel 30 minutit temperatuuril 13,000 × g ja 4 ◦C. Supernatandid koguti ja graanulid visati ära ning saadud proove kasutati kohe või säilitati kuni kasutamiseni temperatuuril –80 ◦C. Soolaga saastumise vähendamiseks ja valkude rikastamiseks viidi läbi metanool-kloroformi sadestamine vastavalt Wesseli ja Flügge [49] järgi. Pellet kuivatati ja lahustati lüüsipuhvris. Valgu üldkontsentratsioon määrati Bio-Rad valguanalüüsi abil (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) vastavalt Bradfordile. Standardina kasutati BSA-d (Sigma, Steinheim, Saksamaa). Eksperimentaalse reprodutseeritavuse tagamiseks genereerisime igaühest kolm geelineerudbassein. 2D-valgu eraldamine viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [50]. 2-DE geelid värviti Flamingo fluorestseeruva geelpeitsiga (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) järgides tootja juhiseid. Pärast värvimist skaneeriti geele eraldusvõimega 50 µm Fuji FLA-5100 skanneriga. Digitaliseeritud pilte analüüsiti Delta 2D 3.4 (Decodon, Braunschweig, Saksamaa) abil. Valkude visualiseerimiseks värviti 2-DE geelid üleöö kolloidse Coomassie sinisega, Roti-Blue (Roth, Karlsruhe, Saksamaa).

4.9. Massispektromeetriline analüüs ja valkude identifitseerimine

Geelidest lõigati välja märkimisväärselt reguleeritud laigud ning trüptiline geeli seedimine ja peptiidide ekstraheerimine viidi läbi, nagu on eelnevalt kirjeldanud Dihazi et al. [51]. Lühidalt öeldes loputati geelilaike kaks korda 25 mM ammooniumvesinikkarbonaadis (amBic) ja üks kord vees, kahandati 100-protsendilise atsetonitriiliga (ACN) 15 minutit ja kuivatati seadmes SpeedVac (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 20–30 min. Kõiki väljalõigatud kohti inkubeeriti 12,5 ng/µL järjestusastmega trüpsiiniga (Roche Molecular Biochemicals, Basel, CH) 25 mM amBic-s üle öö temperatuuril 37 °C. Peptiidide ekstraheerimine viidi läbi kaks korda, kasutades esmalt 50% ACN/1% trifluoroäädikhapet (TFA) ja seejärel 100% ACN. Kõik ekstraktid ühendati ja mahtu vähendati, kasutades SpeedVac. Trüptilised peptiidid allutati massispektromeetrilisele sekveneerimisele, kasutades Q-TOF Ultima Global massispektromeetrit (Micromass, Manchester, UK), mis oli varustatud nanoflflow ESI Z-pihustiga. Valkude identifitseerimine viidi läbi Mascoti otsingumootoriga MSDB ja Swissproti andmebaaside vastu, kasutades peptiidi massi ja fragmentide tolerantsi 0, 5 Da.

CISTANCHE PARANDAB neeru-/NEerupuudulikkust

4.10. Valgu ekstraheerimine, SDS-PAGE, geel-trüptiline seedimine ja massispektromeetrilised analüüsid

Valgu muutuse massispektromeetriliseks kvantifitseerimiseks Calr/neerud, ühendati sama genotüübi ja sama ema proovid kokku. Piisavate kogumite genereerimiseks ning bioloogilise ja eksperimentaalse replikatsiooni tagamiseks kasutasime 6 erinevat tiine Cal plus // 8–10 embrüoga hiire kohta. Embrüonaalneneerudkolmest genotüübist koguti embrüotest ja valgu ekstraheerimine viidi läbi, kasutades ülalkirjeldatud lüüsipuhvrit. Valguekstraktid eraldati SDS-PAGE-ga, geelid värviti Coomassie Blue-ga, iga rada lõigati välja ja lõigati 20 võrdse suurusega viiludeks ning viilud allutati geelis seedimisele trüpsiiniga. Massispektromeetriliseks analüüsiks rikastati proove isepakitud pöördfaasi-C18 eelkolonnis (0,15 mm ID × 20 mm, Reprosil-Pur120 C{{11} }AQ 5 µm, Dr. Maisch, Ammerbuch-Entringen, Saksamaa) ja eraldati analüütilise pöördfaasilise C18 kolonniga (0.075 mm ID × 200 mm, Reprosil-Pur 120 C{ {21}}AQ, 3 µm, dr. Maisch), kasutades 30-minutilist lineaarset gradienti 5–35 protsenti atsetonitriili/0,1 protsenti sipelghapet (v:v) 300 nl min -1). Eluenti analüüsiti Q Exactive hübriidkvadrupool/orbitrap massispektromeetril (ThermoFisher Scientific, Dreieich, Saksamaa), mis oli varustatud FlexIon nanoSpray allikaga ja mida kasutati Excalibur 2.4 tarkvara all, kasutades andmetest sõltuvat hankimismeetodit. Iga katsetsükkel oli järgmisel kujul: üks täielik MS-skaneerimine sagedusvahemikus 350–1600 m/z saadi eraldusvõimega 70, 000 FWHM ja AGC sihtmärk 106 ning maksimaalne täitmisaeg 60 ms . Seejärel eraldati järjestikku 2,0 FWHM isolatsioonilaiusega kuni 12 kõige levinumat peptiidi prekursorit, mille laengu olekud 2 kuni 5 olid üle 2 × 104 intensiivsuse läve, killustati lämmastikuga normaliseeritud kokkupõrkeenergia seadistusega 25 protsenti ja saadud produktiioonide spektrid. salvestati eraldusvõimega 17 500 FWHM ja AGC sihtmärk oli 2 × 105 ja maksimaalne täitmisaeg 60 ms. Seejärel jäeti valitud prekursori m / z väärtused järgmise 15 sekundi jooksul välja. Iga proovi kohta saadi kaks tehnilist kordust. Peaklistid ekstraheeriti toorandmetest, kasutades Raw2MSMS tarkvara v1.17 (Max Plancki Biokeemiainstituut, Martinsried, Saksamaa). Valkude tuvastamine saavutati MASCOT 2.5.1 tarkvara (Matrixscience, London, UK) abil. Valgud tuvastati UniProtKB hiire võrdlusproteoomi v2017.09 (16930 valgu kirjet) ja 51 saasteaine komplekti, mida meie laboris tavaliselt tuvastatakse. Otsing viidi läbi ensüümina trüpsiini ja tsüsteiini blokeeriva ainena jodoatseetamiidiga. Lubatud oli kuni kaks vahelejäänud trüptilist lõhustamist ja muutuva modifikatsioonina metioniini oksüdatsiooni. Otsingu tolerantsid määrati lähteaine massi jaoks 10 ppm ja fragmendi massi jaoks 0, 05 Da ning instrumendi tüübiks määrati ESI-QUAD-TOF. Scaffoldi tarkvara versiooni 4.8.9 (Proteome Software Inc., Portland, OR, USA) kasutati MS/MS-põhiste peptiidide ja valkude tuvastamise valideerimiseks. Peptiidide identifitseerimine võeti vastu, kui neid suudeti Percolatori algoritmi abil kindlaks teha suurema kui 95,0 protsendilise tõenäosusega. Valkude identifitseerimine kärbiti vähemalt 2 kindlalt tuvastatud peptiidi puhul 1 protsendini. Valgu tabamused, mis sisaldasid sarnaseid peptiide ja mida ei olnud võimalik eristada ainult MS / MS analüüsi põhjal, rühmitati säästlikkuse põhimõtete järgi. Valgud, millel on olulisi peptiidide tõendeid, rühmitati klastritesse. Valkude arvukust hinnati nende spektraalarvude järgi pärast kogusummade normaliseerimist kõigi korduste vahel.

4.11. Western blot analüüs

Western blot analüüsid viidi läbi vastavalt Towbin et al. [52]. Võrdsed kogused valke (50–75 µg) eraldati polüakrüülamiidgeelelektroforeesiga (SDS-PAGE) ja kanti nitrotselluloosmembraanidele (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK). Membraanid blokeeriti 5-protsendilises rasvavabas kuivas piimas TBST-puhvris (20 mM Tris-HCl, pH 7.{10}} mM NaCl 0,1 protsenti Tween 20) ja inkubeeriti primaarsete antikehadega (anti-Calr, anti-antikehadega). -Rps10, anti-Rps19, anti-Rps26 ja anti-eIF5A) üleöö temperatuuril 4 °C. Valguribade visualiseerimiseks kasutati fluorestsentsmärgistatud sekundaarseid antikehi. Võrdse valgukoormuse kinnitamiseks töödeldi blotte anti-Actb või anti-GAPDH antikehadega (Sigma, Taufkirchen, Saksamaa).

4.12. Bioinformaatika

Tuvastatud valkude klassifitseerimine nende peamiselt tuntud ja oletatud funktsioonide järgi viidi läbi DAVID-i bioinformaatika abil (http://david.abcc. ncifcrf.gov, juurdepääs 21. veebruaril 2019) [53,54]. Geenisümboleid kasutati geeniontoloogia (GO) annotatsioonide (bioloogilised protsessid ja molekulaarsed funktsioonid) uurimiseks ja kategoriseerimiseks. Tuvastatud valkude teadaolevate ja prognoositavate valkude ja valkude interaktsioonide võrguanalüüs viidi läbi, kasutades STRING (interakteeruvate geenide/valkude otsimise tööriist) [55].

4.13. Statistiline analüüs

{{0}}DE puhul analüüsiti digitaliseeritud pilte ja geelide vahel sobitati punktid ning normaliseeriti Delta2D 3.4 (Decodon, Braunschweig, Saksamaa) abil. Delta2D arvutab iga tuvastatud koha jaoks "punkti kvaliteedi" väärtuse. See väärtus näitab, kui täpselt täpp esindab "ideaalset" 3D Gaussi kella kuju. Keskmise täpi mahu suhte põhjal loeti oluliseks laigud, mille suhteline ekspressioon muutus võrreldud proovide vahel kolmes korduses vähemalt 2- korda (suurenemine või vähenemine). Valgu regulatsiooni olulisuse analüüsimiseks viidi läbi Studenti t-test ja statistiline olulisus eeldati P väärtuste puhul, mis olid väiksemad kui 0,05. Kõik blotid kvantifitseeriti ImageJ tarkvara abil. Andmed koostati tarkvarapaketiga GraphPad Prism, versioon 8 (San Diego, CA, USA). Tarkvara kasutati graafiliseks esituseks ja analüüsiks kas Studenti t-jaotuse või ühesuunalise ANOVA abil. Tulemused on esitatud keskmisena ± sd vähemalt kolmest sõltumatust katsest. Erinevusi peeti statistiliselt olulisteks, kui p < 0,05.="" kuseteede="" pungade="" tipud="" ja="" nefronid="" loendati="" käsitsi="" ning="" andmed="" koostati="" tarkvarapaketiga="" graphpad="" prism,="" versioon="">