Aspergillus Favus "jojoba endofüüdi" taksooli vähivastase aktiivsuse suurendamine kiiritusel vahendatud kulla nanoosakestega konjugeerimise teel

Taxol alternatiivsed Hiina maitsetaimed Cistanche

Märksõnad:Aspergillus favus · Jojoba · Endofüütsed seened · Kulla nanoosakesed · Taksool · -Kiiritus · Toitumisalane optimeerimine

Sissejuhatus

Taxol on üks enim turustatud laia toimespektrigavähivastased ravimid[1]. Taksooli aktiivsus tuleneb selle ainulaadsest spetsiifilisusest seondumisel rakulise tubuliini subühikute heterodimeeriga, soodustades tubuliini polümerisatsiooni, häirides seega kasvajarakkude mitootilist jagunemist [2]. Taksoolil oli tugev toime rinna-, kopsu-, pea- ja kaelavähi, emakavähi ja Kaposi sarkoomi kaugelearenenud vormide vastu [3]. Taksooli toodeti esmalt jugapuu koorest Taxus brevifolia "perekond Taxaceae" [4, 5]; Siiski on taksooli madalam saagis<0.001%, i.e., to produce 1 g Taxol, it requires~10 kg of plant bark that collected from 3 to 5 trees [6], is the main challenge. In addition, the vulnerability of this plant to unpredicted fluctuations with the environmental conditions strongly influences the Taxol yield, heterogeneity, and reproducibility [7–9]. Exploring the Taxol producing potency of the endophytic fungi inhabiting medicinal plants raises the hope for overcoming the low yield by the above-mentioned method [10, 11], due to their fast growth, cost-effectiveness, independence on climatic changes, and feasibility for genetic manipulation [12, 13]. Subsequently, a plethora of endophytic fungi with metabolic potency to produce Taxol has been reported as reviewed [1, 14–25]. However, the anticipation of these fungi for industrial production of Taxol has been challenged by the attenuation and loss of Taxol productivity by the fungal storage and multiple subculturing [21, 22, 26–28]. Thus, searching for a novel fungal isolate with affordable metabolic stability and sustainability for Taxol production is the challenge. Medicinal plants of well-known ethnopharmacological relevance and traditional pharmaceutical applications could be the repertoire of novel fungal isolates with unique features of metabolic stability for Taxol biosynthesis. Among the most common medicinal plants, jojoba "Simmondsia chinensis" is a monogenetic dioecious grey-green shrub belonging to the Simmondsiaceae family. Jojoba seeds contain up to 65% of light golden and odorless high-viscosity oily metabolites [29]. Jojoba oil has been frequently used for the relief of headaches, throat inflammation, and wound treatment [30, 31]. As well as Jojoba oil has been used as an anti-inflammatory and antimicrobial agent [30, 31]. The leaves of jojoba are rich with antioxidant flavonoid compounds that are traditionally used for treating of various disorders such as astma,põletikjavähk[32]. Seega oli selle töö põhieesmärk uurida uut seene isolaati jojoba taimest, millel on taksooli tootmiseks ainulaadne metaboolne stabiilsus, hinnata erinevaid lähenemisviise nende taksooli saagise maksimeerimiseks, samuti ekstraheeritud taksooliühendite antiproliferatiivse aktiivsuse suurendamiseks. konjugatsiooni kaudu kulla nanoosakestega, mida vahendab gammakiirgus.

Materjalid ja meetodid

Endofüütsete seente isoleerimine ja kultiveerimine

Jojoba (Simmondsia chinensis) erinevad osad, nagu lehed, koored, oksad ja pungad, koguti Kairo ülikooli põllumajandusteaduskonnast ja kasutati endofüütsete seente allikana. Taimeosad koguti ja pesti jooksva kraaniveega, pind steriliseeriti 70% etanooliga 1 minut ja seejärel loputati steriilse veega [28]. Pinnaga steriliseeritud taimeosad lõigati steriilsetes tingimustes väikesteks tükkideks ja asetati kartulidekstroosagari (PDA) söötme, Czapek's-Doxi ja linnaseekstrakti agarisöötmega plaatidele [33–36] ning plaate inkubeeriti 30 kraadi juures. 10 päeva. Taimeosade pindmiste steriliseerimise efektiivsust hinnati loputusvee tsentrifuugimisega, seejärel lisati sademele 500 ul steriilset vett ja plaaditi PDA söötmesse [37]. Puhastatud endofüütsete seente isolaate inokuleeriti PDA kaldustele 7 päevaks ja säilitati 4 kraadi juures.

Taksooli sõelumine, ekstraheerimine ja kvantifitseerimine endofüütilistest seentest

Taastatud jojobas elavaid endofüütilisi seeni skriiniti taksooli tootmise suhtes, kasvatades kartulidekstroosi puljongil (PDB) [38]. Üks pistik igast 7 päeva vanusest fungal isolaadist inokuleeriti 100 ml PDB/250 ml Erlenmeyeri ülesannetesse, inkubeeriti 15 päeva 30 ± 1 kraadi juures loksutamistingimustes (120 rpm). Pärast inkubeerimist kultuurid filtriti ja filtraati täiendati 0,2% naatriumvesinikkarbonaadiga, et sadestada rasvhappeid. Taksooli ekstraheeriti diklorometaaniga, orgaaniline faas koguti ja aurustati kuivaks ning jäägid lahustati uuesti metanoolis [17, 39]. Taksool eraldati ja identifitseeriti TLC abil, kasutades Mercki 1 mm (20 × 20 cm) eelnevalt kaetud silikageeli plaate (TLC Silica gel 60 F254, Darmstadt, Saksamaa), mis tuvastati UV-valgustusega 254 nm juures [39]. Taksooli oletatavad laigud kaabiti TLC silikageeli plaatidelt ja lahustati metanoolis, segati intensiivselt 10 minutit ja tsentrifuugiti kiirusel 1000 p/min 5 minutit. Sadestunud ränidioksiidi osakesed eemaldati ja supernatant võeti taksooli kvantifitseerimiseks ja puhtuse kontrollimiseks HPLC-ga (YOUNG In, Chromass, 9110 pluss Quater nary Pump, Korea) C18 pöördfaasikolonnis (Eclipse Plus C18 4.6). × 150 mm, 3,5 μm, kat. nr 959 963–902). Kasutatud liikuv faas oli metanool/atsetonitriil/vesi (25:35:40, maht/maht) voolukiirusel 1,0 ml/min 20 minuti jooksul [40] ja taksooli fraktsioonid mõõdeti lainepikkusel 227 nm ja nende fraktsioonid. keemiline identsus ja kontsentratsioonid kinnitati retentsiooniaja ja absorptsioonipiigi pindala põhjal, võrreldes autentse prooviga.

Taastatud endofüütsete seente morfoloogiline ja molekulaarne identifitseerimine

Endofüütsed seente isolaadid identifitseeriti nende liikide tasemel nende makro- ja mikromorfoloogiliste tunnuste põhjal, kasvatades PDA, Czapek's-Doxi ja linnaseekstrakti söötmetel vastavalt viiteklahvidele [33–36]. Kõige võimsamate taksooli tootvate seente isolaatide identsus kinnitati täiendavalt molekulaarselt sisemise transkribeeritud speisseri (ITS) järjestuse põhjal [41, 42]. Seene genoomne DNA (gDNA) ekstraheeriti seeneniidistiku (~0,2 g) pulbristamise teel vedelas lämmastikus ja seejärel 1 ml CTAB ekstraheerimispuhvris (2% CTAB, 2% PVP40, { {21}},2% 2-merkaptoetanool, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl 100 mM Tris-HCl-s, pH 8,0). PCR praimerite komplektid olid ITS4 5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3′ ja ITS5 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′. PCR-reaktsioon sisaldab 10 ul 2 × PCR põhisegu (i-Taq™, kat. nr 25027), 2 ul gDNA-d, 1 ul iga praimerit (10 pmol/ul) ja 20 ul steriilse destilleerimisega. vesi. PCR programmeeriti esialgseks denaturatsiooniks 94 kraadi juures 2 minutiks, denaturatsiooniks 94 kraadi juures 30 sekundiks, lõõmutamiseks 55 kraadi juures 10 sekundiks, pikendamiseks 72 kraadi juures 30 sekundiks 35 tsükliks ja lõplikuks pikendamiseks 72 kraadi juures 2 sekundiks. min. PCR amplikone analüüsiti 1,5% agaroosgeeliga 1 × TBE puhvris (Ambion Cat# AM9864), kasutades 1 kb DNA redelit (Kat. # PG010-55DI) ja visualiseeriti geeli dokumentatsioonisüsteemiga. Amplikonid puhastati ja sekveneeriti rakendusega Applied Biosystems Sequencer, HiSQV Bases, versioon 6.0 samade praimerite komplektidega. Saadud järjestusi otsiti BLAST-i abil NCBI andmebaasist, imporditi MEGA 6.0 tarkvarasse ja joondati Clustal W lihaste algoritmiga [43] ning fülogeneetiline puu konstrueeriti MEGA 6.0 [44] naaberliitumise meetodil.

Ekstraheeritud taksooli keemiline struktuur

Taxoli oletatavad laigud kaabiti TLC silikageeli plaatidelt ja puhastati ning puhtus ja kontsentratsioon määrati UV-Vis analüüsiga lainepikkusel λ 227 nm (RIGOL, Ultra-3000 Series) võrreldes autentse Taxol'iga. [39]. Spektrofotomeetriliste analüüside negatiivse baasjoonena kasutati samadel tingimustel tühja söödet. Puhastatud taksooli proovide FT-IR spektrit analüüsiti JASCO FT-IR 3600 spektrofotomeetriga. Taksooli proov jahvatati KBr graanulitega, pressiti vaakumis ketasteks ja absorptsiooni mõõdeti vahemikus 400 kuni 4000 cm−1 [3], võrreldes autentse prooviga. Ekstraheeritud taksooli keemilist struktuuri kinnitati HNMR-spektroskoopia abil (JEOL, ECA-500II, 500 MHz NMR) võrreldes autentse taksooliga. Proovid lahustati CDCl3-s, keemilised nihked on antud ppm-des (δ-skaala) ja sidestuskonstandid on väljendatud hertsides (Hz).

Erinevat tüüpi kandjate mõju taksooli tootmisele

Kaks agarikorki (9 mm) iga seene isolaadi 7 päeva vanustest kultuuridest inokuleeriti kolmes korduses 100 ml söötme/250 ml Erlenmeyeri kolbi, mis sisaldas kartulidekstroosi (PDB), Czapekʼs-Doxi (CZD), M1D ja linnaseekstrakti (ME). ) puljongisöödet. Negatiivse kontrollina kasutati iga söötme inokuleerimata kontrolle, mis olid vabad seeneeostest, inkubeeriti 30 kraadi juures 15 päeva samadel tingimustel. Pärast inkubeerimist seenekultuurid filtriti ja taksool ekstraheeriti ja määrati ülalmainitud viisil.

Toitumistingimuste bioprotsessi optimeerimine taksooli saagise maksimeerimiseks

Söötme koostise optimeerimine, et maksimeerida taksooli saagist tugeva seente isolaadiga, viidi läbi reaktsioonipinna metoodika abil, kasutades Placket-Burmani disaini, millele järgnes keskne komposiitkujundus [17–2{6}}, 45]. RSM-i disainilahenduste põhjal hinnati positiivseid ja olulisi muutujaid, mis mõjutavad taksooli tootmist tugeva seeneisolaadi poolt, kasutades Design-Expert 7.0 (Stat Ease Inc., Minneapolis, USA) statistilist tarkvarapaketti. Iga katse viidi läbi kolmes bioloogilises korduses ja arvestati keskmisi väärtusi. Pärast inkubeerimist soovitud tingimustes, seente biomass filtriti ja taksool ekstraheeriti ja kvantifitseeriti TLC ja HPLC abil, nagu ülalpool kirjeldatud.

Placket-Burmani disain

Placket-Burmani disaini on sageli kasutatud söötme komponendi optimeerimiseks seente kasvu ja bioaktiivsete sekundaarsete metaboliitide tootmiseks, hinnates taksooli tootmist mõjutavaid olulisi muutujaid [18, 2{6}}, 46]. Faktori valik põhines kvalitatiivses ja kvantitatiivses sõeluuringus kasutatud meediumitel. Kaasatud on 11 tegurit; linnaseekstrakti, peptooni, sahharoosi, soytooni, glutamiini, veiseliha ekstrakti ja temperatuuri, pH, inkubatsiooniaja ja loksutamiskiiruse väärtusi ja tegureid varieeriti kahel tasemel ning valiti minimaalse ja maksimaalse taseme vahemikud. 12 katsest koosneva komplekti loomiseks kasutati statistilist Design-Expert 7.0. Iga katse jaoks määrati taksooli tootmine kolmes bioloogilises korduses ja arvestati taksooli saagise keskmist.

Andmete regressioonanalüüs viidi läbi statistilise tarkvara abil. Iga muutuja mõju arvutati (Biometrika, 2020), kasutades järgmist võrrandit:

kus E on testimismuutuja mõju, M pluss ja M- on taksooli kontsentratsioon uuringutes, mille parameeter oli vastavalt kõrgemal ja madalamal tasemel, ja N on läbiviidud katsete arv. Iga muutuja mõju toodangule määrati nende vastavate E-väärtuste arvutamise teel.

Kus Tot high on vastuste koguarv kõrgel tasemel, Tot low on vastuste koguarv madalal tasemel ja Ei on katsete arv.

Keskne komposiitkujundus ja taksooli tootmist mõjutavate tegurite koostoimed

Kõige olulisemad positiivsed tegurid, mis mõjutavad taksooli tootmist valitud seene isolaadi poolt, optimeeriti vastuse pinnatüübiga CCD mudeli eksperimentaalse disaini abil [47]. CCD-d kasutades optimeeriti söötme komponentide kontsentratsioone ja nende uuritud interaktsioone kasutati kolme muutuja jaoks kokku 20 katse genereerimiseks. Et määrata kindlaks muutujate optimaalsed tasemed taksooli tootmiseks tugevast seeneisolaadist, joonistati kolmemõõtmelised (3D) vastuse pinnakõverad, et uurida erinevate tegurite vahelist koostoimet ja määrata iga taksooli tootmist mõjutava teguri muutuv seisund. 3D-graafikud viidi läbi, hoides kolme teguri konstandi ideaalsel tasemel ja joonistades saadud taksooli saagise vastuse kahe ülejäänud teguri erinevate tasemete jaoks.

Gamma kiiritamise mõju taksooli saagisele

Tugevaid endofüütilisi isolaate, mis tootsid taksooli, kiiritati 60koobaltiallikaga (gammarakk 4000-A-India) erinevate gammakiirgusdooside (0,25–3,0 kGy) juures. kiiritamata kultuuri kontrollimiseks; doosikiirus 1,2 kGy/h katse ajal. Optimeeritud sööde inokuleeriti kiiritatud kultuuriga standardsetes kultiveerimistingimustes, võrreldes kiiritamata eoste inokulaadiga kontrollina. Kultuure inkubeeriti 30 ± 2 kraadi juures 15 päeva pöördloksutil (120 pööret minutis). Pärast inkubeerimist kultuurid filtriti ja taksool ekstraheeriti, puhastati ja kvantifitseeriti TLC ja HPLC abil, nagu eespool kirjeldatud.

kulla nanoosakeste (AuNP) süntees ja iseloomustus; Konjugatsioon taksooliga

Taksooli vähivastane toime

Puhastatud taksooli ja taksool-PVP-AuNP konjugaatide aktiivsus maksakartsinoomi (HPG2) ja rinnakartsinoomi (MCF7) vastu määrati 3- (4,5-dimetüültiasool- 2-üül) abil -2,5-difenüültetrasooliumbromiidi (MTT) test [48]. 96-Süvendi plaadile külvati 103 rakku süvendi kohta ja inkubeeriti üleöö 37 kraadi juures, seejärel lisati erinevad kontsentratsioonid ravimit ja plaate inkubeeriti uuesti 48 tundi. Lisati MTT reagent (25 ul) ja inkubeeriti 2 tundi ning väljatöötatud formazaani kompleksi lillat värvi mõõdeti lainepikkusel λ570 nm. IC50 väärtust väljendati ravimi kogusena, mis vähendas 50 protsendi võrra kasvu esialgsest kasvajarakkude arvust, mis normaliseerusid positiivseks kontrolliks.

Taksooli ja Taxol-AuNP konjugaatide antimikroobne toime

Taxol ja Taxol-AuNPs konjugaatide antimikroobset aktiivsust hinnati erinevate bakteriisolaatide suhtes; Bacillus subtilis ATCC 6633 ja Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli ja Enterobacter agglomerans, lisaks Candida albicans'ile. Testitud bakterirakud suspendeeriti steriilses peptoonvees, et saada standardne inokulaat ~0,5 McFarland (1–1,5) × 1{{10}}8 CFU/ml juures λ6{{18 }}0 nm. Mikroobsete patogeenide kasvu kasvu pärssimist (mm) hinnati agariketta difusioonimeetodil. Positiivse kontrollina kasutati steriilseid standardseid antibiootikumikettaid läbimõõduga 6,0 mm. Steriilsed antibiootikumikettad (6,0 mm) laaditi negatiivse ja positiivse kontrollina 20 ul metanooli ja amoksitsilliin-klavulaanhappega (AMC). Kettad laaditi sama kontsentratsiooniga taksooli, Taxol-PVP-AuNP-de ja AuNP-dega (1,0 ug/ml). Valmistati kolm bioloogilist kordust. Plaate inkubeeriti 37 kraadi juures 24 tundi ja mõõdeti inhibeerimistsoonid. Taxoli antimikroobse toime normaliseerimiseks kasutati amoksitsilliini klavulaanhapet (AMC) ja nüstatiini. Kasvu inhibeerimise tsoon määrati noonuse nihikuga (mm).

Statistilised analüüsid

Tugevate taksoolitootjate morfoloogiline ja molekulaarne identifitseerimine

Taksooli tootva tugeva seeneisolaadi morfoloogilisi tunnuseid uuriti makroskoopiliste ja mikroskoopiliste kirjeldavate võtmete järgi, nagu on kirjeldatud jaotises Materjalid ja meetodid, ning selgus selle morfoloogiline lähedus A. favus'ega (joonis 2). Seene isolaati kasvatati PDA-s 30 kraadi juures 10 päeva ning makroskoopilised ja mikroskoopilised tunnused näitasid selle identiteeti, nagu koniidipead, hargnemisviis, häbimärgistuse identsus ja konidiaalne ontoloogia ning viljakehade moodustumine vastavalt universaalsele standardile. morfoloogilised võtmed [33] ja leiti, et need on identsed Aspergillus favus'ega. Tugev taksooli tootv isolaat A. favus identifitseeriti täiendavalt nende ITS järjestuste põhjal, kasutades matriitsina gDNA-d. A. favus'e PCR amplikonid (~550 aluspaari) lahutati, puhastati ja sekveneeriti (joonis 2). A. favus'e ITS-järjestust otsiti NCBI andmebaasis mitteliigne kiirotsing, mis näitas 99-protsendilist sarnasust A. favus'ega, null E. väärtust ja 95-protsendilist päringu katvust. Seega kinnitati mikroskoopiliste ja molekulaarsete analüüside põhjal sihtmärgiks isolaat kui A. favus ja deponeeriti GenBanki registrinumbriga MW485934.1, samuti on isolaat deponeeritud Assiuti ülikooli mükoloogiakeskusesse (AUMC), Egiptus. ladestamisnumber AUMC13892. Praegusel isolaadil oli 99-protsendiline sarnasus A. favus isolaatidega MW485934, MT446145, KJ863514, MW522551,

Joonis 1 Jojoba taime morfoloogiline vaade. B Tugevate taksooli tootvate endofüütsete seente plaadikultuurid; A. favus Bd1 (13), A. niger Lv1 (21), Penicillium polonium (23) ja A. oryzae Bd (25) PDA-l pärast 8-päevast inkubeerimist 30 kraadi juures. Seene isolaate kasvatati PDB-s ja inkubeeriti standardtingimustes ning taksool ekstraheeriti ja kontrolliti TLC-ga (C). D Tugevate seente isolaatide taksooli HPLC kromatogramm. E Taksooli saagis kvantifitseerituna HPLC-ga. F, seene isolaatidest ekstraheeritud taksooli UV-Vis spektraalanalüüs. Ekstraheeritud taksooli G FT-IR analüüs võrreldes autentse analüüsiga

Joonis 2 Jojoba endofüüdi A. favus'e makromorfoloogilised tunnused pärast 3-, 5- ja 8-päevast kasvu PDA-l. Mikromorfoloogilised tunnused, A. favus'e konidiaalne pea 400-kordse suurendusega. A. favus ITS piirkonna 500 bp PCR amplikon, normaliseerub 1 kb redelile (Kat. nr. SM0312). D ITS A. favus'e fülogeneetiline analüüs maksimaalse tõenäosuse meetodil [44]