Cistanche Deserticolast eraldatud fenüületanoidglükosiidi kogufraktsiooni kasulikud mõjud luu mikrostruktuurile rottidel, kellel on eemaldatud munasarjad

Lingling Yang, Shuqin Ding, Bo Zhang, Jingjing Liu, Yanhong Dong, Qiwen Tang, Pingping Yang ja Xueqin Ma

1 Farmatseutilise analüüsi osakond, Ningxia meditsiiniülikooli farmaatsiakool, 1160 Shenli tänav, Yinchuan 750004, Hiina

2 Kliinilise meditsiini kool, Ningxia meditsiiniülikool, 692 Shenli tänav, Yinchuan 750004, Hiina

3 Hui etnilise meditsiini moderniseerimise võtmelabor, haridusministeerium, Ningxia meditsiiniülikool, 1160 Shenli tänav, Yinchuan 750004, Hiina

See on avatud juurdepääsuga artikkel, mida levitatakse Creative Commonsi omistamislitsentsi alusel, mis lubab piiramatut kasutamist, levitamist ja reprodutseerimist mis tahes kandjatel, eeldusel, et originaalteosele viidatakse õigesti.

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstraktne

Käesoleva uuringu eesmärk oli hinnata fenüületanoidglükosiidide kogufraktsiooni osteoporoosivastast aktiivsust.Cistanchedeserticola(CDP) rottidel, mis on indutseeritud ovariektoomiaga (OVX), samuti sellega seotud mehhanismidega. Pärast 3-kuulist suukaudset manustamist taastus OVX rottidel vähenenud luutihedus, seerumi Ca ja P ning halvenenud trabekulaarse luu mikroarhitektuur paranes osaliselt Cistanche deserticola (60, 120 ja 240 mg/kg) sekkumisega. luu resorptsiooni markerite sisaldus vähenes ja luu moodustumise indeksi bioaktiivsus oli ülesreguleeritud; vahepeal vähenes MDA sisaldus ja CDP-ravi suurendas GSH-d. Aastal identifitseeriti koostiselt 8 fenüületanoidglükosiidi ühenditCistanchedeserticola(CDP), mille üldsisaldus on HPLC meetodil kvantifitseeritud 50,3 protsenti. Mehaaniliselt,Cistanchedeserticola(CDP) vähendas TRAF6, RANKL ja RANK taset, pärssides seega RANKL/RANK/TRAF6-indutseeritud allavoolu NF-κB ja PI3K/AKT signaaliradade aktivatsiooni ning lõpuks takistades NFAT2 ja c peamiste osteoklastogeensete valkude aktiivsust - Fos. Kõik ülaltoodud andmed viitasid sellele, et CDP avaldas soodsat mõju luu mikrostruktuurile ovariektoomiaga rottidel ja need mõjud võivad olla seotud NF-KB ja PI3K/AKT signaaliradadega, mille käivitas RANKL, RANK ja TRAF6 seondumine.

Cistanche tubulosasellel on palju efekte, lisateabe saamiseks klõpsake siin

1. Sissejuhatus

Menopausijärgne osteoporoos, mille all kannatab iga kolmas üle 50-aastane naine, on muutumas peamiseks terviseriskiks, mis mõjutab enam kui 200 miljonit naist kogu maailmas [1]. Menopausi ajal põhjustab östrogeeni taseme järsk langus tavaliselt suurenenud osteoklastogeneesist põhjustatud luu resorptsiooni ületamist; seejärel rikuti tasakaal osteoblastide põhjustatud luu moodustumise ja osteoklastide põhjustatud luu resorptsiooni vahel ning kiirenenud luuresorptsioon põhjustas lõpuks osteoporoosi ja isegi puusaluu või lülisamba murru [2]. Usuti, et osteoklastide diferentseerumine vallandas siis, kui tuumafaktori kappa B (RANK) retseptori aktivaator seondus RANKL-iga, RANK-i ligandiga. RANK-i ja RANKL-i kombinatsiooni ei saa aga aktiveerida, kui sellega ei liideta valgu kasvaja nekroosifaktori retseptoriga seotud faktorit 6 (TRAF6) [3], millele järgneb allavoolu signaaliradade, sealhulgas PI3K/AKT ja NF-κB, stimuleerimine. Ja lõpuks reguleeriti aktiveeritud T-rakkude c2 (NFAT2) ja c-Fos tuumafaktori ekspressioone [4], et moduleerida osteoklastide diferentseerumist ja luu resorptsiooni. Seega arvati, et tegurid ja regulaatorid, mis on otseselt või kaudselt seotud osteoklastide aktiveerimise ja diferentseerumisega, on luuhõrenemise vältimise olulised sihtmärgid.

On tõepoolest olemas mõned kliinilised ja sünteetilised hormoonasendusravi ravimid, nagu östradioolvaleraat, mis on menopausijärgse osteoporoosi ravis tõhusad. Kahjuks suurendasid mõned neist tõsiste vähivormide, sealhulgas rinna- ja endomeetriumivähi [5] riski, mis piiras nende kliinilist rakendust. Seetõttu on vaja valida teisi alternatiive, millel on nii tõhusus kui ka minimaalsed kõrvalmõjud. Traditsioonilised hiina ravimid (TCM), samuti isoleeritud bioaktiivsed ühendid ja fraktsioonid [6–9] osutusid tõhusaks mitmesuguste haiguste, sealhulgas menopausijärgse osteoporoosi korral. Nende bioaktiivsete komponentide ja fraktsioonide hulgas arvati, et potentsiaalse efektiivsusega fenüületanoidglükosiidi (PhG) ühendeid on paljulubavad ained osteoporoosi ravis [10–12]. PhG-de struktuurid koosnevad kaneelhappe aglükoonist, hüdroksüülfenüületüülrühmast, mis on glükosiidsideme kaudu ühendatud -glükopüranoosi, apioosi, galaktoosi, ramnoosi või ksüloosiga. Neid leidub laialdaselt perekonna meditsiiniliikidesCistanche[13]. CistanchedeserticolaYC Ma on ametlik TCM, mis on registreeritud Hiina farmakopöas ja lisaks sellele, et C deserticola on oluline TCM [14], on see ka väheste kõrvalmõjudega vananemisvastane tooniktaim, millest on välja töötatud riikliku toiduga heakskiidetud ravimlik vedelik ja toitevedelik. ja Ravimiamet. Hiina farmakopöa andmetel on põliselanikud traditsiooniliselt kasutanud C. deserticola't neeruessentsi puudulikkusega seotud probleemide, nagu lihaste nõrkus ja nimmepiirkonna nõrkus, raviks ning fenüületanoidglükosiidühendid, sealhulgas ehhinakosiid ja akteosiid, on selle ürdi peamised bioaktiivsed koostisosad. Vastavalt TCM-i teooriale "neer-valitseb luu" juhib luusüsteemi neeruessents [15] ja luudega seotud probleeme, nagu osteoporoos, saab ravida ravimtaimede või ühenditega, millel on neeruessentsi toitmine. Seetõttu püstitasime hüpoteesi, et C. deserticolast eraldatud fenüületanoidglükosiidi kogufraktsioon oli vähemalt osaliselt kasulik osteoporoosi ravis. Seetõttu töötati käesolev katse välja meie hüpoteesi kinnitamiseks, kasutades munasarjade eemaldamise (OVX) rotimudelit; Lisaks luu resorptsiooni ja moodustumise markeritele, mida tuleb hinnata, kasutati osteoporoosivastase bioaktiivsuse peamiste mehhanismide uurimiseks ka antioksüdatsiooniindeksit ning RANKL/RANK/TRAF6- indutseeritud PI3K/AKT ja NF-κB signaaliülekandeteid. .

2. Materjalid ja meetod

2.1. Taimsed materjalid ja ettevalmistused.

Kokku 30 kg varredCistanchedeserticolaY.C. Ma koguti Yongningi maakonnast 2015. septembril koordinaatidega 106.026597 ja 38.262816, Ningxia provints, Hiina. Rohu tuvastas dr Lin Dong (Ningxia meditsiiniülikooli farmakognoosia osakond) ja vastava isendi (nr 201509{{40}}1) säilitati farmatseutilise analüüsi osakonnas. Esiteks ekstraheeriti 30,0 kg pulbrilist C. deserticola't püstjahutiga, kasutades lahustina 70% etanooli; materjali ja lahusti suhe määrati 1:10 ja tagasijooksuaeg oli 2 tundi 3 korda. Seejärel ühendati kõik filtraadid ja kondenseeriti alandatud rõhul temperatuuril 60 °C. Teiseks kasutati esialgseks eraldamiseks AB-8 makropoorseid vaigukolonne ja etanooli vees erinevas vahekorras (0 protsenti, 20 protsenti, Elueerimiseks kasutati 30 protsenti, 40 protsenti, 50 protsenti ja 60 protsenti, kumbki 60 liitrit. Kolmandaks ühendati 40% ja 50% eluendid ja puhastati täiendavalt, kasutades korduvaid AB-8 makropoorseid vaigukolonne, mille eluentide sisaldus oli 0%, 20%, 30%, 40% ja 50% etanooli vees ja iga eluendi maht oli 12 liitrit. Lõpuks koguti 40-protsendiline fraktsioon ja kondenseeriti alandatud rõhul, saades 150 g C. deserticola (CDP, saagis 0,5%) kahvatukollase sette fenüületanoidglükosiidi fraktsiooni. In vivo katsetes kasutati CDP lahustamiseks 0,5% CMC-Na lahustit; suukaudseks manustamiseks loomadele määrati 1 ml 100 g kehamassi kohta; in vitro Western blot analüüsi jaoks lahustati CDP DMSO-ga ja seejärel lahjendati DMEM-ga, et saada lõppkontsentratsioonid 0,1 mg/ml, 0,01 mg/ml ja 0,001 mg/ml.

2.2. Kemikaalid ja lahustid.

Östradioolvaleraat (EV) pärines Delpharm Lille SAS-ist Prantsusmaalt; leeliselise fosfataasi (ALP), luu gla-valgu (BGP), tartraadiresistentse happelise fosfataasi (TRAP) ja desoksüpüridinoliini (DPD) ristsidemete ELISA komplektid firmalt Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Shanghai, Hiina, 201605; malondialdehüüdi (MDA, 20181221), superoksiiddismutaasi (SOD, 20121218) ja glutatiooni (GSH, 20181221) reaktiivide komplektid Nanjing Jianchengi bioloogilise tehnika instituudist, Nanjing, Hiina; lntact parathormooni (l-PTH, NEWASHE7UZ), kaltsitoniini (2L9ISN7AIU) ja östrogeeniga seotud retseptori alfa (ERR, Y3AY8QEWB3) ristsidemega ELISA komplektid firmalt Elabscience Biotechnology Co. Ltd., Wuhan, Hiina; katepsiin K ELISA reaktiivikomplekt firmalt BioVision, Ameerika, 1l300141; RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-κB p65 (AH04138226), PI3 alfa1AC95 (p26638226), PI3 alfa1AC95 (p26685) primaarsed antikehad. , AKT 1 (AF05173234), -aktiini (17AV0411) ja mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud kitse küülikuvastase IgG sekundaarsed antikehad firmalt ZSGB-BIO, Hiina, 136080; kogu BCA valgu analüüsikomplekt ja kaubanduslik komplekt luude oklastide moodustumise ja veise loote seerumi tuvastamiseks ning Dulbecco modifitseeritud Eagle'i sööde (DMEM) firmalt HyClone, Logan, UT, USA; polüvinülideenflfluoriid (PVDF) membraan firmalt Millipore Life Sciences, Billerica, MA, USA; penitsilliini ja streptomütsiini firmalt Gibco, Rockville, MD, USA. Kõik muud kasutatud keemilised ained olid AR-klassi.

2.3. Cistanche Deserticola P HPLC kvantifitseerimine.

CDP koostise tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks kasutati Agilent 1220 HPLC seadet. Kromatograafia tingimused olid järgmised: C18 kolonn (TSK-GEL, 4 6 I d × 250 mm, 5 μm); gradientelueerimine sisaldas lahusteid A (atsetonitriil) ja B (0,5 protsenti äädikhapet sisaldav vesi) (0-10 min: 17-20 protsenti A; 10-30 min: 20-25 protsenti A; ja 30-40 min: 25-30 protsenti A); tuvastamise lainepikkus oli 333 nm; ümbritseva õhu temperatuur; voolukiirus oli 1,0 ml/min; proovi süstimise maht oli 5 μL. Tuvastati kaheksa PhG ühendit, nimelt tsistanosiid F, ehhinakosiid, 6'-atsetüüllakteosiid, tsistanosiid C, tsistanosiid A, akteosiid, 2'-atsetüüllakteosiid ja isoakteosiid; kasutades vastavaid võrdlusaineid ja välist standardmeetodit, kvantifitseeriti ülaltoodud 8 PhG sisaldus HPLC analüüsiga (joonis 1).

2.4. Loomkatsete protokoll.

Ningxia Meditsiiniülikooli loomkatsete keskusest saadi kokku 6 0 emast täiskasvanud Sprague-Dawley rotti vanuses 3 kuud ja kelle keskmine esialgne kehakaal oli umbes 234 ± 25 g. Rotte hoiti standardses spetsiifilises patogeenivabas keskkonnas, et kohaneda 1 nädala jooksul. Seejärel anesteseeriti kõik rotid (kloraalhüdraat, 100 mg/kg, ip) või tehti võlts munasarjade eemaldamine (SHAM) või eemaldati kaks munasarja ja jagati seejärel juhuslikult 5 alarühma: neile manustati suukaudselt vehiikulit (0,5 protsenti CMC- Na) määrati mudelrühmaks (OVX), östradioolvaleraat (1 mg/kg/päevas) positiivseks rühmaks (EV) ja 60, 120 ja 240 mg/kg/päevas CDP madalaks (CDPL), keskmise (CDPM) ja kõrge (CDPH) annuste rühmad. Kõikidele rottidele manustati suukaudselt iga päev ja manustati 3 kuud, kusjuures annust kohandati iga 2 nädala järel, mis sõltus kogu kehamassi muutusest. Loomkatse viimasel päeval saadi 24-tunnine uriin, kasutades metaboolseid puure; seerum koguti tuimestatud rottide reiearterist; parem reieluu, sääreluu ja kõik elundid lõigati lahti ning säilitati edasiseks analüüsiks temperatuuril -80 C kraadi. Meie läbiviidud loomkatsed kiitis heaks Ningxia meditsiiniülikooli institutsionaalne loomade hooldamise ja kasutamise komitee.

2.5. Luu mineraaltiheduse määramine ja mikro-CT analüüs.

Esiteks kasutati iga roti parema reieluu luu mineraalse kogutiheduse hindamiseks kahe energiaga röntgenikiirguse absorptiomeetria aparaati (Lunar, USA); teiseks kasutati sama reieluu trabekulaarse luu mikroarhitektuuri 3D-kujutise hindamiseks mikro-CT-skanneri abil (GE, Ameerika). Ideaalse 3D-pildi saamiseks määrati isotroopseks eraldusvõimeks 14 μm; huvipakkuv piirkond (ROI) valiti, määrates iga proovi reieluu kasvuplaadis samad koordinaadid; ja luu morfomeetrilised parameetrid, sealhulgas trabekulaarne eraldumine (Tb. Sp), trabekulaarne arv (Tb. N), trabekulaarne paksus (Tb. Th), luu mineraalide sisaldus (BMC), koe mineraalne tihedus (TMD) ja koe mineraalide sisaldus (TMC). ) saadi ROI-d analüüsides.

2.6. Seerumi ja uriini biokeemiline analüüs.

Seerumi katepsiin K, TRAP, SOD ja GSH aktiivsus, samuti seerumi PTH, kaltsitoniini, ERR , MDA, BGP ja uriini DPD sisaldus määrati vastavate reaktiivikomplektide abil vastavalt tootja juhistele ja Leeliselise fosfataasi (ALP) taset ning seerumi ja uriini kaltsiumi (Ca) ja fosfori (P) sisaldust hinnati automaatse masina (Ciba-Corning 550 Diagnostics Corp., Oberlin, OH, USA) abil.

2.7. Western blot analüüs.

Osteoklastid indutseeriti, kasutades RAW 264.7 rakke, millele oli lisatud makrofaagide kolooniaid stimuleerivat faktorit (MCSF) ja RANKL-i. Lühidalt, 1 × 107 RAW 264.7 rakku kultiveeriti 6-süvendiga plaadil 30 ng/mL MCSF ja 25 ng/ml RANKL juuresolekul. Pärast 6-päevast induktsiooni identifitseeriti küpsed osteoklastirakud TRAP-värvimise meetodil ja vastava komplektiga, seejärel töödeldi neid CDP-ga (0,1, 0,01 ja 0,001 mg/ml). vastavalt) 24 tundi; seejärel lüüsiti rakud lüüsipuhvriga, mis sisaldas 0,5 mmol fenüülmetüülsulfonüülfluoriidi, proteaasi ja fosfataasi inhibiitoreid. Lüsaat eraldati seejärel 10% SDS-PAGE abil ja kanti üle PVDF membraanile, mida sondeeriti AKT1, NF-κB-p65, RANKL, PI3K-p85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos ja -aktiiniga. (1: 400) pärast blokeerimist 5% rasvavaba piimaga 2 tundi. Samad membraanid eemaldati ja sondeeriti uuesti vastavalt ülaltoodud 9 vastava antikehaga, seejärel tuvastati need lõpus Image Labi tarkvaraga. Katseid korrati kolm korda.

2.8. Statistiline analüüs.

Kõiki in vivo ja in vitro katsetest saadud andmeid, mida kirjeldati kui keskmine ± SD, analüüsiti ühesuunalise ANOVA abil, millele järgnes Dunnetti testi (SPSS 22.0 tarkvara, SPSS, USA); p < 0="" 05="" oli="" statistiliselt="">

Tulemused

3.1. Cistanche Deserticola P keemiline koostis.

HPLC meetodit kasutades kaheksafenüületanoidglükosiidselles fraktsioonis leiti ühendeid, nagu näitab joonis 1. Standardviiteid ja välist standardmeetodit kasutades identifitseeriti ja kvantifitseeriti ühendid ja nende sisaldus järgmiselt: (1) akteosiid F (3,6 protsenti), (2) ehhinakosiid (8,8 protsenti), (3) tsistanosiid A (5.{101} {9}} protsenti), (4) akteosiid (13,3 protsenti), (5) isoakteosiid (3,3 protsenti), (6) akteosiid C (3,6 protsenti), (7) 2'-atsetüüllakteosiid (9,9 protsenti) ja (8) ) 6'-atsetüüllakteosiid (3,2 protsenti). Nende kaheksa komponendi kogusisaldus oli 50,7 protsenti.

3.2. Cistanche Deserticola P mõju luu mineraalide tihedusele ja trabecula mikroarhitektuurile.

Erinevate alarühmade rottide luude kogutihedus on näidatud joonisel 2. OVX mudelrühma rottidel täheldati luu mineraalse tiheduse sisalduse vähenemist, mis vähenes peaaegu 12.0 protsenti pärast seda. 12 operatsiooninädalat võrreldes SHAM-rühma rottidega (p < 0="" 001).="" kõigil="" cdp-ga="" ravitud="" rottidel="" oli="" ovx="" mudeli="" rottidega="" võrreldes="" oluliselt="" suurenenud="" luu="" mineraalne="" tihedus,="" vastavalt="" 11,2%,="" 120%="" ja="" 10,7%="" (p="">< 0="" 01).="" grupp.="" lisaks="" näitasid="" mikro-ct="" rekonstrueerimine="" ja="" reieluu="" histomorfomeetriline="" määramine="" kooskõlas="" luude="" mineraaltiheduse="" andmetega,="" et="" ovx="" rühma="" rottidel="" ilmnes="" trabekulaararhitektuuri="" ilmselge="" halvenemine,="" mida="" tõendab="" ka="" trabeekulite="" arvu="" ja="" pindala="" märgatav="" vähenemine.="" kui="" märgatavalt="" suurenenud="" tb.="" sp="" võrreldes="" sham-rühma="" rottidega.="" ravi="" cdp-ga="" hoidis="" ära="" ovx-i="" põhjustatud="" trabekulaarse="" arhitektuuri="" halvenemise;="" nagu="" joonisel="" 3="" on="" näidatud,="" on="" bmc,="" tmc="" ja="" tb.="" n="" väärtused="" suurenesid="" oluliselt="" ja="" tb="" pindala.="" sp="" vähenes="" märkimisväärselt,="" samas="" kui="" tmd="" ja="" tb="" väärtused.="" näis,="" et="" ovx-operatsioon="" ja="" meie="" cdp="" sekkumine="" neid="" oluliselt="" ei="">

3.3. Cistanche Deserticola P mõju uriini ja seerumi biokeemilistele parameetritele.

Nagu jooniselt 4 on näha, tuvastati OVX-i mudelirühma rottidel uriini P taseme ja seerumi kaltsitoniinisisalduse oluline langus, mis oli peaaegu 30 protsenti ja 60 protsenti väiksem kui SHAM-rottidel (p < 0="" 001="" ),="" samas="" kui="" ovx="" ja="" sham="" rühmade="" vahel="" ei="" täheldatud="" ca2="" ja="" seerumi="" ca,="" samuti="" seerumi="" p="" ja="" seerumi="" pth="" selgeid="" suurenevaid="" või="" vähenevaid="" suundumusi.="" cdp-ga="" töötlemine="" hoidis="" märkimisväärselt="" ära="" seerumi="" p="" ja="" ca="" kaotuse="" ovx="" rottidel,="" mida="" tõendab="" seerumi="" p="" ja="" ca="" märkimisväärselt="" ülesreguleeritud="" tase="" (p="">< 0="" 05)="" võrreldes="" ovx="" mudelrühma="" rottidega.="" lisaks="" täheldati="" nii="" cdp="" väikese="" kui="" ka="" suure="" annuse="" rühmades="" kaltsitoniini="" suurenenud,="" kuid="" mittestatistiliselt="" olulisi="" suundumusi="" võrreldes="" ovx="">

3.4. Cistanche Deserticola P mõju luude moodustumisele ja luu resorptsiooni markeritele.

CDP kasulikku mõju luu moodustumise indeksile, samuti inhibeerivat mõju luu resorptsiooni markeritele on kirjeldatud joonisel 5. Mis puudutab luu moodustumise markereid, siis seerumi BGP taset peaaegu ei mõjutanud munasarjade eemaldamise operatsioon, mida tõendasid mitte- olulisi muutusi täheldati kõigis ravitud rühmades, samas kui seerumi ALP statistiliselt oluline paranemine saavutati nii CDP sekkumisrühmade väikeste (60 mg/kg) kui ka mõõdukate (120 mg/kg) annuste korral. võrreldes SHAM-rühma rottidega (p < 0="" 01).="" mis="" puutub="" luu="" resorptsiooniindeksisse,="" siis="" seerumi="" katepsiin="" k="" ja="" dpd,="" samuti="" trap="" tasemed="" ovx-i="" mudelirühma="" rottidel="" suurenesid="" sham-rottidega="" võrreldes="" oluliselt="" vastavalt="" ligikaudu="" 75,0%,="" 41,4%="" ja="" 21,0%.="" ja="" kui="" raviti="" cdp-ga,="" eriti="" väikese="" annusega="" 60="" mg/kg,="" inhibeeriti="" katepsiin="" k="" ja="" dpd="" ning="" trap-i="" omadused="" ovx="" mudelirühmas="" märkimisväärselt="" vastavalt="" 67,3%,="" 41,4%="" ja="" 25,9%.="" võrreldes="" ovx="" mudelirühma="">

3.5. Cistanche Deserticola P mõju vagiinale ja emakale ning kogu kehamassile.

Kuues rühmas täheldati enne ravi mitteolulisi erinevusi rottide esialgses kogukeha massis (joonis 6). Munasarjade eemaldamise operatsioon tõi aga kaasa OVX-i mudelirühma rottide lõpliku kehakaalu olulise suurenemise, mis on peaaegu 360 protsenti, samas kui emaka ja tupe märgkaal vähenes drastiliselt peaaegu 9{{4} võrra. }}.0 protsenti ja 60,0 protsenti vastavalt, võrreldes SHAM-rottidega (p < 0="" 001).="" kuigi="" err-i="" sisaldus="" ei="" näidanud="" olulist="" erinevust="" ovx-i="" ja="" sham-i="" rühmade="" vahel,="" suurendasid="" kõik="" ravirühmad,="" sealhulgas="" cdp="" ja="" ev,="" err-i="" taset="" märkimisväärselt.="" veelgi="" enam,="" ev-ga="" ravimisel="" muutusid="" ülalnimetatud="" kehamassi="" suurenemine,="" samuti="" ovx-rottide="" tupe="" ja="" emaka="" kaalu="" kaotus="" osaliselt="" vastupidiseks="" (p="">< 0="" 001),="" kuid="" cdp="" sekkumine="" ei="" mõjutanud="">

3.6. Cistanche DeserticolaP mõju seerumi MDA, SOD ja GSH tasemele.

Seerumi SOD ja GSH omadustes ei esinenud statistiliselt olulist erinevust SHAM ja OVX mudelirühmade vahel; nagu kirjeldab joonis 7, võib ülaltoodud kahe rühma vahel täheldada GSH kasvutendentsi. Lisaks oli OVX-i mudelirühma rottidel seerumi MDA tase järsult ülesreguleeritud peaaegu 50 protsenti, võrreldes SHAM-rottidega. CDP-ravi SOD aktiivsust ei mõjutanud, samas kui CDP sekkumine parandas oluliselt GSH omadusi ning CDP vähendas märkimisväärselt MDA taset vastavalt 33,9% ja 42,4% annuste 60 ja 240 mg/kg korral. p < 0="">

3.7. Cistanche deserticola P mõju valgu ekspressioonitasemetele.

Meie andmed, mis on näidatud joonisel 8, näitasid, et CDP-ravi vähendas oluliselt TRAF6, RANK ja RANKL valgu taset võrreldes kontrolliga. Allavoolu signaaliteed, sealhulgas NF-κB, suruti alla ja PI3K / AKT-d stimuleeriti CDP sekkumisega, mida tõendab NF-κB-p65 allareguleerimise ekspressioon, samas kui PI3K-p85 ja AKT1 olid ülesreguleeritud. Järelikult vähenes NFAT2 ekspressioon oluliselt ja c-Fos suurenes pärast töötlemist CDP-ga kontsentratsioonil 0.001-0,1 mg/ml. Soovitatud mehhanismi on kirjeldatud joonisel 9, kus CDP vähendas RANKL-i ja RANK-i tasemeid, mis viis selle ligandi seondumiskoguste vähenemiseni selle retseptoriga, ja RANKL-i seost RANK-iga vähendas veelgi TRAF6-i alareguleerimine, millele järgnes allavoolu radade, sealhulgas NF-κB raja allasurumine, samas kui stimuleeriti PI3K / AKT signaali rada, mis lõpuks viis NFAT2 ekspressiooni vähenemiseni ja c-Fos taseme tõusuni.

4. Arutelu

Fenüületanoidglükosiidid on looduslikult esinevad veeslahustuvad komponendid, mida leidub ravimtaimeriigis laialdaselt [11]. Siiani on fenüületanoidglükosiidide ühendid meelitanud üha rohkem teadlasi, kuna neil on ilmne roll mitmesuguste inimeste tervisehäirete ja kõrvalekallete ravis [13]. Kümnetest looduslikest ravimtaimedest tuvastati ja eraldati osteoporoosivastaste bioaktiivsete fraktsioonide ja ühendite arv, sealhulgas polüfenool- ja fenüületanoidglükosiidid [5, 10, 12, 16, 17]. C. deserticola on hästi tuntud kui "kõrbe ženšenn", mis viitab selle söödava TCM-i ohutusprofiilile [18, 19]. Üldise toonilise ürdina ja loodusliku tervisetoiduna, mida on Aasia riikides pikka aega kasutatud, on C. deserticola kasulik neerude tugevuse suurendamisel. Leiti, et TCM-i, mida traditsiooniliselt kasutatakse neeruessentsi turgutamiseks ja säilitamiseks, kasutati tavaliselt osteoporoosi raviks. Nii in vitro kui ka in vivo avaldatud andmed on tõestanud C. deserticola [20–23] ja fenüületanoidglükosiidide koostisosade, sealhulgas fenüületanoidglükosiidide osteoporoosivastast toimet. ehhinakosiid ja akteosiid on selle söödava ravimtaime peamised bioaktiivsed komponendid; kõik need viitasid sellele, et mitte ainult ehhinakosiidi ja akteosiidi endid, vaid ka teisi C. deserticolas sisalduvaid fenüületanoidglükosiidi komponente peeti vastutavaks selle ürdi osteoporoosivastase toime eest. Meie käesolevas uuringus kasutati C. deserticola fenüületanoidglükosiidi fraktsiooni eraldamiseks ja rikastamiseks soodsat ohutust makropoorset vaiku ning HPLC meetodil kaheksa peamist fenüületanoidglükosiidi komponenti, nimelt akteosiid F, ehhinakosiid, tsistanosiid A, akteosiid, Eraldatud fenüületanoidglükosiidi fraktsioonist leiti isoakteosiidi, akteosiid C, 2'-atsetüüllakteosiid ja 6'-atsetüülakteosiidi, mille sisaldus oli 3,6%, 8,8%, 5,0%, 13,3%, 3,9%, 3,9%. ja vastavalt 3,2 protsenti. On tõestatud, et ehhinakosiidil, mis on üks peamisi C. deserticola registreeritud toimeaineid [14], on osteoporoosivastane toime; 270 mg/kg annus oli aga nii suur, et piiras selle edasist kliinilist kasutamist [24]. Praegustes katsetes kasutati OVX rottidel fenüületanoidglükosiidi kogufraktsiooni väiksema annusega 60-240 mg/kg kehamassi kohta päevas ja tuvastatud koostisosade sisaldus oli selles fraktsioonis peaaegu 50 protsenti puhas, kasutades HPLC meetod.

Oli hästi teada, et OVX võib põhjustada osteoporoosi, ja OVX rotti peeti klassikaliseks ja sobivaks mudeliks inimese menopausijärgse osteoporoosi simuleerimiseks. Samal ajal täheldati pärast munasarjade eemaldamise operatsiooni olulist luu mineraalse tiheduse, trabekulaarse luu mikroarhitektuuri, emaka ja tupe märgkaalude ning östrogeeni taseme langust, samuti luu resorptsiooni ja kehakaalu ilmset paranemist, millest osa östrogeeni kadumisest [25]. Meie senised andmed on selgelt näidanud, et OVX kutsus esile menopausijärgse osteoporoosi ja sellega kaasneb alati luu kvaliteedi, luu mikroarhitektuuri ning emaka ja tupe märgkaalu järsk langus. Kuna EV on üldine hormoonasendusaine, mida on kasutatud kliinilises praktikas, kasutati seda positiivse kontrollina meie in vivo katses ning suurendati kehakaalu ja atroofiat emaka kaalu, samuti halvenenud luu mineraalset tihedust ja trabekulaarse luu mikroarhitektuuri. , olid EV lisamisega eeldatavasti vastupidised. Erinevalt positiivsest kontrollist ei mõjutanud CDP-ravi OVX-i mudelirühma rottide vähenenud tupe ja emaka kaalu, aga ka kogu kehamassi suurenemist, mis viitas sellele, et CDP võib suurendada luu moodustumist ilma kõrvaltoimeid esile kutsumata. kehal ja emaka orgaanilistes kudedes. Kuigi CDP-ravi reguleeris ERR-i taset oluliselt üles, oli see täpselt nagu fütoöstrogeeni toime, et emaka ja tupe orgaanilistele kudedele ei täheldatud kõrvaltoimeid. Lisaks tugevdas CDP ravi oluliselt OVX rottide luu kvaliteeti, mis oli munasarjade eemaldamise operatsiooni tõttu halvenenud.

Lisaks kasutati osteoporoosivastase toime kajastamiseks ka P ja Ca taset uriinis ja seerumis OVX rottidel ning Ca ja anorgaanilise P kontsentratsioonid sõltusid tavaliselt kaltsitoniini ja PTH tasemest [26]. Kuigi käesolevas uuringus ei täheldatud OVX mudelirühma rottide Ca, seerumi P, seerumi Ca ja PTH uriiniga eritumise taseme olulist langust ega suurenemist, oli P ja kaltsitoniini oluline tase uriinis (p < {="" {1}})="" täheldati.="" kooskõlas="" avaldatud="" andmetega,="" et="" munasarjade="" eemaldamise="" operatsioonist="" põhjustatud="" östrogeenipuudus="" põhjustas="" alati="" kaltsitoniini="" taseme="" langust="" veres,="" viis="" seerumi="" kaltsitoniini="" vähenemine="" lõpuks="" pth="" taseme="" tõusuni,="" kus="" ca="" peeti="" pth="" sekretsiooni="" peamiseks="" regulaatoriks.="" kuna="" pth="" kontsentratsioon="" ei="" näidanud="" käesolevas="" uuringus="" olulist="" erinevust="" ovx="" ja="" sham="" rühmade="" vahel,="" ei="" näidanud="" ca="" tase="" nii="" seerumis="" kui="" ka="" uriinis="" ilmseid="" muutusi="" kahe="" ülaltoodud="" rühma="" vahel.="" siiski="" saavutati="" kaltsitoniini="" taseme="" märkimisväärselt="" vähenenud="" tendents="" ovx="" ja="" sham="" rühmade="" vahel="" ning="" sellest="" tulenevalt="" vähenes="" p="" sisaldus="" ovx="" uriinis="" tugevalt.="" ususime,="" et="" ülaltoodud="" andmed="" võivad="" seletada="" vastuolulist="" nähtust,="" miks="" ovx="" rottide="" ca="" taseme="" eritumine="" uriiniga="" ei="" näidanud="" ilmset="" muutust="" võrreldes="" sham-rottidega="" ja="" see="" nähtus="" võib="" olla="" seotud="" ka="" luude="" ringluse="" kiirenemisega="" [27]="" .="" pärast="" ravi="" cdp-ga="" oli="" p="" ja="" ca="" tase="" seerumis="" märkimisväärselt="" ülesreguleeritud="" ning="" p="" sisaldus="" uriinis="" vähenes="" ovx="" rottidel,="" mis="" näitas,="" et="" cdp="" ei="" suutnud="" mitte="" ainult="" takistada="" luu="" mineraalelementide="" eritumist,="" vaid="" ka="" suurendada="" nende="" seerumisisaldust.="" elemendid,="" pärssides="" seega="" kaudselt="">

Lisaks kasutati CDP aluseks olevate osteoporoosivastaste mehhanismide selgitamiseks ka luu moodustumise ja resorptsiooni markereid, samuti antioksüdantseid ensüüme, sealhulgas SOD ja GSH. Sarnaselt avaldatud andmetega näitas ALP tase OVX-i mudelirühma rottidel statistiliselt mitteolulist tõusutrendi, mis näitab luude ainevahetuse kiirenemist menopausijärgse osteoporoosi korral [10]. Kuid pärast ravi CDP-ga (60, 120 ja 240 mg/kg/päevas) paranes ALP omadus oluliselt. Oli hästi teada, et OVX põhjustas östrogeenitaseme järsu languse, mis tavaliselt põhjustab ülemäärast luuresorptsiooni ja oksüdatiivset stressi [28], mida tõendavad TRAP, katepsiin K ja DPD ning MDA tasemed, mis on märkimisväärselt ülesreguleeritud rottidel. OVX mudeligrupp. Kuid CDP sekkumine parandas neid halvenemisi osaliselt. Lisaks näitas OVX rottide ravi CDP-ga (60 ja 240 mg/kg) GSH aktiivsuse olulist suurenemist (p < 0="" 05).="" ülaltoodud="" tulemused="" viitasid="" sellele,="" et="" cdp-l="" oli="" terapeutiline="" toime="" ovx-indutseeritud="" osteoporoosile="" ja="" need="" mõjud="" olid="" nii="" luu="" moodustumise="" suurendamise="" ja="" luu="" resorptsiooni="" pärssimise="" kui="" ka="" luu="" antioksüdantide="" süsteemi="" parandamise="">

RANK-i aktiveerimine selle ligandiga RANKL stimuleeris NFAT2 ja c-Fos ekspressiooni PI3K/AKT ja NF-κB signaaliülekande kaudu [29]. NF-κB osutus osteoklastogeneesi jaoks oluliseks, kuna NF-κB katkestamine võib põhjustada osteoporoosi fenotüübiga osteoklastide diferentseerumise halvenemist ning NF-κB reguleeris üles c-Fos ja vähendas NFAT2 ekspressiooni RANKL / RANK / TRAF-i indutseeritud osteoklastogeneesi ajal. Et hinnata CDP kasulikku mõju NFAT2 ja c-Fos-vahendatud osteoklastogeneesile, analüüsiti RANKL-i ja RANK-i ekspressioonitasemeid. Eeldatavasti inhibeeris CDP oluliselt NFAT2 ja stimuleeris c-Fos taset, vähendades RANKL-i ja RANK-i ekspressioone. Samal ajal puudus RANK-il endal sisemine kinaasi omadus, välja arvatud juhul, kui TRAF6 on sellega ühendatud, et käivitada allavoolu signaalimine [3]. CDP reguleeris ka TRAF6 ekspressiooni, mis viis RANKL-i ja RANK-i seondumiskoguste olulise vähenemiseni. CDP oletatav osteoporoosivastane mehhanism OVX rottidel kattis ülaltoodud signalisatsiooniteid ja regulaatoreid on kirjeldatud joonisel 9. Lühidalt öeldes alandas CDP TRAF6, RANKL ja RANK taset, pärssides seega allavoolu signalisatsiooniteid, sealhulgas PI3K/AKT ja NF-κB, mis RANKL / RANK käivitab ja lõpuks vähendas peamiste osteoklastogeensete valkude NFAT2 ja c-Fos ekspressiooni ja aktiivsust. Seetõttu viitasid mitmed vihjed andmetele CDP kasulikule mõjule OVX rottide luu metabolismile peamiselt RANKL/RANK/TRAF{25}}vahendatud PI3K/AKT ja NF-κB radade kaudu.

5. Järeldus

Kokkuvõttes avaldas C. deserticolast eraldatud fenüületanoidglükosiidide kogusumma OVX rottide menopausijärgsele osteoporoosile märkimisväärset kasulikku toimet ning luukoe hõrenemise pärssimise terapeutiline potentsiaal tulenes peamiselt luu moodustumise stimuleerimisest ja luu resorptsiooni pärssimisest ning luu antioksüdantide parandamisest. süsteem; mehhanismid võivad olla seotud RANKL/RANK/TRAF{0}}indutseeritud NF-κB aktivatsiooni ja PI3K/AKT inaktiveerimisega, samuti c-Fos stimulatsiooni ja NFAT2 supressiooniga ning lõpuks inhibeeriti osteoklastide diferentseerumine.

Lühendid

AKT: Proteiini kinaas B

ALP: leeliseline fosfataas

BGP: luu GLA valk

BMC: Luu mineraalide sisaldus

CDP: C. deserticola fenüületanoidglükosiidi fraktsioon

CK: Katepsiin K

CT: kaltsitoniin

DPD: desoksüpüridinoliin

ERR : Östrogeeniga seotud retseptor alfa

EV: Östradioolvaleraat

GSH: Glutatioon l-PTH: puutumatu parathormoon

MCSF: makrofaagide kolooniaid stimuleeriv tegur

MDA: Malondialdehüüd

NFAT2: aktiveeritud T-rakkude tuumafaktor c2

NF-κB: tuumafaktor-kappa B

OPG: Osteoprotegeriin

OVX: munasarjade eemaldamine

PhG-d: fenüületanoidglükosiidid

PI3K: fosfoinositiidi 3-kinaas

RANK: tuumafaktori-kappa B retseptori aktivaator

RANKL: tuumafaktor-kappa retseptori aktivaator

B ligandi ROI: huvipakkuv piirkond

SOD: superoksiidi dismutaas

Tb. N: Trabekulaarne number

Tb.Sp: Trabekulaarne eraldamine

Tb.Th: Trabekulaarne paksus

TCM: traditsiooniline hiina meditsiin

TMC: koe mineraalide sisaldus

TMD: koe mineraalne tihedus

TNF: kasvaja nekroosi faktor

TRAF6: kasvaja nekroosifaktori retseptoriga seotud faktor 6

TRAP: Tartraadiresistentne happeline fosfataas.

Andmete kättesaadavus

Selle uuringu tulemuste toetuseks kasutatud andmed on nõudmisel saadaval vastavalt autorilt.

Huvide konfliktid

Autoritel ei olnud huvide konflikti.

Autorite kaastööd

XM kavandas katseid ja juhendas neid; SD ja LY viisid läbi enamiku katsetest ja koostasid käsikirja; BZ ja JL viisid läbi Western blot analüüsi ja osalesid loomkatsetes; YD analüüsis andmeid; QT ja PY muutsid käsikirja. Kõik autorid vaatasid käsikirja üle. Lingling Yang ja Shuqin Ding andsid käsikirjale võrdse panuse.

Tänuavaldused

Seda tööd toetasid Ningxia kõrghariduse teadustehnoloogia sihtasutuse (NGY2017090), Hiina riikliku loodusteaduste sihtasutuse (nr 81560684), Ningxia võtmeuuringute ja arendusprogrammi (2018BHF2001), Ningxia võtmeuuringute ja Ida ja lääne teadus- ja tehnoloogiakoostöö leiutamisprogramm (nr 2017BY084 ja 2017BY079) ning Hiina Teaduste Akadeemia West Light Foundation – Lääne noored teadlased 2017.

Viited

[1] LJ Melton III, EA Christchilles, C. Cooper, AW Lane ja BL Riggs, "Perspective. Kui paljudel naistel on osteoporoos?", Journal of Bone and Mineral Research, vol. 7, nr. 9, lk 1005–1010, 1992.

[2] S. Schnell, SM Friedman, DA Mendelson, KW Bingham ja SL Kates, "Pisaluumurdude programmis eakate inimeste 1-aastane suremus", Geriatric Orthopedic Surgery & Rehabilitation, kd. 1, ei. 1, lk 6–14, 2010.

[3] EM Tan, L. Li, IR Indran, N. Chew ja EL Yong, "TRAF6 vahendab osteoklastogeneesi supressiooni ja ovariektoomiast põhjustatud luukadu vältimist uudse prenüülflavonoidiga", Journal of Bone and Mineral Research, vol. 32, nr. 4, lk 846–860, 2017.

[4] JH Kim ja N. Kim, "NFATc1 reguleerimine osteoklastide diferentseerumises", Journal of Bone Metabolism, vol. 21, nr. 4, lk 233–241, 2014.

[5] Q. Ye, XQ Ma, CL Hu et al., "Antiosteoporotic activity and constituents of Podocarpium podocarpus", Phytomedicine, vol. 22, nr. 1, lk 94–102, 2015.

[6] SA Jang, HS Song, JE Kwon et al., "Protocatechuic acid attenuates trabecular bone loss in ovariectomized hiir", Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 2018, artikli ID 7280342, 11 lehekülge, 2018.

[7] AB Abdel-Naim, AA Alghamdi, MM Algandaby et al., "Chrozophora tinctoriast eraldatud rutiin suurendab luurakkude proliferatsiooni ja luustumise markereid", Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 2018, artikli ID 5106469, 10 lk, 2018.

[8] J. Wattanathorn, C. Thipkaew, W. Thukham-mee, S. Muchimapura, P. Wannanon ja T. Tong-un, "Morindacitrifolia L. lehtede ekstrakt kaitseb in vivo eksperimentaalses mudelis ajuisheemia ja osteoporoosi eest menopausi, "Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 2018, artikli ID 1039364, 13 lehekülge, 2018.

[9] S. Sungkamanee, J. Wattanathorn, S. Muchimapura ja W. Thukham-mee, "Morus alba ja Polygonum odoratum'i kombineeritud ekstrakti antiosteoporootiline toime", Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 2014, artikli ID 579305, 9 lk, 2014.

[10] J. Liu, Z. Zhang, Q. Guo, Y. Dong, Q. Zhao ja X. Ma: "Syringin takistab luude hõrenemist munasarjade eemaldatud hiirtel TRAF6 vahendatud NF-KB inhibeerimise ja PI3K/AKT stimuleerimise kaudu "Phytomedicine, vol. 42, lk 43–50, 2018.

[11] CW Lu, SK Huang, TY Lin ja SJ Wang, "Echinacoside, Herba Cistanche aktiivne koostisosa, pärsib epileptiformset aktiivsust hipokampuse CA3 püramiidsetes neuronites", The Korean Journal of Physiology & Pharmacology, vol. 22, nr. 3, lk 249–255, 2018.

[12] X. Xu, Z. Zhang, W. Wang, H. Yao ja X. Ma, "Therapeutic effect of cistanoside A on bone metabolism of ovariectomized hiir", Molecules, vol. 22, nr. 2, lk. 197, 2017.

[13] K. Alipieva, L. Korkina, IE Orhan ja MI Georgiev, "Verbascoside – a review of its performance, (bio)synthesis and pharmacological significance", Biotechnology Advances, vol. 32, nr. 6, lk 1065–1076, 2014.

[14] Hiina farmakopöa toimetuskomitee, Hiina Rahvavabariigi farmakopöa, Hiina Medical Science and Technology Press, Peking, Hiina, 10. väljaanne, 2015.

[15] H. Zhang, WW Xing, YS Li jt, "Effects of a Traditsioonilise Hiina taimse preparaadi mõju osteoblastidele ja osteoklastidele", Maturitas, vol. 61, nr. 4, lk 334–339, 2008.

[16] X. Ma, J. Liu, L. Yang, B. Zhang, Y. Dong ja Q. Zhao: "Cynomorium songaricum takistab luu resorptsiooni ovariektoomiaga rottidel RANKL/RANK/TRAF6 vahendatud PI3K/AKT ja NF-κB rajad," Life Sciences, vol. 209, lk 140–148, 2018.

[17] XQ Ma, T. Han, X. Zhang jt, "Kaempferitrin takistab luukadu ovariektoomiaga rottidel", Phytomedicine, vol. 22, nr. 13, lk 1159–1162, 2015.

[18] PL Liao, CH Li, LS Tse, JJ Kang ja YW Cheng, "Cistanche tubulosa tervisetoidu toote Memoregain® ohutuse hindamine: genotoksilisuse ja 28-päevase korduvdoosi toksilisuse test", Food and Chemical Toxicology , vol. 118, lk 581–588, 2018.

[19] CC Wong, HB Li, KW Cheng ja F. Chen, "30 Hiina ravimtaime süstemaatiline uuring antioksüdantse aktiivsuse kohta, kasutades rauda redutseeriva antioksüdantide võimsuse analüüsi", Food Chemistry, vol. 97, nr. 4, lk 705–711, 2006.

[20] D. Song, Z. Cao, Z. Liu jt, "Cistanche deserticola polüsahhariid nõrgendab osteoklastogeneesi ja luu resorptsiooni, inhibeerides RANKL-i signaaliülekannet ja reaktiivsete hapnikuliikide tootmist", Journal of Cellular Physiology, vol. 233, nr. 12, lk 9674–9684, 2018.

[21] HD Liang, F. Yu, ZH Tong, HQ Zhang ja W. Liang, "Cistanches Herba vesiekstrakt, mis mõjutab seerumi BGP-d ja TRAP-i ning luuüdi Smad1 mRNA, Smad5 mRNA, TGF- 1 mRNA ja TIEG1 mRNA ekspressioonitasemed osteoporoosi haiguses," Molecular Biology Reports, vol. 40, nr. 2, lk 757–763, 2013.

[22] TM Li, HC Huang, CM Su et al., "Cistanche deserticola ekstrakt suurendab luu moodustumist osteoblastides", Journal of Pharmacy and Pharmacology, vol. 64, nr. 6, lk 897–907, 2012.

[23] H. Liang, F. Yu, Z. Tong ja Z. Huang, "Cistanches Herba vesiekstrakti mõju luukadudele ovariektoomiaga rottidel", International Journal of Molecular Sciences, vol. 12, nr. 8, lk 5060–5069, 2011.

[24] F. Li, X. Yang, Y. Yang jt, "Antiosteoporotic activity of echinacoside in ovariectomized rots", Phytomedicine, vol. 20, nr. 6, lk 549–557, 2013.

[25] H. Nian, MH Ma, SS Nian ja LL Xu, "Antiosteoporotic activity of Icariin in ovariectomized rots", Phytomedicine, vol. 16, nr. 4, lk 320–326, 2009.

[26] SR Fahmy, AM Soliman, AA Sayed ja M. Marzouk, "Cicer arietinum ekstrakti võimalik osteoporoosivastane mehhanism ovariektoomiaga rottidel", International Journal of Clinical and Experimental Pathology, vol. 8, nr. 4, lk 3477–3490, 2015.

[27] R. Swaminathan, "Biochemical markers of bone turnover", Clinica Chimica Acta, vol. 313, nr. 1-2, lk 95–105, 2001.

[28] S. Muthusamy, I. Ramachandran, B. Muthusamy jt, "Ovariektoomia kutsub esile oksüdatiivse stressi ja kahjustab luude antioksüdantide süsteemi täiskasvanud rottidel", Clinica Chimica Acta, vol. 360, nr. 1-2, lk 81–86, 2005.

[29] WJ Boyle, WS Simonet ja DL Lacey, "Osteoclast differentiation and activation", Nature, vol. 423, nr. 6937, lk 337–342, 2003.