Beeta-glükaan tugevdas immuunvastust Newcastle'i haiguse vaktsiinile ja muutis kanade põrna MRNA ekspressiooni

ABSTRAKTNE

Käesolev uuring viidi läbi selleks, et uurida pärmi rakuseinast saadud toote b-glükaani (G70) suukaudse manustamise mõju Newcastle'i haiguse viiruse (NDV) spetsiifilisele hemaglutinatsiooni inhibeerimise (HI) tiitritele, lümfotsüütide proliferatsioonile ja T-lümfotsüütide alampopulatsioonide roll kanadel, keda raviti NDV elusvaktsiiniga. Lisaks uuriti transkriptoomi sekveneerimisega b-glükaani mõju põrna geeniekspressioonile. Tulemused näitasid, et b-glükaani lisamine suurendas seerumi NDV HI tiitrit, suurendas perifeerses veres ja sooletraktis lümfotsüütide NDV stimulatsiooniindeksit ning soodustas T-lümfotsüütide diferentseerumist CD4+ T-rakkudeks. RNA sekveneerimise (RNA-seq) analüüs näitas, et G70 reguleeris G-valguga seotud retseptori ja MHC I klassi polüpeptiidiga seotud mRNA ekspressioone ning reguleeris alla katelitsidiini ja betadefensiiniga seotud mRNA ekspressioone. G70 immunomoduleeriv toime võib toimida mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi signaaliraja kaudu. Kokkuvõtteks võib öelda, et G70 võib suurendada NDV elusvaktsiini immunoloogilist efektiivsust kanadel ja seda võiks kasutada potentsiaalse adjuvandina linnukasvatuses.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Märksõnad: Newcastle'i haiguse vaktsiin, beeta-glükaan, adjuvant, musta luu kana, RNA-seq

SISSEJUHATUS

Pärmi rakuseina polüsahhariidid saadakse otse Saccharomyces cerevisiae rakuseinast ja neid kasutatakse laialdaselt kasvu soodustajate, antimikroobsete ainete või immunomodulaatoritena kodulindudel tootmise ja tervise parandamiseks (Schiavone et al., 2017; Hasted et al., 2021). Varem tõestati, et toode nimega PW220, mis sisaldab pärmi rakuseina polüsahhariide, võimendab Newcastle'i haiguse viiruse (NDV) poolt esile kutsutud immuunvastust ja muudab suukaudsel manustamisel kanade pimesoole mikroobikooslust (Bi et al., 2020). ). Pärmi rakuseina polüsahhariidid koosnevad peamiselt b-glükaanist ja mannaan-oligosahhariididest (Wang et al., 2018). Käesolevas uuringus uuriti b-glükaani mõju immuunvastuse suhtes NDV vaktsiinile kanadel. Põrn on immuunvastuse algatamise keskne organ. Hiljutine uuring näitas, et PW220, mis on pärmi rakuseina toode, reguleeris üles TGF-b, IL-6, TLR5, GATA-3 ja T-bet mRNA ekspressiooni kanade põrnas ( Bi et al., 2022). Konkreetne mehhanism vajab siiski selgitamist. RNA sekveneerimine (RNA-seq) on üks suure läbilaskevõimega tehnoloogiaid, mida saab rakendada kvantitatiivse geeniekspressiooni testimiseks ja erinevate ekspressiooniprofiilide analüüsimiseks kogu transkriptoomi tasemel (Zhao et al., 2018). Suure tundlikkuse ja madala hinna eeliste tõttu on RNA-seqi laialdaselt kasutatud kariloomade ja kodulindude uuringutes (Teixeira et al., 2019; Yuan et al., 2020). Seega hinnati selles uuringus b-glükaani manustamise mõju NDV-spetsiifilise hemaglutinatsiooni inhibeerimise (HI) tiitritele, lümfotsüütide proliferatsioonile ja T-lümfotsüütide alampopulatsioonidele NDV vaktsiiniga suukaudselt vaktsineeritud kanadel. Lisaks kasutati transkriptoomianalüüsi, et hinnata b-glükaani mõju geeniekspressioonile ja selle aluseks olevatele signaaliülekande radadele kanade põrnas.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Cistanche Enhance Immunity toodete vaatamiseks klõpsake siin

【Küsi lisa】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Loomad

Ühepäevased kaubanduslikud musta kondiga kanad (isased) osteti ettevõttelt Guizhou Yushun Poultry Co., Ltd. (Anshun, Hiina). Kanad jaotati traatpuuridesse, võimaldades vaba juurdepääsu söödale ja veele. Esimese 7 päeva jooksul hoiti toatemperatuuri vahemikus 33 °C kuni 35 °C, seejärel alandati järk-järgult 1 °C võrra iga 2 päeva kohta kuni temperatuurini 27 °C. Kõiki kanu töödeldi Southwest University Animal Care'i ja loomahooldusasutuse kehtestatud standardite kohaselt. Kasutamiskomitee (eetikasertifikaadi number: IAC-2021-0057). Kõik katselinnud surmati uuringu lõpus CO2-ga.

Tistanche kasulikud omadused meestele - tugevdavad immuunsüsteemi

Vaktsiin

NDV (Tüvi La Sota) elusvaktsiini tarnis Qingdao YEBIO Bioengineering Co., Ltd. (Qingdao, Hiina).

Reaktiivid 

Pärmi rakuseina toode (YP) G70 saadi pärmiraku (Saccharomyces cerevisiae) seinast, mis sisaldab b-glükaani (suurem kui 70%) (AngelG70, QB/T4572, Angel Yeast, Yichang, Hiina). Nii antigeen kui ka positiivne kontrollseerum NDV-spetsiifiliste HI tiitrite mõõtmiseks osteti Qingdao Regen Diagnostics Development Centerist (Qingdao, Hiina). Kanavastane CD3-APC (C2818-T9580), CD4-FITC (D0117-WA78E) ja CD8- PE (L{{14) }}TH49T) rottidel pakkus Nanjing Zeweil Biological Technology Co., Ltd. (Nanjing, Hiina).

Eksperimentaalne disain

Nelikümmend kaheksa 5-päevast musta kondiga kana jaotati juhuslikult 3 rühma (tabel 1) ja neile anti kas põhitoitumine (tabel 2) või põhitoitumine 0,1% G7{{10} } (b-glükaan, 0,7 g/kg) täiendust käesoleva uurimistöö ajaks. Rühm H (G70 + vaktsiin) ja C (vaktsiin) immuniseeriti suukaudselt NDV vaktsiiniga vastavalt 14. ja 28. päeval. Rühma S (Sailne) töödeldi võrdse koguse soolalahusega. HI tiitri testimiseks koguti vereproovid tiiva veenipunktsiooniga 5, 7, 14, 21, 28, 35 ja 42 päeva vanuselt. Seitse päeva pärast revaktsineerimist valiti juhuslikult 8 kana igas kolonnis ja surmati lämbumisega CO2 abil. Lümfotsüütide proliferatsiooni ja voolutsütomeetria analüüsi tegemiseks eraldati lümfotsüüdid nii perifeersest verest kui ka tühisoolest. Tühisoole proovide võtmise korral oli tühisoole alguspunktiks kaksteistsõrmiksoole rippside ja tühisoole alguspunktist koguti 5 cm pikkune lõik. Põrn külmutati kiiresti vedelas lämmastikus ja säilitati seejärel -80 kraadi juures RT-qPCR ja järjestuse profileerimiseks.

Tabel 1. Katsekujundus

Tabel 2. 1 Katsebroilerite põhisööda koostis ja toitainete sisaldus.

HI Uuring

NDV-spetsiifiliste HI-tiitrite analüüs seerumis viidi läbi vastavalt eelmisele kirjeldusele (Ball et al., 2019). Lühidalt öeldes lahjendati seerumit fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) suhtes 1:2 kuni 1:1024 V-põhja 96-süvendiga mikrotiiterplaadil. Seejärel lisati igasse süvendisse 25 ml NDV lahjendust ja inkubeeriti 37 kraadi juures 30 minutit. Seejärel lisati igasse süvendisse 25 ml 1% kuke erütrotsüütide suspensiooni ja inkubeeriti 37 kraadi juures 30 minutit. Kõiki proove testiti kaks korda ja igale plaadile lisati nii positiivsed kui ka negatiivsed kontrollid. HI tiitrid põhinesid suurimal lahjendusel, mis põhjustas hemaglutinatsiooni täieliku inhibeerimise. Keskmist HI tiitrit ja standardviga (SE) mõõdeti iga rühma kohta.

Lümfotsüütide eraldamine perifeersest verest

Lümfotsüüdid eraldati ja koguti perifeerse vere lümfotsüütidest, kasutades Lymphocyte Separation Medium Kit (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd., Tianjin, Hiina). Seejärel säilitati lümfotsüüdid suspensioonis RPMI 1640 söötmega (Solarbio, Peking, Hiina), mis sisaldas 5% vasika loote seerumit ja 25 mM HEPES-i (pH 7,0).

Lümfotsüütide eraldamine tühisoolest

Määramisprotsess viidi läbi vastavalt eelmisele kirjeldusele ja väikeste muudatustega (Yuan et al., 2020). Lühidalt, kasutage 70 mm rakufiltrit, et jagada sool 4 ml külmaks PBS-ks. Seejärel tsentrifuugiti proovirakkude suspensiooni kiirusel 4500 p/min 12 minutit, eemaldades supernatanti. Seejärel resuspendeerige soolestiku rakud täissöötmes (Solarbio Co., Peking, Hiina), mis sisaldab 5% veise loote seerumit (FBS) RPMI 1640-s (Sijiqing Co., Hangzhou, Hiina). Lõpuks kana lümfotsüütide isolatsioonikomplekt (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd.) lümfotsüütide eraldamiseks. soolekude jaotati 4 ml külmaks PBS-ks, kasutades 70 mm rakufiltrit. Järgmisena tsentrifuugiti proovirakkude suspensiooni kiirusel 4500 p/min 12 minutit ja supernatant visati ära. Pärast seda resuspendeeriti soolestiku rakud RPMI 1640-s (Solarbio Co.), mis sisaldas 5% FBS-i (Sijiqing Co.). Lõpuks eraldati lümfotsüüdid kana lümfotsüütide isoleerimiskomplekti (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd.) abil.

Lümfotsüütide proliferatsioon 

Rakud külvati 96-süvendiga plaatidele (5 £105 süvendi kohta), stimuleerides inaktiveeritud NDV antigeeniga 4 hemaglutinatsiooniühikut või samaväärset kogust soolalahust. Iga proovi testiti kolmes korduses. Rakke ja antigeeni inkubeeriti 44 tundi 37 kraadi juures 5% CO2-s ja seejärel lisati igasse süvendisse 50 ml metüültiasolüültetrasooliumi (MTT) (2 mg/ml) ja inkubeeriti veel 4 tundi. Proove tsentrifuugiti 1200 £ g juures 8 minutit sisetemperatuuril. Seejärel eemaldati supernatant ettevaatlikult ja igasse süvendisse lisati 100 ml DMSO-d. Plaate loksutati 8 minutit, et kristallid täielikult lahustuda. Lõpuks registreeriti keskmine optiline tihedus (OD) 570 nm juures. Stimulatsiooniindeks (SI) saadi võrrandi abil: stimuleeritud süvendite OD väärtused/stimuleerimata süvendite OD väärtused (Cui et al., 2020).

Tistanche kasulikud omadused meestele - tugevdavad immuunsüsteemi

T-lümfotsüütide alampopulatsioonide voolutsütomeetria analüüs

Lümfoidrakkude suspensioonid eraldati ja pesti kaks korda PBS-ga. Rakkude kontsentratsiooni muudeti 106 ug/ml-ni ja hoiti seejärel jääl. Iga proovi värviti 30 minutit valguskindlates tingimustes 2 ml roti kanavastase CD3-APC, CD4- FITC ja roti kanavastase CD8-PE-ga. 2 pesuga PBS-ga. Rakke analüüsiti voolutsütomeetria analüüsiga Flow tsütomeetril (BD Bioscience, San Jose, CA).

RT-qPCR analüüs

Kogu RNA saadi põrnast, kasutades TRIzol reagenti (Takara, Shiga, Jaapan) vastavalt tootja juhistele ja seejärel konverteeriti cDNA-ks, kasutades PrimeScript RT Master Mixi (Takara, Dalian, Hiina) T100 termotsükleril (Bio-Rad, Hercules, CA). Kana beeta-aktiini kasutati sisemise kontrollgeenina. Valitud geenide RT-qPCR viidi läbi mitme reaalajas PCR süsteemiga (AB, Carlsbad, CA) koos SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara). Kvantitatiivse variatsiooni hindamiseks viidi läbi suhteline kvantitatiivne meetod (244CT) (Bi et al., 2022). Praimerite järjestused on loetletud tabelis 3.

RNA ekstraheerimine

Kõiki kolmest põrnaproovist rühmast H (G70 +vaktsiin) ja rühmast C (vaktsiin) kasutati RNA-seq koostamiseks TRIzol reagendiga (Takara). Pärast seda testiti RNA-d saastumise ja lagunemise suhtes 1% agaroosgeeliga ning RNA puhtust analüüsiti spektrofotomeetriga NanoPhotometer (IMPLEN, Westlake Village, CA). RNA kontsentratsioon määrati Qubit RNA testikomplekti abil Qubit 2.0 Fluorometer (Life Technologies, Carlsbad, CA). RNA terviklikkust mõõdeti, kasutades süsteemi Bioanalyzer 2100 testikomplekti RNA Nano 6000 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Tulemused näitasid, et RNA oli täielik ja ilma DNA-ga saastumiseta.

Transkriptsiooni analüüs

Transkriptoomide sekveneerimise, järjestuste koostamise ja andmete analüüsi teostas Novogene Bioinformatics Technology Co. Ltd. (Peking, Hiina). Peamised transkriptoomi protseduurid loetleti järgmiselt: 1) mRNA puhastamine kogu RNA-st viidi läbi polü-T oligoga kinnitatud magnethelmeste abil. Fragmenteerimine viidi läbi kahevalentsete katioonidega NEB Next First Strand sünteesireaktsioonipuhvris (5X) kõrgel temperatuuril. 2) Esimese ahela cDNA suurus sünteesiti, kasutades juhuslikku heksameeri praimerit ja Moloney hiire leukeemiaviiruse (M-MuLV) reverset. Seejärel sünteesiti teise ahela cDNA süntees, kasutades DNA polümeraasi I ja RNaasi H. 3) Ülejäänud üleulatuvad osad muudeti eksonukleaasi/polümeraasi aktiivsuse kaudu tömbideks otsteks. Seejärel ligeeriti juuksenõela silmusstruktuur NEB Next Adapter, et valmistuda hübridiseerimiseks pärast DNA fragmentide 3'-otsa adenüülimist. 4) Saadi umbes 250 kuni 300 bp cDNA fragmendid ja raamatukogu puhastati, kasutades Beckman Coulteri AMPure XP süsteemi (Beckman Coulter, Beverly, MA). Seejärel kanti 3 ml NEBU SER ensüümi (Thermo Fisher, Hillsboro, OR) koos suuruse järgi valitud, adapteriga ligeeritud cDNA-ga temperatuuril 37 °C 15 minutiks ja seejärel 5 minutiks 95 °C juures. PCR amplifikatsioon viidi läbi Phusion High-Fidelity DNA polümeraasiga. Lõpuks puhastati PCR tooted (AMPure XP süsteem) ja raamatukogu kvaliteeti hinnati Agilent Bioanalyzer 2100 süsteemi abil. Indeksiga kodeeritud proovide rühmitamine viidi läbi TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS-is (Illumina, San Diego, CA). Seejärel viidi järjestamine läbi Illumina Novaseqi platvormil ja genereeriti 150 bp paarisotsa lugemised. Genoomi ja geenimudeli annotatsioonifailid laaditi alla genoomi veebisaidilt (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release- 98/fasta/gallus_gallus/ ja ftp://ftp. ensembl.org/pub/re-lease-98/gtf/gallus_gallus/). Võrdlusgenoomi indeks määrati HISAT2 (v2.0.5) abil ja paarisotsa puhtad lugemised joondati võrdlusgenoomiga. Iga geeniga kaardistatud lugemiste arv ja iga geeni fragmendid kilobaasi kohta miljoni kohta (FPKM), mis põhinevad geeni pikkusel, ja geeniga kaardistatud lugemiste arv arvutati funktsiooni Feature Counts v1.5 abil.{38} }p3. Erinev ekspressioon rühma H (G70 + vaktsiin) ja rühma C (vaktsiin) vahel tuletati DESeq2 R paketi (1.16.1) abil. Geenid, mille P < 0,05 ja |log2 (kordne muutus)| > 1 määratleti kui diferentsiaalse ekspressiooni geenid (DEG).

Tabel 3. RT-qPCR praimerite järjestused.

Reaalajas kvantitatiivne PCR valideerimine 

Rühma H (G70 + vaktsiin) ja rühma C (vaktsiin) võrdlemisel valiti kaks ülesreguleeritud DEG-d ja 4 allareguleeritud DEG-d, et kinnitada transkriptoomide järjestamise tulemusi RT-qPCR abil. RNA muundati cDNA-ks, kasutades PrimeScript RT Master Mix (Takara) termotsükleril T100 (Bio-Rad). Praimeri järjestused on loetletud tabelis 3. Sisemise kontrollgeenina kasutati kana b-aktiini. Valitud geenide RT-qPCR viidi läbi mitme reaalajas PCR süsteemiga (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) koos SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara). Kvantifitseerimise varieerumise hindamiseks kasutati suhtelist kvantitatiivset meetodit (244CT). Kõik proovid viidi analüüsimiseks läbi kolmes eksemplaris.

Statistiline analüüs

Ühesuunalist ANOVA-d koos Duncani post hoc testiga kasutati mitmekordseks võrdlemiseks rühmade vahel, kasutades SPSS-tarkvara (versioon 21.0, SPSS Inc., Chicago, IL). Andmed on väljendatud keskmisena § SE. Väärtust P < 0,05 peeti statistiliselt oluliseks.

TULEMUSED b-glükaani mõju seerumi antikehade tiitritele

Nagu on näidatud joonisel 1, vähenesid NDV-spetsiifilised HI-tiitrid kõigis rühmades enne vaktsineerimist ja suurenesid H (G70+vaktsiin) ja C (vaktsiin) rühmades pärast immuniseerimist. Huvitaval kombel täheldati kõrgemaid HI-tiitreid rühmas H (G70+vaktsiin) 21 (P > 0.05), 28 (P < 0.{{ 14}}5), 35 (P > 0,05) ja 42 (P > 0,05) eluaastat kui rühmas C (vaktsiin).

b-glükaani mõju lümfotsüütide proliferatsioonile

G70 mõju perifeerse vere lümfotsüütide proliferatsioonile on kujutatud joonisel 2A. Vere lümfotsüütide SI suurenes lindudel, kellele oli lisatud G70 (G70 + vaktsiin) 7. päeval (P < 0,05) revaktsineerimisel, võrreldes vaktsiinirühmaga. Veelgi enam, SI jejunaalsetes lümfotsüütides suurenes 7 päeva (P < 0,05) pärast revaktsineerimist oluliselt, võrreldes vaktsiinirühmaga (joonis 2B).

b-glükaani mõju CD4 + / CD8 + T-rakkude suhtele perifeerses veres 

Joonistel 3A ja 3B on näidatud lümfotsüütide ja CD3 + rakkude värav ning joonistel 3C kuni 3E on näidatud CD4 + /CD8 + T-rakkude suhe G70-s, vaktsiini ja soolalahuse rühmad. Nagu on näidatud joonisel 3F, ei olnud pärast revaktsineerimist vaktsiinirühma ja soolalahuse rühma vahel märkimisväärset erinevust (P > 0,05), samas kui CD4 + /CD{{12} } T-rakkude arv oli ilmselgelt kõrgem G70 (G70 + vaktsiin) rühmas kui vaktsiinirühmas (P < 0,05).

Joonis 1. B-glükaani suukaudse manustamise mõju NDV vaktsiini seerumi antikehade tiitritele. Andmed on väljendatud keskmisena § SE.

Seotud geeniekspressioon

Nagu on näidatud joonisel 4, suurenes oluliselt TGF-b mRNA ekspressioon (P < 0.05), IL-6 (P < 0.{{13} }5) ja TLR5 (P < 0.05) tuvastati G70 (G70 + vaktsiiniga) ravitud kanade põrnas võrreldes vaktsiinirühmaga. IFN-g (P > 0,05), TLR4 (P > 0,05) ja TLR3 (P > 0,05) mRNA ekspressioonis põrnas G70 (G70 + vaktsiin) ja vaktsiini vahel olulist erinevust ei leitud rühmad.

RNA sekveneerimise andmete analüüs 

RNA sekveneerimine 8 põrnaraamatukogust andis 24,1 G lähteandmeid, nagu on esitatud lisamaterjali tabelis S1. CN tähendab rühma vaktsiini ja HN rühma G70 + vaktsiini. Teek C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3 ja H4, koosnevad vastavalt 45 591 492, 47 424 782, 46 193 492, 54 403 376, 47 118 476, 47 118 476, 47 118 476, 47 118 476, 47 118 476, 45, 81, 4, 5, 4, 4, 8 438 originaallugemist. Pärast aptameeri eemaldati mitmetähenduslikud järjestused ja madala kvaliteediga järjestused, jättes 44 050 198, 45 449 884, 44 261 112, 52 097 846, 45 542 404, 44 566 290, 44 566, 290, 34, 40, 29, 34, 40, 29, 40, 29, 40, 29, 40, 40 Rohkem kui 96% puhastest lugemistest kuulusid algsete lugemiste hulka ja 8 raamatukogu sobitati lugemite sekveneerimiseks Galluse genoomist koosneva võrdlusandmebaasiga, kasutades HISAT2. Lisaks kaardistati puhtad lugemised sellesse andmebaasi enam kui 95% juhtudest. C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3 ja H4 raamatukogude spetsiifilised näitajad olid 40 921 384 (92,9%), 41 302 100 (90,87%), 40 771 075 (92,11%), 46,4,4 (92,11%), 46,4,4 (1,4), 4,4,4,4,0,4,4. 2 %), vastavalt 40 213 444 (90,23%), 40 922 895 (92,77%) ja 40 971 972 (93,06%) lugemist määrati unikaalselt viiteandmebaasi jaoks.

Erinevalt ekspresseeritud geenid

Nagu on näidatud joonisel fig 5A, tuvastati kokku 198 erinevalt ekspresseeritud geeni, sealhulgas 47 ülesreguleeritud geeni ja 151 allareguleeritud geeni. DEG-sid kirjeldati üksikasjalikult lisamaterjali tabelis S2. Joonis 5B näitab, et DEG-del on ravi hea reprodutseeritavus.

Geeniontoloogia klassifikatsiooni ja Kyoto geenide ja genoomide rikastamise entsüklopeedia analüüs

Geenid, mis on erinevalt ekspresseeritud geenid, liigitati geeniontoloogia (GO) klassifikatsioonisüsteemi alusel kolme peamisse funktsionaalsesse kategooriasse: bioloogiline protsess, rakukomponent ja molekulaarne funktsioon. 10 parimat GO terminit kolmes kategoorias on esitatud joonisel 6. Ülekaalus olid geenid, mis olid seotud "vastusega humoraalsele immuunsüsteemile", "kemokiini vastusele", "reaktsioonile antimikroobsele humoraalsele", "kaitsereaktsioonis bakteri vastu, " "Immuunvastus antimikroobsele huumorile, mida vahendavad antimikroobsed peptiidid", "kaitsereaktsioon gramnegatiivse bakteri vastu" ja "kaitsereaktsioon grampositiivse bakteri vastu" bioloogiliste protsesside kategoorias. Lisaks oli molekulaarse funktsiooni kategoorias märkimisväärne geenide suhe seotud "CC motiivi kemokiini retseptori (CCR) kemokiini retseptori sidumisega", "kemokiini retseptori sidumisega" ja "lipopolüsahhariidi sidumisega". Lisaks olid rakukomponentide kategoorias kõige domineerivamad rikastatud terminid "mitokondriaalse hingamisahela kompleks I", "NADH dehüdrogenaasi kompleks" ja "hingamisahel". Diferentsiaalselt ekspresseeritud geenidega viidi läbi ka Kyoto geenientsüklopeedia ja genoomide raja analüüs. Tulemused näitasid, et geenid rühmitati peamiselt 7 rajaks, sealhulgas "neuroaktiivse ligandi ja retseptori interaktsioon", "lünkühendus", "mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi (MAPK) signaalirada", "ABC transporterid", "aminohapete biosüntees". "Ravimite metabolism" ja "Valkude eksport".

Joonis 2. B-glükaani suukaudse manustamise mõju lümfotsüüte stimuleerivale indeksile (SI). (A) perifeerse vere lümfotsüüdid; (B) soole lümfotsüüdid. Andmed on väljendatud keskmisena § SE.

Joonis 3. B-glükaani suukaudse manustamise mõju perifeerse vere CD4+/CD8+ rakkude suhtele. (A) lümfotsüütide värav; (B) värav CD3+ T-rakkudel; (C) CD3+ CD4 + CD8 + T-rakkude sagedused G70+vaktsiinirühmas; (D) CD3+ CD4 + CD8 + T-rakkude sagedus vaktsiinirühmas; (E) CD3+ CD4 + CD8 + T-rakkude sagedus soolalahuse rühmas; (F) ribadiagramm, mis näitab CD4+/CD8+ suhet. Andmed on väljendatud keskmisena § SE.

Joonis 4. B-glükaani suukaudse manustamise mõju mRNA ekspressioonile kana põrnas. Andmed on väljendatud keskmisena § SE.

Joonis 5. RNA-Seq andmete kokkuvõte. (A) Erinevalt ekspresseeritud geenide loend, (B) DEG-de klastrite kaart.

Erinevalt ekspresseeritud geenide kontrollimine RT-qPCR abil

6 DEG-d, mis olid üles- või allareguleeritud, kinnitati reaalajas kvantitatiivse PCR-iga. Tulemus näitas, et RT-qPCR andmed olid üldiselt kooskõlas RNA-seq andmetega üldiselt, mis näitab usaldusväärset sekveneerimistulemust (joonis 7). MAPK rajaga seotud geenide mRNA ekspressioon Nagu on näidatud joonisel 8, vähenes oluliselt FAS (P < 0.05) ja CACNA2 (P < 0.05) mRNA ekspressioon. tuvastati G70 rühma kanade põrnas (G70 + vaktsiin), võrreldes vaktsiinirühmaga. Lisaks tuvastati G70 rühmas (G70 + vaktsiin) võrreldes vaktsiinirühmaga (P > 0,05) arvuliselt suurenenud DUSP5 ja DUSP4 mRNA ekspressioon ning arvuliselt vähenenud p38, JNK ja ERK mRNA ekspressioon. .

ARUTELU

ND elusvaktsiini inokuleeritakse laialdaselt kanafarmides, kuid siiski esineb immuniseeritud kodulinnukarjades ikka veel juhuslikke Newcastle'i haiguse puhanguid (Zhang et al., 2022). Määratletakse optimaalsed vaktsiinid, mis stimuleerivad raku- ja limaskestade immuunsust ning tõhusat humoraalset immuunsust (Shan et al., 2019). Seetõttu hakati üha enam tähelepanu pöörama adjuvantidele, mis võivad tekitada nii limaskesta kui ka rakulise immuunvastuse (Chen et al., 2014; Yu et al., 2015). Võrreldes süsteviisiga on suukaudne manustamine lihtsam lähenemisviis, mis vähendab broilerikanade kulusid ja põhjustab vähem stressi (Boyaka et al., 2003; Zhang et al., 2008). Selle uuringu tulemused näitasid, et b-glükaaniga täiendatud dieet tõstis märkimisväärselt NDV-spetsiifiliste HI-tiitrite taset kanade seerumis, mis on kooskõlas varasemate aruannetega (Horst et al., 2019). NDV-spetsiifiline antikeha on oluline humoraalse immuunvastuse tekkeks, et kaitsta kanu NDV infektsiooni eest (Martinez et al., 2018; Li et al., 2020). B-lümfotsüüdid toodavad antikehi ja T-lümfotsüüdid paisuvad vastusena mitogeenile (Bohacova et al., 2021). Käesolevas uuringus oli kana perifeerse vere lümfotsüütide stimulatsiooniindeks G70 rühma NDV suhtes ilmselgelt kõrgem kui vaktsiinirühmal, mis näitab, et aktiveeriti rohkem T-lümfotsüüte. T-lümfotsüütide domineerivad alampopulatsioonid on CD4 + ja CD8 + T-rakud (Cui et al., 2020). CD4 + T-rakud toodavad peamiselt tsütokiine ja soodustavad B-rakkude küpsemist, samas kui CD8 + T-rakud on seotud sihtrakkude tapmisega (Zhang et al., 2021b). Selles uuringus suurenes G70 rühmas tuvastatud CD4 +/CD8 + T-rakkude suhe selgelt, mis viitab sellele, et G70 võib aktiveerida perifeersest verest rohkem CD4 + T-rakke. Lisaks täheldasime G70 rühmas oluliselt kõrgemat soole lümfotsüütide stimulatsiooni indeksit kui vaktsiinirühmas, mis kinnitas, et b-glükaan võib stimuleerida ka soole lümfotsüüte. Meie varasemad katsed kinnitasid, et pärmi rakuseina ekstrakt PW220 suurendas oluliselt soolestiku spetsiifilisi sIgA ja IgA + rakke (Bi et al., 2020). See tähendab, et nii b-glükaan G70 kui ka PW220 on tõhusad soole limaskesta immuunsuse edendamisel.

Tistanche kasulikud omadused meestele - tugevdavad immuunsüsteemi

Varem on teatatud loomade paranenud immuunsusest b-glükaani manustamisega. Guo et al. (2003) kinnitasid, et b-glükaani manustamine parandas kanadel bursa ja NDV-spetsiifiliste antikehade indeksit. Levine et al. (2018) väitsid, et b-glükaani lisamine võib soolestiku MHC Ⅱ ülesreguleerida ja suurendada CD45 + rakkude arvu, et leevendada soolekahjustusi.

Li et al. (2005) näitas, et toiduga saadav b-glükaan võib ülesreguleerida IL-8 ja TGF-b mRNA ekspressioonitasemeid sigade soolestikus. B-glükaani immunomoduleeriva toime mehhanism ei ole selge. Kim et al. (2010) näitasid, et b-glükaan soodustas dendriitrakkude küpsemist, reguleerides üles CD40, CD80 ja CD ekspressiooni86. Lisaks Lee ja Kim (2014) ning Su et al. (2020) teatasid, et b-glükaan aktiveeris mustrituvastuse retseptoreid, nagu dektiin-1 retseptor, Toll-sarnane retseptor ja CR3 (Baert et al., 2015). Põrn on immuunvastuse algatamise kriitiline organ ja mängib olulist rolli nii kaasasündinud kui ka omandatud immuunsuses (Bronte ja Pittet, 2013). Siiski on ainult vähe uuringuid, mis põhinevad mRNA ekspressiooni RNA-seq analüüsil põrnas pärast pärmi polüsahhariidide suukaudset manustamist. Käesolevas uuringus näitas Kyoto geenide ja genoomide entsüklopeedia analüüs, et need geenid rühmitati peamiselt kaheks rajaks, sealhulgas "Neuroaktiivse ligandi ja retseptori interaktsioon" ja "MAPK signaalirada". B-glükaanile suunatud mustrituvastuse retseptoreid rikastati immuunrakkude pinnal (Goodridge et al., 2009). Pärast b-glükaani äratundmist stimuleerisid need retseptorid türosiinkinaasi ja tuumafaktorit kappaB (NF-kappaB), mille tulemuseks oli põletikueelse tsütokiini sekretsiooni esilekutsumine ja immuunvastuste aktiveerimine (Kankkunen et al., 2010; Masuda et al. ., 2012; Xu et al., 2016; Bode jt, 2019). MAPK kui seriin-treoniini proteiinkinaaside perekond mängib olulist rolli kanade põletikus ja tsütokiinide tootmises. Byun et al. (2016) näitasid, et b-glükaan suurendas interferoon-g ja interleukiini -2 tootmist ning vallandas oluliselt suurema MAPK p38 fosforüülimise taseme peritoneaalsetes makrofaagides. Wang et al. (2014) teatasid, et b-glükaan nõrgendab põletikulisi reaktsioone THP-1 rakkudes, inhibeerides p38 MAPK aktivatsiooni. Selles uuringus tuvastati MAPK signaalirajas 13 DEG-d, sealhulgas DUSP4, CACNA2D1, PDGFD, PTPRR, ENSGALG00000006351, FAS, MAP2K3, MYC, DUSP5, MAX, SRF, PRKCB ja EGFR, mis võib viidata sellele, et b-glükaani reguleerimine põrnast MAPK kaudu kanadel. MAPK on konserveerunud Ser/Thr kinaaside klass rakkudes, mis osalevad peamiselt rakulistes reaktsioonides, nagu immuunvastus, apoptoos ja proliferatsioon. MAPK perekonda kuulub vähemalt 3 alamperekonda: c-Jun N-terminaalne kinaas (JNK), p38 MAPK ja ekstratsellulaarne signaaliga reguleeritud kinaas (ERK) (Hong et al., 2020; Zhang et al., 2021a). DUSP4 ja DUSP5 on kahespetsiifilised fosfataasid, mis inhibeerivad spetsiifiliselt MAPK pereliikmete (nt p38, JNK ja ERK) aktiivsust, mängides olulist reguleerivat rolli põletikulise ülereageerimise ennetamisel ja põletiku taandumise soodustamisel organismis (Imasato et al. ., 2002; Talreja jt, 2021). Lisaks on teatatud, et väike mittekodeeriv RNA nimega gga-miR-200a-3p pärsib põletikueelsete tegurite ekspressiooni ja reguleerib seega peremeesorganismi autoimmuunvastust, reguleerides negatiivselt MAPK rada. ja selle allavoolu signaalimolekulid (Pham et al., 2017). Käesolevas uuringus näitas RT-qPCR analüüs, et kanadel, kellele toideti b-glükaani (G70), vähenes P38, JNK ja ERK mRNA ekspressioon ning suurenes DUSP4 ja DUSP5 mRNA ekspressioon. Need tulemused viitavad sellele, et b-glükaani (G70) immuunsüsteemi tugevdav toime Newcastle'i tõve vaktsiinile võib olla seotud MAPK kaudu vahendatud põletikueelsete tegurite negatiivse tagasiside regulatsiooniga. Lisaks on FAS oluline aine, mis vahendab apoptoosi ja on immuunsüsteemi homöostaasi jaoks ülioluline (Krueger et al., 2003; Guegan ja Legembre, 2018). Samal ajal on CACNA2 pingest sõltuv kaltsiumikanali alaühik, millel on soodustav toime rakkude proliferatsioonile, migratsioonile ja invasioonile (Sun et al., 2020). Selles uuringus vähenesid FAS ja CACNA2 märkimisväärselt b-glükaani (G70) saanud kanadel, mis näitab, et b-glükaan (G70) avaldab immuunsust tugevdavat toimet peamiselt immuunrakkude apoptoosi pärssimise ja autoimmuunsuse tasakaalustamise kaudu. Need leiud annavad teoreetilise viite b-glükaani (G70) kasutamiseks immuunsüsteemi tugevdajana kliinilistes tingimustes. Siiski vajab täiendavat tõestust b-glükaani mehhanism, mis suurendab immuunvastust MAPK raja negatiivse tagasiside mõju kaudu. Huvitav on märkida, et geenid, mis kodeerivad katelitsidiini, mis sisaldavad CATH3, CATH1, CATH2, ja geenid, mis kodeerivad b-defensiini, sealhulgas AvBD6, AvBD7, AvBD1 ja AvBD4, olid võrdluses H (G-rühma vaktsiin{104} vaktsiin) oluliselt alla reguleeritud. vs kontroll (grupivaktsiin). Peremeeskaitsepeptiidid (HDP-d) on efektormolekulid, millel on kaasasündinud immuunsüsteemis ülioluline roll (Cuperus et al., 2013). Neid peptiide on avastatud mitmesugustel loomaliikidel imetajatest lindudeni. Tibudel on 4 katelitsidiini, mis koosnevad CATH1-st, CATH2-st, CATH3-st ja CATHB1-st, mis tapavad tõhusalt erinevaid baktereid (Hamad et al., 2017). Lindude beeta-defensiinid (AvBD), teise nimega gallinacean, on väikesed katioonsed peptiidid, mille tsüsteiinijääkide vahel on 3 tsüsteiini disulfiidsidet ja millel on oluline roll kaasasündinud immuunsüsteemis (Yoshimura, 2015). Katelitsidiinide ja beeta-defensiini ekspressiooni vähenemist seletati tõenäoliselt tagasiside regulatsiooniga, kus bakterite ja parabakterite populatsioone vähendasid pärmi rakuseina polüsahhariidid (Bi et al., 2020). Sarnased tulemused ilmnesid ka teistes uuringutes. Shao et al. (2016) näitas, et pärmi b-glükaani lisamine broilerikanadele surus alla Salmonella infektsiooni ja vähendas HDP ekspressiooni kvantitatiivse reaalajas PCR analüüsi abil. Selles uuringus suurendas peamiselt b-glükaanist koosnev toode G70 NDV-spetsiifiliste antikehade taset seerumis, suurendas perifeerse vere lümfotsüütide ja soole lümfotsüütide NDV stimulatsiooniindeksit ning soodustas perifeerse vere T-lümfotsüütide diferentseerumist CD-ks 123}} T-rakud. Lisaks näitas RNA-seq analüüs, et G70 reguleeris üles G-valguga seotud serotoniini retseptori ja MHC I klassi polüpeptiidiga seotud mRNA ekspressioone ning katelitsidiini ja beeta-defensiiniga seotud mRNA ekspressioone. Arvestades G70 suurenenud mõju kanade ND vaktsiinile, saab G70 mõju teistele kodulindude vaktsiinidele, näiteks lindude gripi vaktsiinile, edasi uurida.

Joonis 6. KEGG raja analüüs.

Joonis 7. Valitud DEG kandidaatide RT-qPCR kinnitus. Andmed on väljendatud keskmisena § SE.

Joonis 8. Suhteline mRNA ekspressioon põrnas. Põrnast ekstraheeriti kogu RNA. Kana b-aktiini serveeriti sisemise kontrollgeenina. Andmed on väljendatud keskmisena § SE.

VIITED

Baert, K., E. Sonck, BM Goddeeris, B. Devriendt ja E. Cox. 2015. Rakutüübispetsiifilised erinevused b-glükaani äratundmisel ja signaalimisel sigade kaasasündinud immuunrakkudes. Dev. Comp. Immunol. 48:192–203.

Ball, C., A. Forrester, A. Herrmann, S. Lemiere ja K. Ganapathy. 2019. Newcastle'i haiguse viiruse või lindude metapneumoviiruse elusvaktsiinide poolt pakutav võrdlev kaitseimmuunsus, kui seda manustatakse ühepäevastele broileritibudele koos nakkusliku bronhiidi viiruse klassikaliste ja teisendtüvedega. Vaktsiin. 37:7566–7575.

Bi, S., J. Zhang, Y. Qu, B. Zhou, X. He ja J. Ni. 2020. Pärmi rakuseina toode suurendas pärast kanade suukaudset vaktsineerimist soole IgA vastust ja muutis pimesoole mikrofloora liike. Poult. Sci. 99:6576–6585.

Bi, S., J. Zhang, L. Zhang, K. Huang, J. Li ja L. Cao. 2022. Pärmi rakuseina ülesreguleeritud raku poolt vahendatud immuunvastused Newcastle'i haiguse viiruse vaktsiinile. Poult. Sci. 101:101712–101721.

Bode, K., F. Bujupi, C. Link, T. Hein, S. Zimmermann, D. Peiris, V. Jaquet, B. Lepenies, H. Weyd ja PH Krammer. 2019. Dektiin-1, mis seondub anneksiinidega apoptootilistel rakkudel, kutsub esile perifeerse immuuntolerantsuse NADPH oksüdaasi-2 kaudu. Kamber. Rep 29:4435–4446.

Bohacova, P., J. Kossl, M. Hajkova, B. Hermankova, V. Holan ja E. Javorkova. 2021. Mitogeeni poolt stimuleeritud B- ja T-rakkude erinevus R-fükoerütriiniga konjugeeritud antikehade mittespetsiifilises seondumises. J. Immunol. meetodid. 493:113013–113023.

Boyaka, PN, A. Tafaro, R. Fischer, K. Fujihashi, E. Jirillo ja JR McGhee. 2003. Immuunsüsteemi terapeutiline manipuleerimine: kaasasündinud ja adaptiivse limaskesta immuunsuse tugevdamine. Curr. Pharm. Disain. 9:1965–1972.

Bronte, V. ja MJ Pittet. 2013. Põrn immuunsuse lokaalses ja süsteemses regulatsioonis. Immuunsus. 39:806–818.

Byun, E., S. Park, B. Jang, N. Sung ja E. Byun. 2016. Gamma-kiiritatud b-glükaan kutsub MAPK ja NF-KB radade kaudu esile immunomodulatsiooni ja vähivastase toime. J. Sci. Toit. Agr. 96:695–702.

Chen, X., X. Chen, S. Qiu, Y. Hu, C. Jiang, D. Wang, Q. Fan, C. Zhang, Y. Huang, Y. Yu, H. Yang, C. Liu, Z Gao, R. Hou ja X. Li. 2014. Epimedium polüsahhariidi-taruvaigu flavooni suukaudse vedeliku mõju limaskestade immuunsusele kanadel. Int. J. Biol. Macromol. 64:6–10.

Cui, X., Y. Wang, R. Guan, M. Lu, L. Yuan, W. Xu ja S. Hu. 2020. Tõhustatud immuunvastused hu lammaste seerumi proteoomianalüüsiga taimeõli adjuvandis emulgeeritud suu- ja sõrataudi vaktsiinile. Vaktsiinid. 8:180–197

Cuperus, T., M. Coorens, A. van Dijk ja HP ​​Haagsman. 2013. Lindude peremeesorganismi kaitsepeptiidid. Dev. Comp. Immunol. 41:352–369.

Goodridge, HS, AJ Wolf ja DM Underhill. 2009. Beeta-glükaani äratundmine kaasasündinud immuunsüsteemi poolt. Immunol. Ilm 230:38–50.

Guegan, J. ja P. Legembre. 2018. Fas/CD95 mitteapoptootilised funktsioonid immuunvastuses. FEBS J 285:809–827.

Guo, Y., RA Ali ja MA Qureshi. 2003. Beeta-glükaani mõju immuunvastustele broileritibudel. Immunopharm. Immunol. 25:461–472.

Hamad, SK, S. Kim, SW El-Kadi, EA Wong ja RA Dalloul. 2017. Peremeesorganismi kaitsepeptiidide võrdlev ekspressioon kalkunilindudel. Poult. Sci. 96:2083–2090.

Hasted, T., S. Sharif, P. Boerlin ja MS Diarra. 2021. Puuviljade ja nende ekstraktide immunostimuleeriv potentsiaal kodulindudel. Esiosa. Immunol. 12:641696.

Hong, Y., J. Lee, TH Vu, S. Lee, HS Lillehoj ja YH Hong. 2020. Kana lindude b-defensiin 8 moduleerib immuunvastust mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi signaaliradade kaudu kana makrofaagide rakuliinis. Poult. Sci. 99:4174–4182.

Horst, G., R. Levine, R. Chick ja C. Hofacre. 2019. Beeta- 1, 3-glükaani (AletaTM) mõju broilerikanade vaktsineerimisreaktsioonile. Poult. Sci. 98:1643–1647.

Imasato, A., C. Desbois-Mouthon, J. Han, H. Kai, ACB Cato, S. Akira ja J. Li. 2002. P38 MAPK inhibeerimine glükokortikoidide poolt MAPK fosfataasi -1 indutseerimise kaudu suurendab mittetüpiseeritavat Haemophiluse mõju-indutseeritud teemaksutaolise retseptori ekspressiooni 2. J. Biol. Chem. 277:47444–47450.

Kankkunen, P., L. Teiril€a, J. Rintahaka, H. Alenius, H. Wolff ja S. Matikainen. 2010. (1,3)-beeta-glükaanid aktiveerivad inimese makrofaagides nii dektiini-1 kui ka NLRP3 põletiku. J. Immunol. 184:6335–6342.

Kim, HS, JY Kim, HK Lee, MS Kim, SR Lee, JS Kang, HM Kim, K. Lee, JT Hong, Y. Kim ja S. Han. 2010. Dendriitrakkude aktiveerimine umbilicaria esculentast eraldatud glükaani poolt. Immuunsus. Võrk 10:188–197.

Krueger, A., SC Fas, S. Baumann ja PH Krammer. 2003. CD95 roll perifeerse T-raku apoptoosi reguleerimisel. Immunol. Ilm 193:58–69.