Bioaktiivsed bakteriaalsed nanotselluloosi membraanid, mis on rikastatud Eucalyptus Globulus Labilliga. Jätab vesiekstrakti vananemisvastaseks nahahoolduseks

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Abstraktne:Märkimisväärsete füüsikaliste ja mehaaniliste omadustega bakteriaalse nanotselluloosi (BNC) membraanid kujunesid mitmekülgseks bioaktiivsete ühendite biopolümeerseks kandjaks nahahoolduseks. Selles uuringus laaditi BNC-membraanid glütserooliga (plastifikaatorina ja niiskusesäilitajana) ja Eucalyptus globulus Labilli hüdrodestilleerimisel saadud vesiekstrakti erinevates annustes (1-3 ug cm-2). lehed (HDE), kasutamiseks lehtede näomaskidena. Kõik membraanid on vastupidavad ja väga tempermalmist nii kuivas kui märjas olekus ning nende mehaanilised omadused on sarnased või isegi paremad kui kaubanduslikul BNC maskil. Lisaks leiti, et HDE annab puhtale BNC-le annusest sõltuva antioksüdantse toime. Lisaks kinnitati pärast 3-kuulist ladustamist 22-25 kraadi ja 52% suhtelise niiskuse (RH) või 40 °C ja 75% suhtelise õhuniiskuse juures, et membraani antioksüdantne aktiivsus ja makroskoopiline aspekt 2 ug cm{10 }} HDE-st säilitati. Samuti selgus, et membraanid ei ole HaCaT ja NIH/3T3 rakkude suhtes tsütotoksilised ning 2 ug cm{15}} HDE-ga membraan põhjustas NIH/3T3 rakkudes vananemisega seotud galaktosidaasi aktiivsuse olulise vähenemise. Need leiud viitavad saadud membraanide sobivusele ja potentsiaalile bioaktiivsete näomaskidena vananemisvastastes rakendustes.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Märksõnad:bakteriaalne nanotselluloos; Eucalyptus globulus Labill. lehed; vesiekstrakt; antioksüdantne aktiivsus; Leht näomaskid; Vananemisvastane; nahahooldusrakendused

1. Sissejuhatus

Maailma rahvastik vananeb märgatavalt tänu sündimuse langusele ja elulemuse paranemisele ning sellest tulenevalt keskmise eluea pikenemisele, mis on seotud viimastel aastakümnetel saavutatud meditsiini ja tehnoloogia arenguga [1,2]. Eeldatakse, et 60-aastaste ja vanemate inimeste arv maailmas ulatub 2050. aastaks ligikaudu 2,1 miljardini, mis tähendab ligikaudu kahekordset kasvu võrreldes 2017. aastaga ning 80-aastaste ja vanemate inimeste arv peaks samal perioodil peaaegu kolmekordistuma 3]. Vaatamata pikaealisuse paranemisele on naha vananemine aga vältimatu protsess ning seetõttu on oodata kasvavat nõudlust vananemisvastaste nahahooldustoodete järele.

Naha vananemine on keeruline bioloogiline protsess, mis ühendab endogeensed ja eksogeensed mehhanismid [4]. Endogeense vananemise määravad peamiselt geneetilised tegurid ja hormonaalsed muutused, mis tekivad normaalse vananemisprotsessiga [4]. Teisest küljest vahendavad eksogeenset vananemist välistegurid (nt liigne kokkupuude ultraviolettkiirgusega (fotovananemine), gravitatsioon, suitsetamine, reostus ja kehv toitumine)[5]. Mõlemas vananemisprotsessis, kuid eriti eksogeenses, on hästi aktsepteeritud, et suurenenud oksüdatiivne stress, mille põhjustavad reaktiivsed hapniku liigid (ROS) ja mis tuleneb ROS-i tootmise ja antioksüdantide kaitse vahelisest tasakaalustamatusest, mängib otsustavat rolli [{{3} }]. Vanusega väheneb ka inimese naharakkude võime parandada kahjustatud DNA-d, mis aitab kaasa ka naha vananemisele [8].Cistanche ekstrakti kiirgusvastane toimeSeega põhjustab vananemisprotsess naha koostises mitmeid biokeemilisi muutusi, mis mõjutavad selle struktuuri ja funktsiooni [9], mille tulemuseks on nähtavad märgid nagu kortsud, kuivus, elastsuse kadu, õhenemine, kare tekstuur või ebaregulaarne pigmentatsioon [7,10] . Seetõttu on üha suureneva tervise ja heaolu poole püüdlemisega, mis hõlmab ka naha tervist ja esteetikat, bioaktiivseid ühendeid sisaldavate kosmeetikatoodete väljatöötamine, et vältida või nõrgendada naha vananemist ja selle väliseid märke, parandades seeläbi naha välimust. kosmeetikatööstuse teadusuuringute ja innovatsiooni esirinnas viimastel aastakümnetel. Selles kontekstis ja paikseks raviks mõeldud kosmeetikatoodete hulgas on ilumaskid ja eriti leht-näomaskid kasvav turg, mille eeldatav aastane kasvumäär (CAGR) on 8,1 protsenti aastatel 2019–2027 [11]. Seda tüüpi maskid on eriti atraktiivsed kaasaegsetele tarbijatele, suuresti tänu oma lihtsale ja hõlpsale pealekandmisele, kiirele kasutamisele ja tõhususele]12. Nende lehtmaskide tugimaatriksina saab kasutada mitmeid materjale, nimelt sünteetilisi polümeere (nt polü(vinüülalkohol) ja silikoon), kangaid (nt lausriie ja puuvill), hüdrogeele (nt kollageeni- ja siidipõhised hüdrogeelid). )või tselluloosi nanokiud, nagu bakteriaalne nanotselluloos (BNC)[13]. Seoses kasvava nõudlusega looduslikult saadud nahahooldustoodete järele on BNC muutunud olulisemaks ja on nüüd suurepärane biopõhine materjal, mida on juba uuritud ja turustanud mõned parimad kosmeetikafirmad (nt Lancome, Elizabeth Arden ja DHC)[14], kes järgivad roheliste tarbijate nõudlust.

Bacterial nanocellulose is an extracellular polysaccharide produced by several non-pathogenic bacteria from different genera (e.g., Komagataeibacter (formerly Gluconacetobacter), Agrobacterium, Rhizobium, Escherichia, and Aerobacter), through fermentation in the presence of oxygen and carbon sources(e.g., glucose)[1516]. BNC is synthesized in the air-culture medium interface as an ultrafine 3D nanofiber network, showing high water content(>90 protsenti), kõrge hüdrofiilsus ja nanopoorse struktuur [17]. Staatilises kultuuris tootmisel saadakse BNC želatiinse hüdrogeelitaolise membraanina, millel on erinev paksus ja kultiveerimisanuma kuju (st in situ vormitavus), mis on eeliseks, kui soovitakse eelnevalt määratletud kuju [18]. BNC ainulaadsete omaduste komplekt hõlmab ka kõrget kristallilisust ja puhtust, märkimisväärset mehaanilist tugevust ja termilist stabiilsust [19]. Lisaks sellele, et BNC on biolagunev, on see mitmetes in vivo uuringutes [20-22] näidanud ka head naha taluvust ja biosobivust, muutes selle ideaalseks materjaliks nahahooldustoodete jaoks. Sellega seoses ja selle poorse nanostruktuuri tõttu on BNC kui naha aktiivsete ühendite kandja kasutatavus ja tõhusus olnud mitmete tööde keskmes, näiteks kofeiini [23], siidi-seritsiini kohaletoimetamiseks. [24], retinool [25] või rutiin [26]. Täiendavaks lugemiseks annab värske ülevaade põhjaliku ülevaate BNC mitmekülgsusest ja kasutatavusest rohelises kosmeetikas, sealhulgas naha aktiivainete kandjana [27].

cistanche võib vananemisvastane

Looduslikke bioaktiivseid ühendeid kasutatakse laialdaselt vananemisvastases nahahoolduskosmeetikas [28].cistanche herbaEelkõige on taimeekstraktid rikkalikult bioaktiivsete ühendite (nt polüfenoolid, terpenoidid, vitamiinid jne) allikaks, millel on nahale mitmekordne toime, kusjuures seni teatatud peamisteks eelisteks on türosinaasi inhibeeriva toime antioksüdantne ja antimikroobne toime. 29]. Seetõttu, arvestades praegust looduslike toodete suundumust kosmeetikas, on taimeekstraktid nahahooldustoodete väljatöötamisel kõige lootustandvamate koostisosade hulgas. Lisaks on kosmeetilistel eesmärkidel uuritud ka looduslike ekstraktide lisamist BNC membraanidesse. Näideteks on tööd, mis käsitlevad taruvaigu ekstrakti, millel on teadaolevalt antiseptiline ja kokkutõmbav toime,[13,30], niisutava toimega kaera- ja rosmariiniekstrakte [13] või Adansonia digitata viljadest, Hibiscus sabdariffa lillest koosnevat kosmeetilist preparaati, Coffea arabica seemnekook, Kigelia Africana puuviljad ning Akaatsia ja Crocus chrysanthus sibulate ekstraktid, millel on vananemisvastased omadused, nimelt kortse siluvad [21]. Hiljuti tehtud ülevaade andis kriitilise ülevaate BNC seostamise tähtsusest taimsete fenoolainetega, et vältida UV-indutseeritud nahakahjustusi [31].

Eucalyptus globulus Labill. igihaljas puu on hästi tuntud bioaktiivsete ühendite, nimelt fenoolsete ühendite, nagu fenoolhapped, flavonoidid või hüdrolüüsitavad tanniinid [32-36], allikas. Neid ühendeid sisaldavate E.globuluse ekstraktide antioksüdantset ja antimikroobset toimet on demonstreeritud mitmetes uuringutes [34,35]. Kosmeetikavaldkonnas kasutamise kohta näitas hiljutine uuring, et kuivatatud kaubanduslikust E.globuluse biomassist saadud 50% etanooliekstrakt kaitseb UV-kiirgusest põhjustatud fotovananemist nii in vitro (inimese naha fibroblastides) kui ka in vivo (karvadeta hiired). , millel on paljulubavad tulemused kortsude tekke ja naha kuivuse ennetamisel [37]. Kuid meie teadmiste kohaselt ei ole E.globuluse ekstrakte kunagi uuritud koos polümeerse substraadiga, et toota bioaktiivseid nahamaske vananemisvastaseks nahahoolduseks.

Sellest vaatenurgast lähtudes oli käesoleva töö eesmärgiks toota E.globuluse lehtede hüdrodestilleerimisel (hüdrodestillatsiooniekstrakt, HDE) saadud vesiekstraktiga laetud BNC membraane. Hüdrodestilleerimine on tööstuses eeterlike õlide ekstraheerimiseks tavaliselt kasutatav meetod [38]. Lisaks lisati BNC membraanidesse (7,5 mg cm{8}}) ​​ka glütserool (G), kosmeetikatoodetes laialdaselt kasutatav niiskusesäilitaja [39], et suurendada nende paindlikkust ja samal ajal nende vastavust. nahk. Seega oli selle töö eesmärk saada funktsionaalsete omadustega täielikult biopõhine materjal, mida saaks kasutada vananemisvastase näomaskina. Erinevate hüdrodestillatsiooniekstrakti annustega koormatud BNC-membraane iseloomustati nende morfoloogia, mehaaniliste omaduste, termilise stabiilsuse ja niiskuse neeldumisvõime poolest. Lisaks hinnati ka erinevate membraanide keemilist antioksüdantset aktiivsust, samuti nende in vitro tsütotoksilisust (inimese keratinotsüütides ja hiire fibroblastide rakuliinides). Lisaks on antioksüdandi aktiivsuse stabiilsus pärast 3-kuulist ladustamist pimedas, 22-25 kraadi ja 52% suhtelise niiskuse (RH) või membraani 40 kraadi ja 75% suhtelise õhuniiskuse juures 2 ug cm{19} } HDE-st hinnati. Lõpuks uuriti täiendavalt BNC membraani in vitro vananemisvastast aktiivsust 2 ug cm-2 HDE-ga.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Kemikaalid ja materjalid

Citric acid (≥99.5%), dimethyl sulfoxide (DMSO) (≥99.0%), disodium hydrogen phosphate(≥99.0%), glucose(≥99.5%), glycerol(≥99.5%), magnesium nitrate hexahydrate (≥99.0%), potassium chloride(≥99.0%), potassium dihydrogen phosphate (≥99.0%), potassium sulphate (>99.0%), sodium bicarbonate (>99.5%), sodium chloride (>99.0 protsenti) ja 3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiid (MTT) (suurem 97,5 protsenti või sellega võrdne ) osteti ettevõttelt Sigma-Aldrich (Lissabon, Portugal). Kõik muud kemikaalid olid laboratoorsed.cistanche peenise kasvKaltsiumkloriid, Dulbecco modifitseeritud Eagle'i sööde (DMEM), etoposiid, Folin-Ciocalteu fenoolreaktiiv, magneesiumkloriid, naatriumpüruvaat, trüpsiin-EDTA lahus, N-(2-hüdroksüetüül)piperasiin-N'-({{6}) }etaansulfoonhape),4-(2-hüdroksüetüülpiperasiin-1-etaansulfoonhape (HEPES) ja 2,2-difenüül-1-pikrüülhüdrasüül(DPPH) tarnib Sigma-Aldrich (Lissabon, Portugal). Peptoon ja pärmiekstrakt saadi firmalt Himedia Laboratories GmbH (Einhausen, Saksamaa). Veise looteseerum (FBS), penitsilliin ja streptomütsiin osteti firmalt Gibco (Carlsbad, CA, USA).

Võrdluseks kasutati mehaanilistes ja niiskuse omastamise testides BNC kaubandusliku lehtmaski proove. BNC kaubanduslikku lehtedest näomaski (Superstart Probiotic Boost Skin Renewal Biocellulose Mask, Elizabeth Arden, New York, NY, USA) kirjeldatakse kui looduslikust kookosveest pärinevat ja nahka uuendavate omadustega kosmeetikakoostist, mis sisaldab muu hulgas probiootikumid (Lactococcus ferment lüsaat, Lactobacillus), taimeekstraktid (Althea roosiõie ekstrakt, Polymnia sonchifolia juuremahl, Crithmum maritimum ekstrakt), kofeiin ja niiskusesäilitajad, nagu glütserool, hüaluroonhape või polüetüleenglükool (PEG){0}} . BNC-kaubandusliku lehe proove kuivatati enne kasutamist ventileeritavas ahjus temperatuuril 358 °C.cistanche salsa eelisedVärske E.globulus Labill. Lehed koguti täiskasvanud puudelt ettevõtte The Navigator Company tööstuslikust istandusest Aveiro lähedal Sever do Vougas (Bracal) (Aveiro, Portugal) ja töödeldi hüdrodestilleerimisega kuni eeterliku õli fraktsiooni täieliku ekstraheerimiseni (2-3 h) kasutades modifitseeritud Clevenger-tüüpi aparaati. Lõpuks koguti vesiekstrakt, HDE, lüofiliseeriti, säilitati ja kaitsti valguse eest eksikaatoris toatemperatuuril kuni kasutamiseni [40].

2.2. HDE üldfenoolisisaldus

HDE üldfenoolisisaldus (TPC) määrati Folin-Ciocalteu meetodil, nagu on kirjeldatud mujal [41], mõningate muudatustega. Lühidalt, 96-süvendplaadil 150 μL Folin-Ciocalteu reaktiivi, mis on eelnevalt lahjendatud (1–10, o/ø) veega ja 120 L naatriumkarbonaadi vesilahust (75 g L-). ) lisati 30 µl HDE vesilahusele kontsentratsioonides vahemikus 1,95 ug kuni 500 ug ml{14}} ekstrakti. Reaktsioonisegusid inkubeeriti pimedas toatemperatuuril 60 minutit. Pärast inkubatsiooniperioodi mõõdeti neeldumist lainepikkusel 760 nm võrreldes pimekatsega (ekstrakti asemel vesi) mikroplaadilugejas Thermo Scientific MultiskanTM FC (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). TPC arvutati gallushappe ekvivalendina (GAE) gallushappe standardlahuste (513-205,0 ug ml-1) kalibreerimiskõvera põhjal ja väljendati lüofiliseeritud ekstrakti GAE mg-des. Analüüs viidi läbi viis korda ja iga proovi analüüsiti kolmes eksemplaris.

2.3. BNC membraanide tootmine

BNC membraanid valmistati meie laboris, kasutades Hestrin-Schrammi (HS) vedelat söödet (20g L-1glükoos, 5g L-1 peptoon, 5g Ll pärmiekstrakt, 2,7g L -1 dinaatriumvesinikfosfaat, 1,15 g L-sidrunhape, pH 5), nakatatud äädikhappebakteriga Gluconacetobacter sacchari staatilistes kultiveerimistingimustes [42]. Pärast 4-6 päeva kultiveerimist 30 kraadi juures koguti BNC membraanid ja töödeldi kaks korda 0,5 M NaOH-ga 80 kraadi juures 30 minutit. Seejärel pesti membraane mitu korda destilleeritud veega, et eemaldada ülejäänud söötme komponendid ja bakterirakud. Lõpuks valgendati BNC membraane 1-protsendilise naatriumhüpokloriti vesilahusega, millele järgnes korduv pesemine destilleeritud veega, kuni saavutati neutraalne pH. Puhastatud membraane hoiti kuni kasutamiseni ülipuhtas vees temperatuuril pluss 4 kraadi.

2.4. BNC-G-HDE membraanide ettevalmistamine

Märg BNC-membraanid (läbimõõt∶ ca.7.{1}}±0.5 cm; paksusega ∶ 7000± 1000 μm) laaditi immutusmeetodit kasutades erinevate annuste HDE-d (väljendatuna HDE massina membraani pindala kohta) ja glütserooli (7,5 mg cm-2) ​​(tabel 1). Lühidalt, niisked BNC-membraanid kaaluti (umbes 180 mg kuiva BNC-d) ja nõrutati laborikvaliteediga absorbeeriva paberiga käsitsi vajutades, kuni veesisaldus vähenes peaaegu 40 protsendini (hinnanguliselt kaalukaotuse järgi). Seejärel leotati membraane 5 ml vesilahuses, mis sisaldas nii HDE kui ka glütserooli vastavaid annuseid, ja hoiti toatemperatuuril kuni HDE-G lahuse täieliku imendumiseni. Lõpuks kuivatati BNC membraane (Petri tassides) 35 kraadi juures ventileeritavas ahjus (Venticell Eco line, MMM grupp, Planegg, Saksamaa) vähemalt 20 tundi. Kuivatatud membraane hoiti ja kaitsti valguse eest eksikaatoris toatemperatuuril kuni kasutamiseni. Võrdluseks kuivatati puhtad BNC membraanid (ilma ekstrakti ja glütseroolita), nagu eelnevalt kirjeldatud, ja glütserooliga (BNC-G) laaditud membraanid valmistati sama protseduuri järgi.

2.5. Membraanide iseloomustus

2.5.1.Paksus

Kuivade membraanide paksust mõõdeti viies juhuslikus kohas, kasutades käeshoitavat digitaalset mikromeetrit (Mitutoyo Corporation, Tokyo, Jaapan) täpsusega 1 μm.

2.5.2. Morfoloogia

Membraanide pinna- ja ristlõike (krüo-murdunud) morfoloogiaid analüüsiti skaneeriva elektronmikroskoopia (SEM) abil. Mikrograafid saadi kõrgepingemikroskoobiga (HR-FESEMSU 70 Hitachi, Tokyo, Jaapan), mis töötas pingel 4,0 kV. Enne kujutise saamist asetati proovid terasalusele ja kaeti süsinikuga.

2.5.3. Mehaaniline jõudlus

Membraanide mehaanilist jõudlust kuivas ja märjas olekus (80 protsenti niiskust) hinnati tõmbekatsetega. Niiskete membraanide niiskusesisaldus määrati kaubanduslikus BNC-s määratud niiskusesisalduse järgi. Tõmbekatsed viidi läbi üheteljelise Instron 5564 katsemasinaga (Instron Corporation, Norwood, MA, USA) veorežiimis ristpea kiirusel 10 mm min-I, kasutades 500 N staatilist koormusandurit. Kõik mõõtmised viidi läbi vähemalt viies korduses, kasutades ristkülikukujulisi katsekehasid (5 × 1 cm²) ja gabariidi pikkust 30 mm. Joonistati pinge (MPa) ja deformatsiooni (protsenti) kõverad ning Youngi moodul, tõmbetugevus ja katkemispikenemine määrati tarkvara Instron BlueHill 3 abil. Nendes testides testiti võrdluseks samades tingimustes ka kaubandusliku BNC näomaski proove.

2.5.4. Termiline stabiilsus

Termogravimeetriline analüüs (TGA) viidi läbi SETSYS Setaram TGA analüsaatoriga (SITARAM Instrumentation, Lyon, Prantsusmaa), mis oli varustatud plaatinaelemendiga. Proove kuumutati lämmastiku atmosfääris toatemperatuurilt temperatuurini 800 °C konstantsel kiirusel 10 kraadi min{2}}.

2.5.5. Niiskuse omastamisvõime

Kõigi membraanide niiskuse omastamise võimet hinnati, asetades iga membraani kuivatatud proovid (2 × 2 cm-) eksikaatorisse toatemperatuuril suhtelise niiskusega ca. 52 protsenti, kasutades küllastunud magneesiumnitraadi vesilahust (52,89 ± 0,22 protsenti temperatuuril 25 kraadi)[43]. Proovid võeti eksikaatorist ja kaaluti 0,5 h, 1 h, 2,5 h, 24 h ja 48 h pärast. Kõiki membraane testiti kolmes eksemplaris. Niiskuse omastamine arvutati järgmiselt:

kus Who on isendi algkaal ja Wwi on kaal igal ajahetkel.

2.6. Chermico antioksüdantide aktiivsuses

HDE-laetud membraanide antioksüdantset aktiivsust hinnati DPPH vabade radikaalide eemaldamise meetodi abil, järgides eelnevalt kirjeldatud protseduuri [44], mõningate muudatustega. Reaktsioon põhineb DPPH lahuse neeldumise vähenemisel, mis tuleneb antioksüdantsete ühendite radikaalide püüdmisest, mille tulemusena muutub DPPH lahuse värvus lillast kahvatukollaseks [45]. Lühidalt, iga membraani proovid (2 × 5 cm²) lisati 3,75 ml etanooli (EtOH) ja fosfaatpuhverdatud soolalahuse (PBS) lahusele (60∶40); pH 5,5). Seejärel lisati 250 µl DPPH (1 mM) lahust etanoolis ja saadud segusid inkubeeriti pimedas õrnalt segades (100 p/min) 22 kraadi juures 0,5 h, 1 h ja 2,5 h ning seejärel neeldumine 517 nm loeti tühja katse suhtes (EtOH: PBS1 × pH 5,5), kasutades MultiskanTM FC mikroplaadilugejat (Thermo Scientific, Waltham, Massachusets, EUA). Võrdluseks: reaktsioonisegud, mis sisaldavad EtOH-s lahjendatud HDE-d: PBS1 × pH 5,5 lõppkontsentratsiooniga, mis on võrdne HDE maksimaalse kogusega, mis võib vabaneda igast membraanist (HDE 1:2,5 ug ml-1; HDE1. Analüüsis osales ka 5–3,75 ug mL-1; HDE 2–5,0 ug ml-1; HDE 3–7,5 ug ml-）. Kontroll, mis koosnes EtOH-st: PBS 1 × pH 5,5 kasutati DPPH-ga ja ilma membraanita. Iga proovi jaoks viidi läbi kolm sõltumatut analüüsi. DPPH radikaali püüdmise aktiivsus arvutati iga proovi (A proov) neeldumise põhjal kontroll-DPPH neeldumise (ApppH) suhtes järgmiselt:

2.7. Säilitamise all oleva BNC-G-HDE2 membraani stabiilsuse hindamine

Kosmeetikatoodete stabiilsustestimise suuniste[46] alusel hinnati BNC-G-HDE2 stabiilsust säilitamisel. Selleks pandi BNC-G (kontrolliks) ja BNC-G-HDE2 membraanide proovid (14 cm²) klaasviaalidesse ja säilitati 3 kuud pimedas eeldatavas normaalses säilitustingimustes toatemperatuuril ({10 }} kraadi ) ja 52 protsenti RH (tingimus I, kasutades magneesiumnitraadi küllastunud lahust [43]) ning kiirendatud tingimustes 40 kraadi C ja 75 protsenti RH (tingimus I, kasutades naatriumkloriidi küllastunud lahust [43]). ). Suhtelist õhuniiskust jälgiti perioodiliselt termohüdromeetriga, et tagada püsiv niiskus kogu säilitusaja jooksul. Kõiki proove analüüsiti enne ja pärast 1-, 2- ja 3-kuulist säilitamist nende antioksüdantse toime suhtes (nagu on kirjeldatud jaotises 2.6). Samuti registreeriti membraanide makroskoopiline aspekt. Iga seisundi puhul analüüsiti kõiki proove kolmes eksemplaris.

2.8. In vitro bioloogilised analüüsid

2.8.1. Rakukultuur

Inimese keratinotsüütide (HaCaT, CLS, Cell Lines Service, Eppelheim, Saksamaa) ja hiire fibroblastide (NIH/3T3, ATCC CRL-1658, Manassas, VA, USA) rakuliine kultiveeriti Dulbecco modifitseeritud kotkasöötmega (DMEM) , 37 kraadi juures, niisutatud 5% CO{5}}% õhu atmosfääris. Söötmele lisati 10 protsenti (o/v) kuumaga inaktiveeritud veise loote seerumit (FBS), 1 protsenti (o/ø) pen/strep, 3,7 g L-naatriumvesinikkarbonaati ja 1 mM naatriumpüruvaati. Rakud eraldati trüpsiin-EDTA lahusega 1x.

2.8.2. Tsütotoksilisuse test

Membraanide tsütotoksilisust hinnati MTT redutseerimisanalüüsi abil. Membraanide (BNC-G, BNC-G-HDE1, BNC-G-HDE1.5, BNC-G-HDE2, BNC-G-HDE3) proove (2,5 cm²) steriliseeriti kaks korda UV-kiirgusega mõlemalt küljelt 20 aasta jooksul. min ja inkubeeriti iga membraaniekstrakti valmistamiseks 24 tundi 2,5 ml täielikus DMEM söötmes temperatuuril 37 kraadi niisutatud 5% CO, -95% õhu atmosfääris.

Vahepeal külvati 2 × 10 ja 1 × 104 rakku süvendi kohta 96-süvendplaatidele vastavalt HaCaT ja NIH/3T3 rakkude jaoks. 24 tunni pärast kasutati söötme asendamiseks sama mahtu membraaniekstrakti ja rakke inkubeeriti veel 24 tundi 37 kraadi juures. Kontrollina töödeldi rakke samamoodi nagu proovide puhul, kuid eksponeeriti ainult DMEM söötmega. 24 tunni pärast sööde eemaldati ja tsütotoksilisus määrati eelnevalt kirjeldatud viisil [47]. Lühidalt, lisati Krebsi söötmes (pH 7,4) valmistatud värske MTT lahus (0,5 mg L-1) ja inkubeeriti 37 kraadi juures 2 tundi (HaCaT rakud) või 4 tundi (NIH/3T3 rakud). Pärast seda asendati MTT lahus DMSO-ga ja inkubeeriti 10 minutit loksutades, et formazaani kristallid täielikult lahustuksid. Pärast inkubeerimist mõõdeti neeldumist 570 nm juures spektrofotomeetris (SLT spektrid I). Kolme sõltumatu katse tulemused, millest igaühes oli 3 kordust, väljendati protsendina ( protsenti ) kontrollis saadud neeldumisväärtusest ja esitati graafiliselt protsendina MTT vähenemisest.

2.8.3. Vananemisvastane tegevus

BNC-G-HDE2 membraani vananemisvastast aktiivsust hinnati -galaktosidaasi (-gal) värvimistesti abil. Kontrollina kasutati BNC-G membraani. Membraaniekstraktide valmistamiseks inkubeeriti steriliseeritud proove (10 cm-) 10 ml täielikus DMEM-söötmes, nagu eelnevalt tsütotoksilisuse analüüsi jaoks kirjeldatud.

NIH/3T3 rakud külvati 12-süvendiga plaatidele tihedusega 2,5 × 104 rakku süvendi kohta ja lasti 24 tundi stabiliseeruda. Seejärel kasutati rakkude vananemise esilekutsumiseks NIH/3T3-s 24 tunni jooksul 12,5 μM etoposiidi. Seejärel töödeldi etoposiidiga stimuleeritud rakke BNC-G-HDE2 membraaniekstraktiga veel 24 tundi.cistanche tubulosa dosage redditKontrollina inkubeeriti töötlemata rakke DMEM söötmega või BNC-G ja BNC-G-HDE membraanide ekstraktidega. Pärast inkubeerimist sööde eemaldati ja rakke pesti PBS-ga ja märgistati -gal lahusega, mis valmistati vastavalt tootja kirjeldusele (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Positiivsete rakkude vananemise analüüs viidi läbi 20-kordse suurendusega, kasutades laivälja mikroskoopi (Carl Zeiss, Oberkochen, Saksamaa). Vähemalt 3 sõltumatut katset viidi läbi kordusena ja -gal-positiivsete rakkude protsent määrati nelja mikroskoopilise kujutise abil.

2.9. Statistiline analüüs

Membraanide iseloomustuse, antioksüdantse aktiivsuse ja säilitamise stabiilsuse testi tulemuste töötlemisel kasutati olulisuse taseme hindamiseks ühesuunalist dispersioonanalüüsi (ANOVA), millele järgnes Tukey testi. Tulemused on väljendatud keskmise ± keskmise standardhälbena. In vitro testide osas hinnati andmete jaotuse normaalsust D'Agostino-Pearsoni ja Shapiro-Wilki normaalsustestidega. Rühmade statistilised võrdlused viidi läbi ANOVA abil, millele järgnes Dunnetti post-hoc test või paaritu Studentsi t-test. Tulemused on esitatud näidatud arvu katsete keskmise keskmise ± standardveana.

Olulisus võeti vastu väärtustel p<0.05. all="" statistical="" calculations="" were="" performed="" using="" graphpad="" prism="" software(8.0.2,="" graphpad="" software="" inc.,="" san="" diego,="" ca,="">

See artikkel on välja võetud materjalist Materials 2022, 15, 1982. https://doi.org/10.3390/ma15051982 https://www.mdpi.com/journal/materials