Sevofluraani lühiajaline sissehingamine võib vähendada gliiaarmi teket pärast hüpoksilis-isheemilist ajukahjustust vastsündinutel rottidel 1. osa

Abstraktne

Varasemad uuringud on näidanud, et sevofluraani järelkonditsioneerimine võib pakkuda neuroprotektsiooni pärast hüpoksilis-isheemilist vigastust ning parandada õppimis- ja mälufunktsiooni näriliste aju arengus.

Hüpoksilis-isheemiline kahjustus viitab patoloogilisele seisundile, mis on põhjustatud ajuisheemiast, hüpoksiast, ainevahetushäiretest ja närvirakkude kahjustusest, mis on tingitud südame-veresoonkonna ja ajuveresoonkonna süsteemi häiretest. Ühiskondliku arengu ja elustiili muutustega on hüpoksilis-isheemilised vigastused muutumas üha tavalisemaks. See seisund võib inimeste tervisele palju kahjustada, sealhulgas mõjutada intelligentsust ja mälu.

Kuigi hüpoksia ja isheemia võivad põhjustada ajufunktsiooni langust, ei tähenda see, et mälu mõjutaks negatiivselt. Vastupidi, õigete meetodite abil saame parandada mälu ja tõsta aju efektiivsust. Siin on mõned viisid, kuidas oma mälu parandada:

1. Tervislik toitumine: dieedi mõju mälule on väga oluline. Valkude, vitamiinide ja mineraalainete rikkad toidud võivad aidata säilitada terve närvisüsteemi ja mõtlemisfunktsiooni.

2. Treenige rohkem: füüsiline harjutus võib soodustada vereringet, suurendada hapniku voolu, tugevdada keha immuunsust ja vähendada haiguste riski. Treeningu abil saate parandada oma mäluvõimet.

3. Tugevdage enesekindlust: enesekindlus on inimese mälus oluline tegur. Kui usute, et suudate teatud ülesandega hakkama saada, saavutate hõlpsalt soovitud tulemused, samuti saate tõhusalt parandada oma mälu.

On näha, et hüpoksilis-isheemiline vigastus ei ole seisund, mis paratamatult kahjustaks inimese mälu. Niikaua kui valdame õigeid meetodeid ja hoolitseme oma aju eest hästi, saame positiivse suhtumisega omaks võtta terve tuleviku. On näha, et me peame parandama mälu ja Cistanche deserticola võib oluliselt parandada mälu, sest Cistanche deserticola on traditsiooniline Hiina ravimmaterjal, millel on palju ainulaadseid toimeid, millest üks on mälu parandamine. Cistanche deserticola efektiivsus tuleneb selles sisalduvatest mitmetest aktiivsetest koostisosadest, sealhulgas parkhape, polüsahhariidid, flavonoidglükosiidid jne. Need koostisosad võivad mitmel viisil edendada aju tervist.

Klõpsake nuppu Tea 10 võimalust mälu parandamiseks

Hüpoksilis-isheemilise vigastuse esilekutsumiseks kasutati klassikalist Rice-Vannucci mudelit ja vastsündinud (7. sünnijärgne päev) rotte raviti 2,4% sevofluraaniga 30 minutit pärast hüpoksilis-isheemilist vigastust.

Meie tulemused näitasid, et sevofluraani järelkonditsioneerimine parandas märkimisväärselt rottide õppimis- ja mälufunktsiooni, vähendas astroglioosi ja glialskari moodustumist, suurendas dendriitsete selgroogude arvu ja kaitses hipokampuse histomorfoloogiat. Mehhaaniliselt vähendas sevofluraani järelkonditsioneerimine von Hippel-Lindau hüpoksiast indutseeritava faktori -1 ekspressiooni ja suurendas DJ-1 ekspressiooni.

1,52 ug hüpoksiaga indutseeritava faktori -1 inhibiitori YC-1 (Lificiguat) süstimine vasakusse lateraalsesse vatsakesse 30 minutit enne hüpoksilis-isheemilist vigastust muutis sevofluraani poolt esile kutsutud neuroprotektsiooni. See leid viitab sellele, et sevofluraan võib tõhusalt leevendada astroglioosi hipokampuses ja vähendada õppimis- ja mäluhäireid, mis on põhjustatud gliaalarmi moodustumisest pärast hüpoksilis-isheemilist vigastust.

Selle aluseks olev mehhanism võib olla seotud ülesreguleeritud DJ-1 ekspressiooniga, hüpoksiaga indutseeritava faktori -1 vähenenud ubikvitinatsiooniga ja hüpoksiaga indutseeritava faktori -1 stabiliseeritud ekspressiooniga. Selle uuringu kiitis 9. novembril 2016 heaks Hiina meditsiiniülikooli laboratoorsete loomade hooldamise komitee (kinnitusnumber 2016PS337K).

Märksõnad: ajukahjustus; aju; kesknärvisüsteem; in vivo; vigastus; mudel; plastilisus; rott; taastumine; regenereerimine; remont Hiina raamatukogu klassifikatsiooni nr R453; R741; R614.{3}}.

Sissejuhatus

Vastsündinute hüpoksilis-isheemiline entsefalopaatia (HIE) on vastsündinu perioodi sagedane tüsistus, mida põhjustavad paljud tegurid, nagu vastsündinu asfüksia, emakasisene distress ja hüaliinmembraanihaigus (Douglas-Escobar ja Weiss, 2015; Barkhuizen et al., 2017).

HIE on imikute surmajuhtumite peamine põhjus ja neuroloogiliste tagajärgede peamine allikas (Edwards et al., 2010; Descloux jt, 2015). 90 protsendil HIE ellujäänutest on pikaajalised neuroloogilised düsfunktsioonid, nagu õppimis-, kognitiivsed ja motoorsed düsfunktsioonid ning epilepsia (Doi et al., 2012; Davies et al., 2019). Praegune HIE ravi keskendub peamiselt sümptomaatilisele ravile, sealhulgas mehaanilisele ventilatsioonile, hüpotensiooni korrigeerimisele, glükoosi lisamisele ja vajadusel vedeliku tarbimise piiramisele.

Siiski on vaja tõhusat ravi, mis suudab pikaajalist ajukahjustust tagasi pöörata või vähendada (Stankowski ja Gupta, 2011; Davidson et al., 2015). Õppimise ja äratundmise pöördelise osana on hipokampus, sealhulgas dentate gyrus (DG) , CA1 ja CA3 piirkonnad, osaleb perifeerse teabe transformeerimisel ja integreerimisel närvikeskustesse (Morris et al., 2012; Jung et al., 2020).

Hipokampus on ülitundlik hüpoksilis-isheemilise (HI) kahjustuse suhtes, mis võib esile kutsuda hipokampuse neuronite apoptoosi, stimuleerida liigset reaktiivset glioosi ja viia gliaalarmi moodustumiseni (Hopkins ja Haaland, 2004; Wang et al., 2012). Astrotsüütide proliferatsioon on ülioluline infarktikoha sulgemiseks, hipokampuse struktuuri ümberkujundamiseks ja kohalike immuunvastuste ajaliseks kontrollimiseks ägeda faasi ajal (Rolls et al., 2009).

Hüpertroofia ja gliiaarmi moodustumine soodustavad aga ebanormaalset neurogeneesi, takistavad dendriitide lülisamba kasvu ja takistavad sünapsi kuju, kahjustades veelgi õppimis- ja äratundmisfunktsioone (Yiuand He, 2006; Wanner et al., 2008; Burda ja Sofroniew, 2014; Pekny et al. , 2014; Shi et al., 2017).

Gliaalne fibrillaarne happeproteiin (GFAP) ja kondroitiinsulfaatproteoglükaanid, nagu neurokaan, on astroglioosi ja gliaalarmistumise patoloogilised markerid, mille ekspressiooni võivad kõrgelt aktiveeritud astrotsüütidega reguleerida (Pekny ja Nilsson, 2005; Choudhuryand Ding, 2016). Seega võib astroglioosi ja gliaalarmistumise pärssimine olla HIE ja selle pikaajaliste neuroloogiliste tagajärgede terapeutiline sihtmärk.

On näidatud, et sevofluraani kasutamine leevendab näriliste HI-kahjustusi. Uuringud, mis uurivad sevofluraani järelkonditsioneerimise (SPC) olulisust HI kahjustuste leevendamisel hüpoksiast põhjustatud faktori -1 (HIF-1) ülesreguleerimise kaudu täiskasvanud närilistel ja vastsündinud rottidel, on tuvastanud mitu võimalikku mehhanismi (Wang et al., 2019b; Yanget). al., 2019; Du et al., 2020; Liu ja Gong, 2020).

Hüpoksia võtmefüsioloogilise andurina on HIF{0}} transkriptsioonifaktor, mille sadu allavoolu molekule on seotud isheemiliste tolerantsuse mehhanismidega, nagu vaskulaarne endoteeli kasvufaktor ja erütropoetiin (Na et al., 2015). On tõestatud, et hüpoksiline järelkonditsioneerimine vähendab astrotsüütide ja mikrogliia aktivatsiooni pärast HI-d vastsündinute roti ajus (Teo et al., 2015).

Seetõttu püstitasime hüpoteesi, et HIF-1 võib kaasa aidata gliaalarmide ja astroglioosi tekkele. HIF-1 võib konstitutiivselt eksisteerida neuronites, mistõttu suureneb selle ekspressioon kiiresti ja akumuleerub hüpoksilistes tingimustes. Kuid kui hapnik normaliseerub, ei saa HIF1 ekspressiooni säilitada piisavalt kõrgel tasemel, et avaldada pidevalt neuroprotektiivset toimet, kuna prolüülhüdroksülaasi valkude poolt toimub hapnikust sõltuv lagunemine ja sellele järgnev ubikvitüleerimine von Hippel-Lindau (VHL) valkude poolt (Berra et al., 2003; Zhang et al., 2018).

DJ-1 (kodeeritud Park7) on väidetavalt neuroprotektiivne valk, eriti oksüdatiivsetes tingimustes (Aleyasin et al., 2007, 2010). VHL-valk suhtleb füüsiliselt DJ-ga-1, mis on määratud erapooletu massispektromeetria ekraani ja kinnitatud Parkinsoni tõve (PD) mudelis. Lisaks näitasid Parsanejad jt (2014), et DJ-1 pärsib VHL-sõltuvat ubikvitilatsiooni ja stabiliseerib HIF-1 ekspressiooni.

Seega püstitasime hüpoteesi, et sevofluraan stabiliseerib HIF-1 valku hipokampuses, reguleerides DJ-1 üles, et pärssida HIF-1 ubikvitilatsiooni, parandades seeläbi pikaajalist õppimist ja mälufunktsiooni.

HIF-1 rolli uurimiseks sevofluraani ja astroglioosi vahelises seoses kasutasime YC-1 (Lificiguat), HIF-1 selektiivset antagonisti, et täielikult pärssida HIF-1 ekspressiooni transkriptsioonijärgne tase. Selles uuringus uurisime HIF{5}a rolli SPC-ravi saanud HIE vastsündinute rottide neuroprotektsioonis.

Materjalid ja meetodid

Loomad
Loomuuringud viidi läbi rottide arengu sünaptilises staadiumis, mis algab 7. postnataalsel päeval (P7), mis vastab inimimiku kasvuperioodile raseduse lõpust kuni 3 aastani pärast sündi (Jevtovic-Todorovic et al., 2003). Seitsmepäevased Sprague-Dawley rotid kaaluga 12–16 g valiti 20 tiine roti hulgast (ostetud Hiina meditsiiniülikooli Shengjingi haigla laborist; isaste ja emaste suhe 1:1).

Kõik rotid said vabalt juurde pääseda veele ja toidule ning neid hoiti laboris standardse niiskuse ja temperatuuri juures 12-tunnise valguse/pimeduse (8.00/20.00) tsüklitega. Kõik loomkatsed viidi läbi vastavalt riiklike tervishoiuinstituutide (Bethesda, MD, USA) laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhistele.

Hiina Meditsiiniülikooli laboratoorsete loomade hooldamise komitee kiitis kirjeldatud katsed ametlikult heaks (Shenyang, Hiina; loa nr 2016PS337K) 9. novembril 2016.

25 tiine roti hulgast valiti 249 P7 rotti ja jagati juhuslikult rühmadesse juhuslike arvude tabeli alusel (Wang et al., 2019a). Meie lõplik analüüs hõlmas kokku 201 vastsündinud last; suremus pärast HI-ravi oli 19%.

Need 201 vastsündinud rotti jagati juhuslikult nelja rühma: võlts(n=54), HI (n=54), HI + sevofluraan (HIS) (n=54) ja HIS+ YC{{ 6}} (n=39) rühma. Igas rühmas kasutati 24 rotti Western blot testis, 5 kasutati immunohistokeemia ja Golgi värvimise jaoks ning 10 käitumise testimiseks. Ülejäänud 45 võlts-, HI- ja HIS-rühma rotti kasutati pöördtranskriptsiooni polümeraasi ahelreaktsiooniks (RT- PCR).

Eksperimentaalne disain ja kokkupuude anesteetikumiga

Kasutatud HIE mudelit kirjeldati varem (Zhao et al., 2007; Grandvuillemin et al., 2017). Päraku ja reproduktiivorganite vahelise kauguse põhjal viidi sünnijärgsete rottide sugu tuvastamine lõpule. HIE mudeli loomiseks pandi iga P7 roti pea läbipaistvasse plasttorusse, mis suleti enne sevofluranewa vabanemist puuvillaga (Wang et al., 2019a; Xue et al., 2019).

Iga roti vasakpoolne ühine unearter ligeeriti püsivalt ja kahe ligeerimise vahel lõigati arter läbi; iga operatsioon lõppes 5 minutiga. Seejärel ärkasid rotid anesteesiast mõjutamata ja pandi 2 tunniks tagasi nende emade puuridesse. SPC manustamiseks pandi rotid läbipaistvasse kambrisse (Lingzhi Company, Hangzhou, Hiina), mis oli ühendatud asevofluraani aurustiga; üks kanal aitas kaasa ventilatsioonile, teine ​​aga edastas gaasiproovi kambrist monitorile.

Kambrit ventileeriti võltsrühma jaoks 2 tundi 30% O2 ja 70% N2-ga, samal ajal kui HI rühmale manustati 2 tundi 8% O2 ja 92% N2. SPC määrati kohe pärast HI-d: 2,4% sevofluraani (1 minimaalne alveolaarkontsentratsioon) hingasid rotid sisse kambris, mille anatmosfäär oli 30% O2 ja 70% N2 ning õhuvoolu kiirus 2 l/min 30 minuti jooksul. Küttebassein stabiliseeris temperatuuri kambris 37 kraadini.

Ravimite manustamine

Täpselt 30 minutit enne HI-d süstiti vasakusse lateraalsesse vatsakesse (Paxinos ja Franklin, 2013) 1,52 ug HIF-1 inhibiitorit (YC1; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). 5-μLHamiltoni süstal (Yingweida Technology, Peking, Hiina). Nagu varem kirjeldatud, lahustati YC-1 tehislikus seljaajuvedelikus kontsentratsioonis 0,304 ug/μL (Shen et al., 2012; Na et al., 2015).

Western blot analüüs

P7 rotid anesteseeriti 2% sevofluraaniga ja 12, 24 ja 48 tundi ning 28 päeva pärast operatsiooni ekstraheeriti poegadelt hipokampuse koed. Pärast ekstraheerimist asetati koed kohe jääle.

Supernatandi koguvalgud eraldati radioimmunosadestamise analüüsivahendi lisamisega (Beyotime, Haimen, Hiina). Valgukontsentratsioonid määrati One BCA komplektiga (Beyotime).

Järgmisena eraldati proovid 12,5% naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidgeelidel ja kanti nitrotselluloosmembraanidele. Pärast blokeerimist 5% veise seerumi albumiiniga (Sigma-Aldrich) 4 kraadi juures inkubeeriti membraani sobivate primaarsete antikehadega, sealhulgas anti-glütseraldehüüdi 3-fosfaatdehüdrogenaasiga (GAPDH; 1:2000; Cat# 5174S; CellSignaling Technology , Danvers, MA, USA), anti-DJ-1 (1:1000;Cat# ab18257; Abcam, Cambridge, UK), anti-VHL (1:5000;polüklonaalne; Cat# ab77262; Abcam), anti -HIF-1 (1:900;polüklonaalne; Cat# ab2185; Abcam), neurokaanivastane (1:200;monoklonaalne; Cat# sc-33663; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) , postsünaptilise tihedusega valk 95 (PSD95; 1:1000; monoklonaalne; kat. nr 3409S; rakusignaalitehnoloogia), kasvuvastane valk 43 (GAP43; 1:2000; polüklonaalne; katnr 16971-1-AP; valgutehnoloogia biotehnoloogia , Chicago, IL, USA) ja anti-GFAP (1:5000, polüklonaalne, Cat# ab53554; Abcam).

Seejärel inkubeeriti blotte küülikuvastase IgG-ga (1:5000; Cat# ZB-2301; Zhongshanjinqiao, Peking, Hiina) oranti-hiire IgG-ga (1:5000; Cat# ZB-2301; Zhongshanjinqiao) 2 tundi toatemperatuuril.

Valgublotid visualiseeriti täiustatud kemoluminestsentsi tuvastamise reaktiividega (SuperSignal West Pico; Pierce, Rockford, IL, USA). Valgu ribad kvantifitseeriti ImageJ tarkvaraga (National Institutes of Health). Western blot analüüsimiseks normaliseeriti andmed GAPDH-le.

Immunohistokeemia

28 päeva pärast operatsiooni manustati rottidele anesteetikumi ülalkirjeldatud meetodil, perfuseeriti 4% formaliiniga ja nende aju eemaldati immunofluorestsentsvärvimiseks.

Ajud sukeldati 4% paraformaldehüüdi 4 kraadi juures 48 tunniks, seejärel dehüdreeriti astmelises etanooliseerias ja lõpuks sisestati parafiini. Järgmisena lõigati parafiiniga kaetud kuded vibratoomiga 25- μm paksusteks osadeks ja saadud lõike säilitati toatemperatuuril.

Iga aju lõigati pidevalt ja NeuN (neuronimarker), GFAP (astrotsüütide marker) ja neurocan (gliaalarmi marker) värvimiseks valiti kolm katkendlikku ajulõike. Topeltmärgistamiseks inkubeeriti koelõike kahe segatud primaarse antikehaga, sealhulgas kitse anti-antikehaga. GFAP (1:250; polüklonaalne; Cat# ab53554; Abcam), küüliku antigeenid (1:100; Cat# 12943; Cell Signaling Technology) ja/või hiire antineurokaan (1:200; monoklonaalne; Cat# sc{{ 10}};Santa Cruzi biotehnoloogia) 4 kraadi juures üleöö niisutatud kambris.

Seejärel pesti sektsioone 0,1 M fosfaatpuhverdatud soolalahusega ja inkubeeriti 2 tundi toatemperatuuril koos sobivate sekundaarsete antikehadega, sealhulgas küülikuvastase IgG-ga, mis oli konjugeeritud Alexa Fluoriga-594 (1:200;Life). Technologies, Grand Island, NY, USA), hiirevastane IgG, mis on konjugeeritud Alexa Fluoriga-594 (1:200; Life Technologies) ja kitsevastane IgG, mis on konjugeeritud fluorestseiini isotiotsüanaadiga (1:200; Life Technologies).

Rakutuumade vastuvärvimist viidi läbi 4',6-diamidino-2-fenüülindooliga (Beyotime) 5 minuti jooksul.

Värvitud lõikude vaatlemiseks kasutati Olympus BX51 mikroskoopi (OlympusCorporation, Tokyo, Jaapan). Igast lõigust valiti pildistamiseks juhuslikult kolm vasaku hipokampuse vaatevälja. Kvantitatiivse kolokalisatsiooni hindamiseks ja seetõttu Mandersi kattuvuse koefitsiendi arvutamiseks kasutati tarkvara ImageJ.

For more information:1950477648nn@gmail.com