Sevofluraani lühiajaline sissehingamine võib vastsündinutel rottidel vähendada gliiaarmi teket pärast hüpoksilis-isheemilist ajukahjustust, 2. osa

Reaalajas PCR

Kogu RNA ekstraheeriti poegade hipokampuse kudedest 12, 24 ja 48 tundi pärast operatsiooni, kasutades TRIzolreagenti (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Komplementaarne DNA sünteesiti täiustatud Superscript II RT-PCR komplekti (Invitrogen) abil.

Hüpoksilis-isheemiline kahjustus viitab patoloogilisele seisundile, mis on põhjustatud ajuisheemiast, hüpoksiast, ainevahetushäiretest ja närvirakkude kahjustusest, mis on tingitud südame-veresoonkonna ja ajuveresoonkonna süsteemi häiretest. Ühiskondliku arengu ja elustiili muutustega on hüpoksilis-isheemilised vigastused muutumas üha tavalisemaks. See seisund võib inimeste tervisele palju kahjustada, sealhulgas mõjutada intelligentsust ja mälu.

Kuigi hüpoksia ja isheemia võivad põhjustada ajufunktsiooni langust, ei tähenda see, et mälu mõjutaks negatiivselt. Vastupidi, õigete meetodite abil saame parandada mälu ja tõsta aju efektiivsust. Siin on mõned viisid, kuidas oma mälu parandada:

1. Tervislik toitumine: dieedi mõju mälule on väga oluline. Valkude, vitamiinide ja mineraalainete rikkad toidud võivad aidata säilitada terve närvisüsteemi ja mõtlemisfunktsiooni.

2. Treenige rohkem: füüsiline harjutus võib soodustada vereringet, suurendada hapniku voolu, tugevdada keha immuunsust ja vähendada haiguste riski. Treeningu abil saate parandada oma mäluvõimet.

3. Tugevdage enesekindlust: enesekindlus on inimese mälus oluline tegur. Kui usute, et suudate teatud ülesandega hakkama saada, saavutate hõlpsalt soovitud tulemused, samuti saate tõhusalt parandada oma mälu.

On näha, et hüpoksilis-isheemiline vigastus ei ole seisund, mis paratamatult kahjustaks inimese mälu. Niikaua kui valdame õigeid meetodeid ja hoolitseme oma aju eest hästi, saame positiivse suhtumisega omaks võtta terve tuleviku. On näha, et me peame parandama mälu ja Cistanche deserticola võib oluliselt parandada mälu, sest Cistanche deserticola omab antioksüdantset, põletikuvastast ja vananemisvastast toimet, mis võib aidata vähendada oksüdatsiooni ja põletikulisi reaktsioone ajus, kaitstes seeläbi närvisüsteemi tervis. Lisaks võib Cistanche deserticola soodustada ka närvirakkude kasvu ja paranemist, parandades seega närvivõrkude ühenduvust ja funktsiooni. Need mõjud võivad aidata parandada mälu, õppimist ja mõtlemiskiirust ning võivad samuti ära hoida kognitiivse düsfunktsiooni ja neurodegeneratiivsete haiguste teket.

Klõpsake teada, kuidas ajufunktsiooni parandada

DNA sünteesi tuvastamiseks reaalajas PCR abil HIF{2}}spetsiifiliste praimeritega kasutati fluorestseeruvat SYBR Green I värvi (SYBR Green PCRMaster Mix, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ja 1 µl pöördtranskribeeritud komplementaarset DNA-d.

Rootori geeni reaalajas DNA amplifikatsioonisüsteemis (Corbett Research, Sydney, Austraalia) viidi PCR läbi järgmiste tsüklitega: denatureerimine 95 kraadi juures 15 minutit; 40 tsüklit 95 kraadi juures (20 sekundit), lõõmutamine 58 kraadi juures 25 sekundit. ja tõmmake alla 72 kraadi juures 35 sekundiks. Fluorestseeruva toote jälgimine viidi läbi pikema aja jooksul 72 kraadi juures.

Majapidamisgeeni GAPDH standardiseerimiseks ja suhtelise geeniekspressiooni kvantifitseerimiseks kasutati rootori geenianalüüsi tarkvara (Corbett Research). Kõik praimerite järjestused on näidatud tabelis 1.

Nissl värvimine
Roti ajud valmistati viiludeks 28 päeva pärast operatsiooni, nagu on kirjeldatud ülalpool immunohistokeemia jaoks. Iga aju lõigati järjestikku ja Nissli värvimiseks valiti kolm sarnast ajuosa.

Kasutades Nikon C1 digitaalset mikroskoobikaamerat (Nikon Corporation, Tokyo, Jaapan), jäädvustati tüüpilised mikrofotod hipokampuse CA1, CA3 ja DGareas kohta. Igas kolmes sektsioonis loendatud mitu rakku viidi läbi pimestatud viisil, kasutades tarkvaraImageJ.

Käitumistestid

Rotid võõrutati 3 nädala pärast, jagati kolmeks kuni viieks rühmaks ja hoiti puurides vastavalt rühmade määramisele. Käitumistestid viidi läbi P28–P33 (st 21–26 päeva pärast operatsiooni) rottidega, nagu eelnevalt kirjeldatud (Wang et al., 2019a). ), kuid väikeste muudatustega. Et välistada estroositsükli mõju näriliste käitumisele, testiti ainult isaseid rotte.

Morrise veelabürint

Morrise veelabürindi testimist kasutati P28–P33 rottide ruumilise õppimise ja mäluvõime hindamiseks (Wang et al., 2019a).

Testimine koosnes kahest etapist, sealhulgas treeningosa ja ruumilise otsingu test. Viiel järjestikusel päeval viidi läbi neli treeningosakonda iga päev alates kell 8:00hommikul. Platvormi tuvastamise testimiseks paigutati igast rühmast 10 rotti eraldi vette erinevatesse kohtadesse, stohhastiliselt, näoga basseini seina poole.

Kui rott tuvastas platvormi edukalt 90 sekundi jooksul, oli ta sunnitud platvormil jääma 20 sekundiks ja platvormi tuvastamiseks kulunud aeg registreeriti põgenemislatentsina. Iga testimise voor kestis 90 sekundit ja põgenemislatentsi mõõdeti ajana, mis kulus roti vette asetamisest kuni eduka platvormile tõusmiseni.

Kui rotil ei õnnestunud platvormi 90 sekundi jooksul leida, peatati salvestamine ning viidi läbi õppimis- ja mälujuhised (eksperimenteerija juhtis roti platvormile pikka varrast ja lubas neil 20 sekundit platvormile jääda, et õppida). Katse ajal registreeriti lavale mitte sisenenud rottide põgenemislatentsiks 90 sekundit.

Kuuendal testimispäeval teostatud ruumisondi testis eemaldati platvorm ja rott pandi vastaskvadranti ja lasti 90 sekundit ujuda. Videojälgimissüsteem (Shanghai MobileDatum Ltd., Shanghai, Hiina) salvestas ujumiskiiruse, põgenemislatentsi ja platvormi varasema asukoha ületamise kordade arvu.

Vedrustuse test

Suspensioonikatse viidi läbi P28–P32 rottidega, et hinnata nende motoorset funktsiooni, alustades iga päev kell 15.00. Horisontaalne plastköis läbimõõduga 0,5 cm asetati maapinnast 45 cm kaugusele ja rotid juhiti mõlema ülemise jäsemega plastnöörist kinni hoidma, misjärel mõõdeti aega kuni roti kukkumiseni. suspensiooni latentsus. Katse lõppes, kui: (i) rott kukkus; ii) suspensiooni latentsusaeg oli üle 60 sekundi; või (iii) köis jäi kinni tagumiste jäsemete vahele.

Avatud väli test

Avatud välikatsed viidi läbi P28 rottidega, kasutades väliseadmeid, mis koosnesid pleksiklaasist kastist (100 cm × 100 cm; Borj Sanat, Teheran, Iraan), mis oli ümbritsetud 45- cm kõrguse seinaga, mille põrand oli jagatud 16 ruuduks. Keskala oli 50 cm × 50 cm ala areeni keskel. Iga rott paigutati eraldi areeni keskele ja neil lubati piiranguteta 10 minutit uurida.

Videojälgimissüsteemi (Borj Sanat) kasutati koguplaani (harjutuste aktiivsuse näitajana) ja keskosas veedetud aja (ärevuskäitumise indikaatorina) salvestamiseks ja analüüsimiseks (Zhai etal., 2019).

Golgi värvimine

Pärast käitumistestide lõpetamist (st 26 päeva pärast operatsiooni) valiti igast rühmast juhuslikult viis rotti. Golgi värvimine viidi läbi 150-μm paksustele külmutatud ajuosadele, kasutades FD Rapid Golgi värvimiskomplekti (FDNeuroTechnologies, Columbia, MD, USA) vastavalt tootja protokollile.

Iga neuroni lülisamba tiheduse (lülisamba arv 10 μm kohta) analüüsimiseks kasutati tarkvara ImageJ. Odrad loendati kahe või kolme sekundaarse dendriidi segmendiga.

Statistiline analüüs

Andmete analüüsimiseks kasutati SPSS 17.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA), mis on näidatud kui keskmine ± keskmise standarderror (SEM). Kõigi pidevate muutujate normaalsuse eelduse testimiseks kasutati Shapiro-Wilki testi. Lisaks kasutati katsete reas ühesuunalist dispersioonanalüüsi, millele järgnes Tukey's post hoc mitmekordne võrdlustest.

Kui andmed ei vastanud normaalsuse eeldusele, viidi Kruskal-Wallis H test või Mann-Whitney Utest eraldi läbi. Põgenemislatentsust analüüsiti iteratiivsete mõõtmiste kahesuunalise dispersioonanalüüsi põhjal. P väärtusi < 0,05 peeti statistiliselt oluliseks.

Tulemused

SPC parandab hipokampuse neuronaalsete rakkude kadu

Hipokampus, sealhulgas kolm uuritud piirkonda, on seotud õppimise ja mäluga (Jung et al., 2020). Hipokampuse arhitektuuri uurimiseks viidi läbi pärast käitumistesti Nissli värvimine.

HI rühmas vähenes elujõuline neuronaalne tihedus võrreldes võltsrühmaga. Siiski suurenes SPC-ga kokku puutunud loomadel neuronite arv; selle efekti muutis YC-1, mis vähendas neuronitihedust (joonis 1A). Seda nähtust täheldati hipokampuse CA1, CA3 ja DG piirkondades (P< 0.05; Figure 1B–D).

SPC parandab ja vähendab dendriitide lülisamba tihedust hipokampuse CA1 piirkonnas

Golgi värvimist kasutati CA1 püramiidse neuronaldendriitilise selgroo tiheduse tuvastamiseks (joonis 2A). Kuna ogade suurused on väga erinevad (nt hargnenud dendriidid, õhukesed või seentega), tegime kindlaks ainult, et dendriitsete ogade tihedus oli HIS-rühmas HI-rühmaga võrreldes oluliselt suurenenud (P < 0). }}5), samas kui dendriitsete okkade tihedus oli HIS + YC -1 rühmas võrreldes HIS rühmaga vähenenud (P < 0,01; joonis 2B).
SPC parandab PSD95 ja GAP43 ekspressiooni hipokampuses

Hindasime sünapsiga seotud valkude GAP43 ja PSD95 ekspressiooni, et teha kindlaks, kas neid inhibeerisid gliaalarmid. HI vähendas märkimisväärselt PSD95 (P < 0.01) ja GAP43 (P < 0,05) valgu ekspressiooni võrreldes varirühmaga (joonis 2C–E). Võrreldes HIS-rühmaga langesid PSD95 ja GAP43 ekspressioonitasemed pärast YC{12}}süstimist märkimisväärselt.

Astroglioosi ja gliaalarmide moodustumine kahjustab pärast HI-d hipokampuse arhitektuuri

Järgmisena proovisime kontrollida, kas sevofluraan parandas õppimist ja mälufunktsiooni, kaitstes hipokampuse arhitektuuri ja nõrgendades astroglioosi. Vastsündinute HIE-indutseeritud neuronaalne apoptoos hipokampuses, samuti reaktiivne astroglioos infarkti piirkonnas, mis seejärel areneb gliiaarmiks (Rolls et al., 2009).

HI rühmas näitasid CA1 ja CA3 püramiidikihid ja DG piirkond neuronite arvu vähenemist (P < 0.01, P < 0.001; joonised 3E ja 4C), samuti selgete morfoloogiliste muutustega astrotsüütide arvu suurenemine (P < 0,001; joonised 3C ja 4B). Hindasime GFAP ja NeuN ekspressiooni vasaku hipokampuse kolmes piirkonnas, kasutades immunohistokeemiat ja Western blot analüüsi.

Meie tulemused näitasid, et võrreldes võltsrühmaga aktiveeriti astrotsüüdid HI-rühmas, sisestati CA1 (joonis 4A) ja CA3 (joonis 3A) püramiidkihti ning ümbritsesid neuroneid DG-s (joonis 3B). Liigne astroglioos põhjustas gliiaprotsesside edasise laienemise normaalsete neuronaalsete struktuuride suunas, moodustades ebanormaalse seinataolise astrotsüütide võrgu (joonised 3A, B ja 4A).

Lisaks suurenes GFAP-i immunoreaktiivsus (joonised 3C, D ja 4B, E) ja valgu tase (P < 0.01; joonis 4E), samas kui NeuN-i immunoreaktiivsus vähenes (P < {{7} },01 või P < 0,001. Joonised 3E, F ja 4C). Gliaarmi moodustumise täiendavaks kontrollimiseks hindasime neurokanproteiini ekspressioonitasemeid ja immunoreaktiivsust hipokampuses (joonised 5A, B ja 6A).

Topeltmärgistamise immunofluorestsentsi tulemused näitasid märkimisväärseid erinevusi neurocan+/GFAP+ immunovärvimise fluorestsentsi intensiivsuses HI ja võltsrühmade vahel (P < 0.001, P < 0,05, P < 0,01; Joonised 5G, H ja 6D), mis on kooskõlas Western blot tulemustega (P< 0.01; Figure 6F).

SPC nõrgendab astroglioosi ja gliaalarmi teket hipokampuses

Järgmisena uuriti meie uuringus, kas SPC nõrgendas gliaalarmi teket. Võrreldes HI-rühmaga oli GFAP-i (joonised 5C, D ja 6C) ja neurokaani (joonised 5E, F ja 6B) immunoreaktiivsus HIS-rühmas hipokampuses märgatavalt allareguleeritud (P < 0.{{6} }1 või P < 0,001).

Seevastu GFAP ja neurokaanide ekspressioon HIS + YC-1 rühmas oli märkimisväärselt suurenenud võrreldes HIS rühmaga ega erinenud HIS + YC-1 ja HI rühmadest (P > 0,05; joonis 6E ja F).

Lisaks oli NeuN-i immunopositiivsus ülesreguleeritud ja struktuurid paistsid HIS-rühmas korrapärasemad kui HI-rühmas, mille YC{0}} muutis vastupidiseks (joonised 3E, F ja 4C).

For more information:1950477648nn@gmail.com