Arüülsüsivesinike retseptorist sõltuvad ja sõltumatud rajad vahendavad kurkumiini vananemisvastast toimet 2. osa
Jun 29, 2022
Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni
2.2.6. Inimese esmase EC kasvatamine
Inimese primaarne EC (Lonza, Köln, Saksamaa) kultiveeriti täielikus endoteeli basaalsöötmes (EBM) (Lonza, Köln, Saksamaa), millele oli lisatud 1 ug/ml hüdrokortisooni, 12 ug/ml veise ajuekstrakti, 5{7}} ug/ ml gentamütsiini, 10 ng/ml inimese epidermise kasvufaktorit ja 10 protsenti (o/v) vasikaloote seerumit 37 kraadi juures ja 5 protsenti CO kuni kolmanda passaažini. Pärast eraldamist 0,05% (o/o) trüpsiini/EDTA-ga (Thermo Scientific, Schwerte, Saksamaa) kultiveeriti rakke 6 cm kultiveerimisnõudes või 6 süvendiga kultuuriplaatidel vähemalt 18 tundi enne transfektsiooni või töötlemist.
Lisateabe saamiseks klõpsake siin
2.2.7. EÜ mööduv transfektsioon
Rakud transfekteeriti, nagu eelnevalt kirjeldatud [65]. Lühidalt öeldes transfekteeriti EC, kasutades SuperFectTransfection Reagenti (Qiagen, Hilden, Saksamaa) vastavalt tootja juhistele. AhR üleekspressioon või kukkumine saavutati vastavalt 24 või 48 tunni pärast. Transfektsiooni efektiivsus üleekspressiooni korral oli ligikaudu 40 protsenti.
2.2.8. EC kriimustushaava analüüs
EC rändevõime uurimiseks viidi läbi kriimustushaavade testid, nagu eelnevalt kirjeldatud [66]. Üksikasjalikult paigutati haavad raku kaabitsaga rakkude monokihti mööda jälgimisjoont. Pärast vigastust eemaldati mittekinnitatud rakud õrna pesemisega.cistanche salsa ekstraktKurkumiinravi viidi läbi vahetult pärast haava kinnitamist. Kuriköömen lahustati DMSO-s ja kasutati lõppkontsentratsioonis 7,5 uM. EC migratsiooni kvantifitseerimiseks värviti rakke 5 ug/ml 4′,6-diamidino-2- fenüülindooliga (DAPI) (Carl Roth, Karlsruhe, Saksamaa) PBS-is 5 minutit pärast rakkude fikseerimist. 4% (maht/maht) paraformaldehüüdiga 15 minutit toatemperatuuril. Pildid tehti Zeiss AxioVision Observer D1 fluorestsentsmikroskoobiga (Carl Zeiss, Oberkochen, Saksamaa)), kasutades 200-suurendust. Jäljejoonelt haava migreerunud rakud loendati automaatselt, kasutades Image]1.52a ]67I osakeste analüüsi funktsiooni pärast kattuvate tuumade eraldamist.
Cistanche on vananemisvastane toime
2.2.9. EC immuunvärvimine
EC fikseeriti 4% (o/v) paraformaldehüüdiga 15 minutit toatemperatuuril. Pärast permeabiliseerimist ja blokeerimist 0,3 protsenti (o/o)Triton-X 100 ja 3 protsenti (o/u)normaalses kitse seerumis PBS-is inkubeeriti rakke AhR-vastase küüliku antikehaga (1:100, Abcam, Cambridge, Ühendkuningriik) või Nrf2 (kloon D1Z9C, 1:100, Cell Signaling Technology, Frankfurt, Saksamaa), mis on lahjendatud 1% (o/v) normaalse kitse seerumiga PBS-is üleöö temperatuuril 4 °C. Seejärel pesti rakke PBS ja inkubeeriti Alexa 594-seotud kitse küülikuvastase IgG-ga (1:500, Invitrogen, Darmstadt, Saksamaa) 1 tund toatemperatuuril.cistanche varsAktiini värvimiseks inkubeeriti rakke Alexa FluorTM 488 Phalloidiniga (1:7 0, Invitrogen, Darmstadt, Saksamaa) 20 minutit toatemperatuuril. Tuumad värviti toatemperatuuril 0,5 ug/ml DAPI-ga PBS-s 5 minutit ja rakud paigaldati ProLong'MDiamond Antifade Mountant'iga (Invitrogen, Darmstadt, Saksamaa). Fluorestseeruvad pildid tehti Zeiss AxioVision Observer D1 fluorestsentsmikroskoobiga 400 × või 200 × suurendusega.
2.2.10. qPCR rakkudes
Kogu raku RNA eraldati, kombineerides lüüsi TRIzolTM-is ja allavoolu töötlemisega, kasutades RNeasy Mini Kit (Qiagen (Hilden, Saksamaa)) vastavalt tootja juhistele. cDNA süntees viidi läbi QuantiTect9 pöördtranskriptsioonikomplekti (Qiagen (Hilden, Saksamaa)) abil 1 ug RNA-ga vastavalt tootja juhistele. Suhtelised transkriptsioonitasemed määrati PCR abil, kasutades 2x SYBR③ Green qPCR Master Mix ja Rotor-Gene Q termotsüklerit (Qiagen (Hilden, Saksamaa)). Ribosomaalse valgu L32 (rpl32) transkripti kasutati võrdlusena ja suhteline ekspressioon arvutati AC meetodil [68]. Kasutati järgmisi introni ulatuvaid praimeripaare:peatäht (geeni registreerimisnumber NM_000499.5):5'-TCGCTACCTACCTACCCAACCCTT-3',5'-TGTGTCAAACCCAGCTCCAA-3';ahr(geen registreerimisnumber NM_001621.5):5'-CGTGGGTCAGATGCAGTACA-3',5'ACCAGGGT-CAAAATTGGGCT3';sod2(geeni registreerimisnumber NM_000636.4):5'-GCCCTGGAACCTCAC ATCAA -3';5'-AGCAACTCCCCTTTGGGTTC-3';rpl32(geeni registreerimisnumber NM_000994.4):5'-GTGAAGCCCAAGATCGTCAA-3',5'-TTGTTGCACATCAGCAGCAC{{ 41}}”.
2.3.Hiired
2.3.1.Hiireliinid ja aretus
Naine 8-12-nädalane ("noor") ja 18-kuine ("vana") AHR-i puudulikkusega B6.129-AHRtmlBra/J (Schmidt et al., 1996; viidatud siia kui AHR-KO) hiiri kasvatati IUF-i loomakasvatusasutuses heterosügootidena. Kontrolliks kasutati metsikut tüüpi pesakonnakaaslasi. Hiiri kasvatati ja hoiti spetsiifilistes patogeenivabades tingimustes 12/12-tunnise hele-pimeduse tsükliga ning neile anti standardset sööki (ssniff"MZ, SSNIFF, Soest, Saksamaa) ad libitum. 2.3.2.qPCR hiirtel
Kogu RNA eraldati kolme WT ja kolme AHR puudulikkusega hiire elundi kudedest TriZol [. Seejärel pöördtranskribeeriti 400 ng RNA-d, kasutades pöördtranskriptaasi M-MLV (Promega, Madison, WI, USA) ja juhuslikke heksameeri praimereid. Geeniekspressioonitasemeid mõõdeti iga hiire koe puhul kahes eksemplaris Rotor-Gene Q (Qiagen, Hilden, Saksamaa) 15 μl lõppmahus, mis sisaldas 7,5 μL Rotor Gene SybrGreenTM (Biorad, Feldkirchen, Saksamaa), 1 uM iga praimerit. ,1,5 μL cDNA ja RNaasi vaba vett. Praimeri efektiivsus oli vahemikus 90 protsenti kuni 146 protsenti. Praimeri järjestuste ja efektiivsuse kohta vaata tabelit S2. Ekspressioonitasemed kalibreeriti RPS6 ekspressiooni järgi majapidamisgeenina samas proovis, kasutades {{ 14}}KT-meetod [69].
2.4. In Silico analüüsid
CeAhR LBD homoloogia modelleerimine
C. elegans AhR LBD (jäägid 267-372) struktuurimudel loodi homoloogia modelleerimisega. Mallidena kasutati homoloogsete bHLH-PAS perekonnaliikmete PASB domeenide röntgenstruktuure, millel on CeAhR PASB-ga kõrgeim järjestuse identsus (umbes 20 protsenti): ööpäevased lokomotoorsed väljundtsüklid kaput (CLOCK, PDB: 4F3L), neuronaalne PAS-domeeni sisaldav valk 3 (NPAS3, PDB: 5SY7), hüpoksiaga indutseeritavad tegurid 20 (HIF2o, PDB: 3H82, 4ZP4, 3F1N) ja lo (HIFlo, PDB: 4H6J). Mudel saadi rakendusega MODELLER[70-72].cistanche tubulosa eelised ja kõrvaltoimedOptimaalne mudel valiti 10 loodud mudeli hulgast parima DOPE SCORE'i alusel [73]. Mudelite kvaliteeti hinnati PROCHECKi [74] abil. Sekundaarsed struktuurid omistas DSSPcont [75]. Modelleeritud LBD-de sidumisõõnsust iseloomustati CASTp-serveri abil[76]. Mudelite visualiseerimine viidi läbi PYMOL-i[77] abil.
2.5.Statistiline analüüs
Kui pole öeldud teisiti, viidi statistilised analüüsid läbi GraphPad Prismis (versioon 6.01) (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA). Elu/tervise kestuse analüüside jaoks tehti statistiline analüüs OASIS-e[53] abil. Mikrokiibi andmete statistiline analüüs viidi läbi R-s (R Foundation (Viin, Austria)). Boxplotid loodi programmis GraphPad Prism (versioon 6.01) (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA) ja need näitavad mediaani (joont), 25-75-ndat protsentiili (kast) ja 10-90-ndat protsentiili (vurrud).
3. Tulemused
3.1. Kurkumiin parandab tervist AhR-st sõltuval ja sõltumatul viisil
Ahr{0}} kadumine pikendab C.elegansi tervist ja eluiga põhitingimustes[14] ning mõjutab negatiivselt vanusega seotud tunnuseid vastusena imetajate AhR modulaatoritele, nagu benso[a]püreen (BaP), UVB valgus ja mikrobiota [25]. Toidu polüfenoolid, nagu kurkköömen, moodustavad imetajate AhR-i modulaatorite olulise rühma, millel on C. elegans'i eluiga pikendav toime [78,79] ja seega uurisime kurkumiini eluiga pikendavat toimet selle ahr-i jaoks.{10}} sõltuvus. Kurkumiin pikendas reprodutseeritavalt ja oluliselt pikendas C. elegansi elu- ja terviseiga ahr{12}}sõltuval viisil (joonis 1A, B). Varem oleme näidanud, et ahr{14}} kadumine pikendab eluiga ka Huntingtoni tõve ja Parkinsoni tõve mudelite puhul, kusjuures agregatsioonile kalduva polüglutamiini (polüQ40) ja -sünukleiini ( -syn) üleekspressioon toimub lihastes. suurendades samal ajal nende valguagregaatide sisaldust [25]. Huvitaval kombel suurendas kurkumiinravi polüQ40 ja -syn agregaatide arvu samal määral kui ahr{23}} funktsiooni kadu (joonis 1C). Kurkumiin soodustas ka nende haigusmudelite eluiga ja liikumisvõimet (joonis 1DE), kuid ahr-1 kadumise ja kurkumiini lisamise mõjud olid PolyQbackgroundis (joonis 1D) aditiivsed, paljastades AHR-1-sõltumatud kaitsefunktsioonid. kurkumiini vähemalt sellel ohustatud taustal.
Joonis 1. Kurkumiin edendab tervist AHR{1}}sõltuval ja sõltumatul viisil. DMSO-ga või kurkumiiniga töödeldud wt- ja ahr{5}} nematoodide eluea (A) ja tervisliku seisundi (B) kõverad. Elulemuskõverad näitavad 5 katse koondandmeid 290-300 usside kohta seisundi kohta. Statistiline test: log-rank test, # olulisus vs. DMSO,*olulisus vs.wt, Bonferronipi väärtus<0.05.(c) quantification="" of="" aggregates="" in="" 10-day-old="" polyq;wt="" and="" poly="" air-1="" (left="" panel)="" or="" 7-day-old="" async;wt="" and="" an;ahr-1="" (right="" panel).="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 59-111="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05><0.05 vs.dmso.(d,e)life/health="" span="" of="" polyq;wt="" and="" polyq;ahr-1.survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 180="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,significance="" vs.="" dmso,="" *="" significance="" vs.="" wt,="" bonferroni="" p-value=""><>
3.2.ugt-45 vahendab kurkumiini ja ahr{4}} ammendumise vananemisvastast toimet
Kurkumiini võimalike allavoolu ahr{0}}sõltuvate mõjurite otsimiseks kasutasime sihipäraseid ja erapooletuid lähenemisviise. Uurisime klassikaliste imetajate AhR sihtgeenide ekspressiooni ja keskendusime Cyp geenidele, kuna kurkumiin muudab CyplA1 ja CyplB1 ekspressiooni imetajarakkudes [80, 81]. 47 erineva tsüpsi kvantifitseerimine C.elegans'is poolkvantitatiivse reaalajas PCR-i (qPCR) abil näitas aga, et ainult cyp{8}}B1 oli märkimisväärselt ülesreguleeritud kas ahr-1 vähenemise või kurkumiini toimel. ahr-1-sõltuval viisil (joonis S1A-B), samas kui ülejäänud kolm tsüsti (st cyp-13A5, cyp-13A8 ja cyp-42A1) olid suurendas kurkumiin ainult ahr{21}} puudumisel (joonis S1). Need andmed koos teiste töödega [25, 82] viitavad sellele, et tsüpid ei ole tõenäoliselt CeAhR peamised sihtmärgid. Seda toetab ka meie metsiktüüpi ja ahr-1 mutantide transkriptoomiline analüüs. Tõepoolest, kooskõlas AHR-1 rolliga neuronite määramisel [37,38,40,41], näitasid geeniekspressiooni muutused metsikut tüüpi ja ahr-1 mutantide vahel neuronite arenguga seotud protsesside rikastumist. ja diferentseerumine ning suurte muutuste puudumine klassikalistes detoksifitseerimisgeenides (joonis 2A). Mõnede ahr-1(jul45) ja metsiktüüpi (atf{40}} enim üles- ja allareguleeritud geenide qPCR analüüs , K04H4.2, egl-46, T20F5.4, ptr-4, dyf-7,clec-209, C01B4.6, C01B4.7, F56A4.3)enamasti kinnitasid nende ahr{60}}sõltuvust põhitingimustes (joonis 2B), kuid ei UVB [25] ega kurkumiin (joonis 2C) ei mõjutanud oluliselt nende geenide ekspressiooni. Mõtlesime, kas ekspressioonimuutused nendes geenides on evolutsiooniliselt konserveerunud, ja hindasime nende ekspressiooni erinevates kudedes (st ajus, maksas, soolestikus ja veres) 8- ja 18-kuuse metsiktüüpi ja AhR KO hiired. Mõned geenid näitasid noortel (atf-2 homoloog) või vanadel (lpr-4/5 homoloogid) hiirtel koespetsiifilist kalduvust ekspressiooni suurenemisele, kuid ei ilmnenud ilmset mustrit ega konserveerunud muutusi. täheldatud (joonis S2). Need tulemused peegeldavad võimalikke liigispetsiifilisi erinevusi või koest sõltuvat AhR-i transkriptsioonilist aktiivsust imetajatel, mis jäävad C. elegansi kogu looma transkriptoomilise analüüsi käigus tähelepanuta. C. elegans'i metsiktüüpi ja ahr{77}}(jul45) kõige erinevamalt ekspresseeritud geenide põhjalik uurimine näitas, et paljude nende geenide ekspressioon on C.elegans'is vananemise ajal mõjutatud ja imetajate AhR modulaatorid toidust ( nt kvertsetiin ja resveratrool)[25], mis viitab AHR-1 rollile polüfenooliga moduleeritud geeniekspressioonis. Selle stsenaariumi kohaselt näitasid mikrokiibi andmed, et enamik kurkumiinravi korral erinevalt ekspresseeritud geene reguleeriti tõepoolest ahr{82}}sõltuval viisil (joonis 2D; tabel 1).cistanche tubulosa ekstrakt47-st metsiktüüpi kurkumiini poolt muudetud geenist (43 üles- ja 4 allareguleeritud) indutseeris ainult 5 kurkumiini poolt ka ahr{7}}(ju145). Kurkumiini poolt AHR-1-sõltuval viisil reguleeritud geenide hulgas olid II faasi ensüümid ja huvitaval kombel reguleeris mõnda neist (ugt-9 ja ugt-29) samas suunas kurkumiin orby kaotus ahr-1 (tabel 1). Seega kontrollisime nende ja täiendavate ugt-de (ugt-45 ja ugt-57) väljendust, mida väljendati erinevalt, kui rakendati vähem piiravat statistilist analüüsi, mida mitme võrdluse jaoks ei korrigeeritud. Uuritud geenidest suurenes ugt{16}} ahr-1(ijul45) ja kurkumiinravi tõttu (joonis 3A, B). Samuti täheldasime muutusi mõnede võõrutusgeenide ekspressioonis metsiktüüpi ja AhR KO hiired koest sõltuval viisil. Nende geenide diferentsiaalne ekspressioon oli kõrgeim ajus, kus Ugt2a3 (ugt-9 ja ugt-29 C.elegansis) oli madalam ja Hpgds (gst-4 C. elegansis) oli ülesreguleeritud (joonis S3A). Hiirte maksaproovides ei muutunud ühegi testitud geeni ekspressioon (joonis S3B). Kooskõlas C,elegansi andmetega näitas ugt-45 hiire homoloog Ugt3a2 kalduvust üleekspressioonile Ahr KO hiirte sooled (joonis S3C). Eelkõige takistas ugt-45 RNAi kurkumiini (joonis 3C, D) või ahr-1 ammendumise (joonis 3E, F) soodustatud kasulikku mõju elule ja tervisele, mis näitab, et need kaks sekkumist võivad sõltuda ühiselt moduleeritud allavoolu signaalimist, et kutsuda esile nende vananemisvastane toime.
Joonis 2. Kurkumiini poolt erinevalt reguleeritud geene reguleeritakse peamiselt ahr-1-sõltuval viisil.(A)Geeni ontoloogia(GO)rikastamine bioloogiliste protsesside jaoks pärast GO-termini sulandumist ahr-1 vs. wt. (B, C)Tugevamate alla- ja ülesreguleeritud geenide ekspressiooni wt ja ahr{5}} [25] vahel hinnati qPCR-ga wt vs.ahr-1(B) ja DMSO-vs. . kurkumiiniga töödeldud nematoodid (C). Kastplokid näitavad 3 katse andmeid. Ekspressioon on näidatud DMSO-ga töödeldud wt suhtes (katkendjoon). Statistiline test:1-viis ANOVA Tukey mitme võrdluse testiga,*p-väärtus<0.05 vs.wt.="" (d)venn="" diagram="" of="" differentially="" expressed="" genes="" on="" the="" microarray.="" the="" number="" of="" genes="" that="" were="" differentially="" up-or="" down-regulated="" between="" the="" indicated="" conditions="" is="" shown="" in="" red="" and="" blue,="" respectively.="" the="" numbers="" in="" the="" interchanges="" refer="" to="" the="" genes="" that="" occurred="" in="" both="" comparisons.="" the="" values="" in="" the="" lower="" right="" corner="" show="" the="" number="" of="" genes="" on="" the="" array="" that="" were="" not="" differentially="">
Joonis 3.ugt-45 on vajalik kurkumiini ja ahr-1 mutantide eluea pikendamiseks. (A, B)Geeni ekspressiooni hinnati qPCR abil wt vs.ahr-1(A) ja DMSO- vs kurkumiiniga töödeldud wt nematoodidel (B). Kastplokid näitavad 3 katse andmeid. Ekspressioon on näidatud DMSO-ga töödeldud wt suhtes (tähistatud katkendjoonega). Statistiline test: 2-Way ANOVA Sidaki mitme võrdluse testiga, *p-väärtus<0.05vs.wt,><0.05 vs.="" dmso.="" (c,d)effect="" of="" ugt-45="" rnai="" on="" the="" curcumin-mediated="" life/health="" span="" extension="" in="" the="" wt.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" "significance="" vs.="" dmso,*="" significance="" vs.control="" rnai,="" bonferroni=""><0.05.(e,f)effect of="" ugt-45="" rnai="" on="" ahr-1-mediated="" life/healthspan="" extension.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,#="" significance="" vs.="" wt,*="" significance="" vs.="" control="" rnai,="" bonferroni=""><>
3.3. AHR-1 ja kurkumiin kaitsevad sõltumatult oksüdatiivse stressi eest
Polüfenoolide kasulikke omadusi seostatakse sageli nende kaitsevõimega reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) eest|83,84]. Kuna AhR osaleb oksüdatiivse stressi vahendatud protsessides [85-87], mõtlesime, kas kurkumiin võib AhR-ga reguleeritud antioksüdantsete reaktsioonide kaudu mõjutada loomade füsioloogiat. Täheldasime, et ahr-1 mutandid toodavad rohkem mitokondriaalset (mt)ROS-i ja neil on vähenenud mitokondriaalse membraani potentsiaal (joonis 4A, B), mis on kaks parameetrit, mis korreleeruvad pikaealisusega [88, 89]. Kuigi kooskõlas mitohormeesi paradigmaga ahr{10}}(jul45) toodavad veidi rohkem mtROS-i ja elavad kauem, olid need loomad oksüdatiivse stressi suhtes tundlikumad kui metsik tüüp. Täpsemalt, juglooni ja H2O2 põhjustatud kahjulikud mõjud hüppavatele loomadele, liikuvusele ja ellujäämisele olid ahr{14}} (jul 45) metsiktüübiga võrreldes oluliselt tugevamad (joonis 4C–F). Need andmed viitavad sellele, et AHR-1 ammendumisel on põhitingimustes kasulik motoorika, samas kui selle olemasolu on vajalik oksüdatiivse stressi eest kaitsmiseks, lahutades seega kaks sageli korreleerivat vanusega seotud parameetrit, nimelt eluea ja stressiresistentsuse. Selle asemel parandas kurkumiin oluliselt H, O ja juglooni resistentsust nii metsiktüüpi kui ka ahr -1 mutantidel (joonis 4E, F), mis viitab sellele, et kurkumiin kutsub esile ahr-1-sõltumatu antioksüdantse vastuse. Kooskõlas eluea ja oksüdatiivse stressiresistentsuse mitteseotud regulatsiooniga ei mõjutanud ugt-45 vaigistamine ei ahr-1 mutantide ega kurkumiiniga töödeldud loomade tundlikkust oksüdatiivse stressi suhtes (joonis 4G).cistanche tubulosa ülevaatedSeega on kurkumiinil ahr-1 ja ugt-45 kaudu pikaealisust pikendav toime, kuid see kaitseb ahr-1-sõltumatute mehhanismide kaudu oksüdatiivse stressi eest.
3.4. Nrf2/SKN-1 vahendab kurkumiini AhR-st sõltumatut toimet
AhR-kurkumiini läbirääkimiste edasiseks hindamiseks täiendavates vanusega seotud tunnustes mõõdeti rändevõimet inimese primaarses EC-s, mis on veresoonte funktsionaalsuse tunnus, mis vanusega väheneb [90] ja väheneb AhR-i aktiveerimise tõttu [14]. Kooskõlas ahr{5}} supressiooni ja kurkumiini vananemisvastase toimega pärssis AhR üleekspressioon märkimisväärselt, samas kui kurkumiin suurendas inimese primaarse EC migratsioonivõimet (joonis 5A). Pange tähele, et kurkumiini migratsioonivõime esilekutsumine oli võrreldav tühjade vektoriga või AhR ekspressioonivektoriga transfekteeritud rakkudes (joonis 5A). Kurkumiiniga töödeldud rakkude migratsiooni vähendas aga oluliselt AhR üleekspressioon: kurkumiin indutseerib tühjades vektoriga transfekteeritud rakkudes kuni 60 migreerunud rakku suure võimsusega välja kohta, samas kui AhR üleekspresseerivates rakkudes ainult kuni 25 rakku suure võimsusega välja kohta (joonis 5A). Need andmed viitavad sellele, et kurkumiini migratsiooni soodustavat toimet moduleerivad AhR-st sõltumatud mehhanismid, kuid võib-olla ka AhR aktiivsuse vähenemine. Järgmisena määrasime intratsellulaarse AhR jaotuse ja cVplal ekspressiooni kurkumiiniga töödeldud inimese EC-s, kurkumiin ei mõjutanud AhR-tuuma translokatsiooni (joonis 5B) ega tsüplalist ekspressiooni (joonis 5C). Otsides radasid, mida kurkumiin moduleerib AhR-st sõltumatul viisil, pöördusime tagasi nematoodide transkriptoomiliste profiilide juurde, et leida transkriptsioonifaktorid, mis reguleerivad geene, mida oluliselt moduleerib ahr-1 kadu või metsiktüüpi loomadel ravi kurkumiiniga (tabel 1). ). See in silico otsing tuvastas redoks-transkriptsioonifaktori SKN-1, inimese Nrf2 ortoloogi (tuumafaktori erütroidi 2-seotud faktor 2), mille aktiveerimist kurkumiini poolt [91] peetakse sageli võimalikuks vahendajaks selle antioksüdantne toime [92,93]. Seega on prototüüp C.elegans Nrf2/SKN-1-sõltuv geen gst-4 alhr-1 mutandis üleekspresseeritud [25] ja indutseeritud kurkumiiniga metsiktüüpi ja veelgi enam ahr-1 mutantides (joonis 5D). Lisaks suurendas kurkumiin Nrf2 stabiliseerumist ja tuuma translokatsiooni inimese primaarses EC-s (joonis 5E) ning indutseeris mangaani superoksiidi dismutaasi (Sod2) - klassikalise Nrf2 sihtgeeni - ekspressiooni tühja vektoriga transfekteeritud rakkudes või rakkudes, milles AhR vaigistab shRNA (joonis 5F). Sod2 indutseerimise puudumine AhR shRNA poolt EC-s võib olla tingitud ekspressiooni osalisest (50 protsenti) vähenemisest (joonis S3D), mis ei pruugi olla piisav Nrf2 või täiendava transkriptsioonifaktori (TF) aktiveerimiseks. , C.elegansis, võib nõustuda gst-4 [94]indutseerimisega pärast AhR täielikku ammendumist. Huvitav on see, et Hpgds, mis on C.elegans gst-4 homoloog, suurenes oluliselt AhR KO hiirte ajus (joonis S3A), kuid see ei ole Nrf2 sihtmärk. Täiendavad tõendid võimaliku Nrf2/SKN-1 sõltumatu signaaliülekande kohta, mille aktiveerib ahr-1 ammendumine, on see, et naha-7 RNAi pärsib täielikult kurkumiini poolt gst-4 aktivatsiooni. C.elegans metsiktüüp, samas kui ahr-1 mutandid indutseerivad vaatamata naha-1 vähenemisele endiselt gst-1 (joonis 5G, H). Kuid naha-1 RNAi vähendas oksüdatiivse stressi vastupanuvõimet nii metsiktüüpi kui ka ahr-1(ju145) korral (joonis 5I). Ootamatult ei mõjutanud naha{70}} vaigistamine kurkumiiniga töödeldud loomade juglooniresistentsust (joonis 5I). Meie andmed näitavad keerulist stsenaariumi, mille kohaselt kurkumiin soodustab erinevaid vananemisvastaseid funktsioone, tuginedes kas AhR-sõltuvale või AhR-st sõltumatule, kuid Nrf2/SKN-1-sõltuvale (ja täiendavale) signaalimisele.
Joonis 4. AHR-1 ja kurkumiin kaitsevad sõltumatult oksüdatiivse stressi eest. (A) Tüüpilised kujutised (vasakul) ja DSRed intensiivsuse kvantifitseerimine (paremal) MitoSOX-iga värvitud wt või ahr{3}} nematoodides. Kastdiagrammid näitavad koondandmeid 129-135 ussi/seisundi kohta kolmes katses. ( B ) Mitokondrite membraanipotentsiaali hinnati TRME värvimisega näidatud vanuses nematoodidel. Esitatakse tüüpilised kujutised (vasakul) ja TMRE fluorestsentsi kvantifitseerimine (paremal). Kastplokid näitavad 3 katse koondandmeid. (C, D) Wt ja ahr-1 mutantide neelu pumpamise aktiivsus (C) ja motoorika (D) pärast H2O2-ga töötlemist. Kastdiagrammid näitavad 39-54(C) või 35-36 usside/seisundi (D) koondandmeid 3-4katsetes.*p-väärtus<0.05 vs.wt,$=""><0.05 vs.control="" treatment,="" statistical="" test:="" 1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (e)pharyngeal="" pumping="" of="" curcumin-treated="" nematodes="" after="" h,="" o,="" treatment.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 32="" worms/conditions="" in="" 2experiments.="" *=""><0.05><0.05cur vs.="" dmso="" treatment,="" $=""><0.05 h2o2="" vs.="" control="" statistical="" test:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.(f)influence="" of="" curcumin="" on="" juglone-induced="" toxicity.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 500="" worms/condition="" in="" 20="" experiments.="" *significance="" alhr-1="" vs.wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05.(g) effect="" of="" ugt-45="" rnai="" in="" curcumin-fed="" wt="" and="" ahr-1="" worms.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 150="" worms/condition="" in="" 6experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05. no="" statistical="" significance="" was="" observed="" in="" ugt-45="" vs.="" control="" rnai-treated="">
Joonis 5. Kurkumiin aktiveerib Nrf2/SKN-1 sõltumata AhR-st. (A) kriimustushaava testist kurkumiiniga (cur) või DMSO-ga töödeldud inimese primaarses EC-s, mis on transfekteeritud tühja vektoriga (EV) või ekspressioonivektoriga inimese AhR. Ülemine paneel: esinduslikud pildid; katkendjoon tähistab migratsiooni algust. Skaalariba: 100 um. Alumine paneel: kvantifitseerimine; kastigraafikud näitavad 4-6katsete andmeid. Statistiline test:1-viis ANOVA,*p<0.05><0.05 ys.dmso.(b,c)human="" primary="" ec="" were="" treated="" with="" cur="" or="" dmso.="" (b)representative="" immunostainings:="" ahr="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin="" (green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control="" (-con),="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.scale="" bar:50="" um.(c)="" relative="" capital="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr.="" mean="" expression="" in="" the="" dmso-treated="" controls="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" from="" 7="" experiments.="" (d)pgst-4:gfp="" expression="" in="" dmso-and="" curcumin-treated="" (cur)wt="" and="" alr-1="" worms.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 118-138="" worms/conditions="" in4=""><0.05><0.05 vs.="" dmso="" treatment,="" statistical="" test:1-way="" anova.(e)representative="" immunostaining="" images="" of="" human="" primary="" ec="" treated="" with="" cur="" or="" dmso:="" nrf2="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin(green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control(-="" con)="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.="" scale="" bar:="" 50="" um.(f)="" human="" primary="" ec="" was="" transfected="" with="" an="" empty="" vector(ev)or="" an="" expression="" vector="" for="" an="" shrna="" targeting="" the="" human="" ahr="" transcript="" (shahr).="" relative="" sod2="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr,="" and="" mean="" expression="" in="" the="" ev="" transfected="" cells="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" of="" 7experiments.=""><0.05 vs.="" respective="" control.="" (g,h)="" post-4:gfp="" expression="" in="" dmso-or="" cur-treated="" wt="" and="" ahr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skin-1="" rnai.="" representative="" images(g)="" and="" gst-4-driven="" gfp="" quantification(h)="" are="" shown.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 103-189="" worms/conditions="" in="" 4="" experiments.="" (i)="" juglone="" stress="" survival="" in="" curcumin-="" or="" dmso-treated="" wt="" and="" alhr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skn-1="" rnai.="" kaplan="" meier="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 100="" worms/condition="" in="" 4="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,="" #significance="" curcumin="" vs.="" dmso,="" $="" significance="" skn-1="" vs.="" con="" rnai,="" bonferroni="" p-value=""><>
3.5. Kurkumiin ja prooksüdandid avaldavad AHR-1 aktiivsusele vastupidist mõju
Kooskõlas vähenenud AhRekspressiooni/aktiivsuse vananemisvastase toimega näitavad meie andmed, et kurkumiin võib pikendada C.elegansi eluiga, pärssides AHR-1-reguleeritud radasid, vähendades AHR-1 ekspressiooni/aktiivsust või toimides. ühistel allavoolu signalisatsiooniteedel. Seetõttu proovisime kvantifitseerida AHR-1 aktiivsust C.elegans'is, kuid arvukalt katseid hinnata AHR-1 ekspressiooni ja subtsellulaarset lokalisatsiooni, kasutades antikehi (imetaja AhR vastu või kohandatud antikehi CeAhR vastu) või fluorestsentsmärgistusega. reporterid (OP562, UL1709, ZG93) sisulisi tõendeid ei esitanud. Arvestades, et AHR-1 seondub XRE-dega in vitro [35], mõtlesime AHR-1 aktiivsuse näiduna kasutada XRE-põhist geeniekspressiooni. Seega pöördusime ahvist pärinevate Cos7 rakkude poole, mis ei ekspresseeri endogeenset AhR-i ja seega ei näita endogeenset AhR-i aktiivsust [95,96] ning mida saab kasutada XRE-põhise lutsiferaasi induktsiooni jälgimiseks AHR-i näiduna{18}} (Larigot et al.; esitatud koos selle uuringuga). Kui Cos7 rakud transfekteeriti koos vektoritega, mis ekspresseerisid C.elegans AhR/alr-1, ARNT/aha-1 ja inimese CYPIA1 geeni lutsiferaasiga seotud XRE-d sisaldavat promootorit [64] AHR{ {27}} näitas madalat aktiivsust põhilistes (sõidukiga töödeldud) tingimustes. Tuleb märkida, et ravi kurkumiini või muude C.elegansi tervislikku vananemist soodustavate toitainetega, nagu luteiin [97] ja resveratrool [98, 99], pärssis oluliselt AHR-1 aktiivsust (joonis 6A–C). Selle asemel ei mõjutanud BaP ja leflunomiid, tuntud AhR aktivaatorid imetajatel, AHR-1 aktiivsust (joonis 6A, B) meie kasutatud kontsentratsioonidel. Nimelt kaotati AHR-1 aktiivsus Cos7 rakkudes, mis olid transfekteeritud metsiktüüpi alleeli asemel ahr-1(jul45) alleeli ekspresseeriva vektoriga (joonis 6A–C), mis viitab sellele, et jul45 on tõene. funktsiooni kadumise alleel ja et mõõdetud lutsiferaasi intensiivsus on tingitud funktsionaalsest AHR-ist-1.
Seejärel püüdsime uurida, kas kurkumiin vähendab AHR-1 aktiivsust otsese sidumise või kaudse modulatsiooni kaudu. Praeguseks ei ole C.elegans AHR-1 ligande tuvastatud ja kuna selle LBD kohta puudub teave, teostasime selle iseloomustamiseks in silico analüüsi. Kaks AHR-1 isovormi, la ja 1b, olid joondatud ja kuigi erineva pikkusega, on nende PASB domeenijärjestus identne. See järjestus joondati seejärel Drosophila melanogasteri PASB domeeniga ja kahe selgroogsete AhR-i omadega, mille jaoks oli varem loodud struktuursed mudelid, nimelt hiire (Mus musculus)[100] ja sebrakala (Danio rerio)[101] (joonis 6D). Joondamine näitas selgeid erinevusi liikide vahel, mille peamiseks eripäraks on selgrootute järjestuse deletsioonid PAS-domeeni kõige varieeruvamas piirkonnas, mis vastab paindlikule piirkonnale, sealhulgas spiraalsele kimbule (C , D , E heeliksid) ja lühikestele ahelatele, mis ühendavad. need elemendid (joonis 6D,E). Need deletsioonid võivad vähendada nende AhR-ide sidumisõõnes olemasolevat ruumi. Seejärel genereerisime homoloogia modelleerimise teel AHR-1 PASB 3D-mudeli. Sellel mudelil on tüüpiline PAS-volt, kuid võrreldes teiste AhR-idega lühema Do-spiraaliga. Kuid sisemisel õõnsusel on mõned iseärasused; see sisaldab rohkem hüdrofoobseid jääke ja on mõne sisemise külgahela poolt kärbitud pooleks. Eelkõige on H365 ja H274 vastamisi ja võivad moodustada õõnsuse keskel vesiniksideme; pealegi võivad Y332, L363 ja L302 külgahelad õõnsust takistada, vähendades ligandide jaoks saadaolevat siseruumi (joonis 6E). See väike ja kärbitud õõnsus ei võimalda tõenäoliselt suurte ligandide (nt TCDD või kurkumiin) seondumist. Sarnaselt AHR-1 struktuurimudeliga näitas sebrakala zfAhRla mudel, et LBD õõnsus on kärbitud võrreldes TCDD-d siduvate paraloogidega zfAhR1b ja zfAhR2 [101]. Väikesed ja paindlikud ligandid, nagu leflunomiid, seovad ja aktiveerivad zfAhRla, kuid meie testitud leflunomiidi kontsentratsioon ei aktiveerinud meie Cos7 rakusüsteemis AHR{21}} (joonis 6B). Seejärel mõtlesime, kas LBD väikese õõnsuse eest vastutavate aminohapete mutatsioonid võivad võimaldada klassikalistel liganditel aktiveerida CeAhR. CeAhR L363 jääk (joonis 6D) vastab A375-le mAhRb-I-s ja V375-s Madridis ning sellel jäägil on suur mõju ligandi sidumisele [102]. Samamoodi aitab zfAhRla T386 (joonis 6D), mis ühtib A375-ga mAhRb-1-s ja A386-ga zfAhR1b-s ja zfAhR2-s, kaasa zfAhRla TCDD-ga seondumise puudumisele ja alaniiniks muteerituna taastab tundlikkuseH, kui on ka TC299. tutvustati [101]. Aminohape Y296 on juba C.elegans(H274) histidiin. Seega muteerisime ainult leutsiini positsioonis L363 CeAhR vektoris alaniiniks (L363A) (joonis 6D, E on näidatud noolega). Lisaks muteerisime lähedalasuva histidiini positsioonis H365 glutamiiniks (H365Q), mis hiirtel on Q377 (joonis 6D, E on näidatud noolega), kuna see moodustab tõenäoliselt H274-ga vesiniksideme ja võib kaasa aidata AHR-i väikesele õõnsusele. {49}} (joonis 6E). Seejärel testisime, kas imetajate AhR ligandid mõjutavad AHR{51}} aktiivsust, kui L363 ja H365 on muteerunud. Kuid need muutused, selle asemel, et taastada vastust ksenobiootilistele ligandidele nagu sebrakala puhul [101], kaotasid isegi AHR-1 basaalaktiivsuse, mis on sarnane ju145 alleeliga (joonis 6F). Need tulemused näitavad selgeid erinevusi C.elegansi ja sebrakala LBD-de vahel, kuid näitavad, et LBD on AHR{58}} põhiaktiivsuse jaoks ülioluline. Koos varasemate uuringutega [35, 38, 82] näitavad meie tulemused, et AHR-1 ei ole tõenäoliselt seotud klassikalise ksenobiootikumide poolt indutseeritud transaktivatsiooni vastusega, mis seega ei pruugi olla ahr-1-reguleeritud füsioloogiline vananemine. Selle asemel võivad taimse päritoluga ühendid avaldada vähemalt osaliselt konservatiivset mõju AHR{66}-moduleeritud radade pärssimise kaudu. Meie 3D-mudel viitab sellele, et kurkumiin ei moduleeri AHR{68}} aktiivsust, sidudes oma LBD-d. Seega võib kurkumiini AHR{69}} aktiivsuse pärssimine olla tingitud selle antioksüdantsest toimest. Kooskõlas selle võimalusega ja C.elegans ahr-1 mutantide suurenenud tundlikkusega oksüdatiivse stressi suhtes leidsime, et ROS-i indutseerivad ained suurendavad tõepoolest AHR-1 aktiivsust. Nimelt näitasid prooksüdandi rotenooniga töödeldud Cos7 rakud AhR aktiivsust suurenenud, kui neid transfekteeriti C.elegansi või hiire AhR-ga, kuid mitte siis, kui transfekteeriti jul45 alleeliga või LBD mutatsioonidega alleeliga (joonis 6G, H).
Üldiselt, kuigi CeAhR aktiveerimine kaitseb oksüdatiivse stressi eest varases elus, takistab selle vähenenud ekspressioon vananemist ja vahendab kurkumiini kasulikku vananemisvastast toimet (joonis 7). Kurkumiin võib seega aidata tasakaalustada redoks-TF-i aktiveerimist kontekstist ja ajast sõltuval viisil ning soodustada AhR-i supressiooni otse selle antioksüdantse toime ja/või Nrf2/SKN-1 (või muu TF-i) aktiveerimise kaudu, mis võib samaaegselt vahendavad kurkumiini vananemisvastast toimet.
Joonis 6. Kurkumiinil ja prooksüdantidel on AHR-1 aktiivsusele vastupidine mõju. (AC) AHR-1 aktiivsuse hindamine pärast ravi näidatud ühenditega Cos7 rakkudes, mis on transfekteeritud kas wt AHR-1(wt) või AHR-1-ga, mis kannavad ju145 punktmutatsiooni (ju145) ja AHA{10}} kui ka XRE-ga indutseeritav lutsiferaas. Kastdiagrammid näitavad 3-5katsete andmeid.* p-väärtus<0.05><0.05 vs.="" dmso/etoh,="" statistical="" test:="" 2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (d)="" alignment="" of="" the="" lbds="" from="" c.elegans,="" drosophila,="" and="" zebrafish="" ahrs.="" the="" color="" scheme="" for="" residues:="" red,="" acidic;="" blue,="" basic;="" purple,="" polar;="" yellow,="" cys;="" brown,="" aromatic;="" green,="" hydrophobic;="" orange,="" ser,="" thr;="" gray,="" pro;="" white,="" gly.="" (e)="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" to="" the="" ceahr="" pasb="" are="" indicated="" on="" top(light="" gray="" bars="" for="" helices="" and="" dark="" gray="" bars="" for="" β-strands)="" and="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" asterisks="" mark="" the="" amino="" acids="" likely="" contributing="" to="" the="" inability="" of="" ceahr="" to="" bind="" big="" ligands.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" the="" investigation="" of="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).i3dmodels="" of="" the="" ceahr="" (left)="" and="" the="" mahr="" (right)="" pasb="" domains="" were="" obtained="" by="" homology="" modeling,="" shown="" in="" a="" cartoon="" representation.="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" are="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" the="" colored="" internal="" area="" (blue="" for="" ceahr="" and="" yellow="" for="" mahr)defines="" the="" molecular="" surface="" of="" the="" binding="" cavity="" identified="" by="" castp.="" in="" the="" car="" model,="" the="" amino="" acids="" protruding="" into="" the="" binding="" cavity="" (asterisks="" in="" panel="" d)="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" blue="" sticks.="" the="" mahr="" amino="" acids="" corresponding="" to="" those="" displayed="" in="" the="" ceahr="" model,="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" yellow="" sticks.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" studying="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).="" (f)="" ahr="" activity="" in="" bap-or="" mnf-treated="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" an="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365o="" mutations="" (lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr),="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt,"=""><0.05 vs.dmso.(g)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" ahr-1(either="" wt="" or="" ju145)="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.*=""><0.05vs.wt, #=""><0.05 vs.="" dmso.(h)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365q="" mutations(lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr).boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt/ahr-1,="" #="" p-value=""><0.05 vs.="">
Joonis 7. AHR-1 signaaliraja pakutud mudel C.elegani vastuses pro- ja antioksüdantidele. "Tavalistes" tingimustes (keskmine paneel) aktiveerib AHR-1 rakusisene ROS. See toob kaasa chaperonide eraldumise tsütosoolsest AHR-st-1 ja sellele järgneva AHR-1 tuuma translokatsioonini. Tuumas moodustab AHR-1 heterodimeeri koos AHR tuumatranslokaatoriga (AHA{). {7}}) ja seondub sihtgeenide XRE-dega, mis omakorda viib rakusisese ROS taseme languseni. Nendes tingimustes pikendab ahr{8}} funktsiooni kadu eluiga. Antioksüdantide juuresolekul (vasak paneel) on intratsellulaarsed ROS-i kontsentratsioonid madalad, mis põhjustab AHR-1, mis paikneb tsütoplasmas ja on seotud selle kofaktoritega. Basaalse AHR{10}} aktiivsuse pärssimine pikendab eluiga. Prooksüdantide juuresolekul (parem paneel) aktiveeritakse AHR-1 liigse ROS-i tõttu, mille tulemuseks on selle tuuma translokatsioon, AHR-1-AHA-1 heterodimeeri moodustumine ja sihtgeeni transkriptsioon. Ahr-1 KO-s põhjustab AHR-1-indutseeritud sihtgeenide kaudu vähenenud ROS-i detoksifitseerimine ROS-i kuhjumiseni ja muudab ahr{17}}KO vastuvõtlikuks.
4. Arutelu
AhR avastati algselt imetajatel selle ksenobiootilise reaktsiooni aktiivsuse tõttu, mis on indutseeritud keskkonna toksiliste ainete või endogeensete ligandide seondumisel, kuid on olemas ka modulaatoreid, mis ei sõltu ligandi sidumisest, kuid neid on palju vähem uuritud. C.elegans esindab ainulaadset mudelorganismi AhR aktiivsuste uurimiseks, sõltumata selle klassikalisest ksenobiootilisest vastusest, kuna CeAhR ei seo prototüüp AhR ligande [35,39]. Seda mudelit kasutades tuvastasime AhR-i vananemisprotsessis evolutsiooniliselt konserveerunud funktsiooni [14] ja näitasime, et mõned imetajate AhR-i modulaatorid (st bakterid, Bal ja UVB) mõjutavad vananemisparameetreid AHR-i -1 kaudu. kontekstist sõltuval viisil [25]. Siin jälgisime oma varasemaid leide mehaanilisemalt AhR-ga reguleeritud vananemisomaduste kohta liikide lõikes toidu polüfenoolkurkumiini abil. Meie kombineeritud in vivo, in vitro ja in silico analüüsid näitasid uut ja keerukat stsenaariumi: kuigi kurkumiin soodustab vananemisvastaseid omadusi nematoodidel ja inimese primaarsel EC-l vähemalt osaliselt AhR-sõltuval viisil, sõltub selle antioksüdantne toime mõlemale liigile. AhR-ist sõltumatutel, kuid peamiselt Nrf2/SKN{11}} sõltuvatel mehhanismidel.
Näitasime esimest korda, et kurkumiin aeglustab C.elegansi füsioloogilist vananemist AHR{0}}sõltuval viisil. Kurkumiini võimalike allavoolu ahr-1-sõltuvate efektorite otsimiseks kasutasime sihipäraseid ja erapooletuid lähenemisviise ning leidsime, et enamik kurkumiinravi korral erinevalt reguleeritud geene reguleeritakse AHR-1-sõltuval viisil. Lisaks näitasid paljud neist geenidest sarnast ekspressioonimustrit AHR-1-vaesestatud ja kurkumiiniga ravitud loomadel, mis viitab sellele, et kurkumiin soodustab AHR-1 aktiivsuse pärssimise kaudu eluea pikenemist. Üllataval kombel ei näidanud ei sihitud ega transkriptoomiline analüüs klassikaliste AhR-i sihtmärkide geenide, nagu tassid, olulist rolli, mis selle asemel leiti olevat neuronites suures osas alaekspresseeritud (Larigot et al.; esitatud koos selle uuringuga). Huvitaval kombel võivad need leiud näidata, et terve looma transkriptoomika võib varjata AhR-i neuronaalseid spetsiifilisi toimeid, antud juhul cps-geenide kaudu. Leidsime, et erinevalt ekspresseeritud geenidest kuuluvad paljud II faasi detoksifitseerimisensüümidesse, näiteks soole{10}}, mida suurendas nii ahr-1 ammendumine (ja AhR KO hiirte ajus). ja kurkumiinravi, et vahendada nende eluea pikendamist. Selle asemel suurendasid kurkumiinravi ja ahr{12}} ammendumine teise II faasi detoksifitseerimisensüümi GST-4 ekspressiooni erinevate mehhanismide kaudu: esimene tugineb, samas kui teine on peamiselt sõltumatu, Nrf2/ SKN-1, klassikaline redoks-TF, mis indutseerib C.elegansi oksüdatiivse stressi korral GST-4 [103]. Veelgi enam, kuigi kurkumiin kutsub esile Nrf2/SKN-1-sõltuvad vastused C.elegans'is (GST-4 ekspressioon) ja inimese primaarses EC-s (Sod2 ekspressioon ja migratsioonivõime), kaitseb see ka C.eleansi oksüdatiivse stressi eest SKN{24}}sõltumatul viisil. C.elegans'is ei saa kurkumiin pikendada väga haige naha-1(zu67) mutantide eluiga [104], samas kui GST-4 saab indutseerida SKN-1-sõltumatult EGF-i signaalide kaudu [94] ning imetajatel teatati EGF raja ja AhR vahelisest läbirääkimisest [105].
Huvitaval kombel ja vastupidiselt metsiktüüpi tüvega täheldasime kurkumiini AHR-1-sõltumatut mõju tervisele vastavalt Huntingtoni ja Parkinsoni tõve nematoodimudelites. Nende tüvede puhul suurendas kurkumiinravi valguagregaatide arvu samal määral kui AHR-1 puudulikkus, mis viitab kas valgu agregatsiooni enda kaitsvale toimele ja/või valkude agregatsiooni eest kaitsvate radade aktiveerimisele kurkumiiniga, sõltumata a/ h-1 ammendumine. Kurkumiini mõju valkude agregatsioonile on vastuoluline: näidati, et see pärsib fibrillide moodustumist, kuid seob ka amüloidogeensete valkude fibrillaarseid/oligomeerseid liike, kiirendades seeläbi nende agregatsiooni ja vähendades üldist neurotoksilisust [106]. Tuleb märkida, et kofeiin, mis kaitseb ka südame-veresoonkonna vananemise eest [66, 107], hoiab ära ka A-indutseeritud halvatuse ilma A-agregaate vähendamata, vaid kaitsva Nrf2/SKN{10}}sõltuva raja aktiveerimise kaudu [108]. Oluline on hinnata, kas C.elegansi tõve mudelites kurkumiini või kogu -1 ammendumisest põhjustatud kaitsvat toimet vahendavad mehhanismid, mis soodustavad oligomeersete/fibrillaarsete liikide eemaldamist vähem toksilisteks agregaatideks ja/või muude mehhanismide aktiveerimine, nagu Nrf2/SKN-1, mis võivad samaaegselt kaitsta proteotoksilisuse eest. Väärib märkimist, et detoksikatsiooniensüümid võivad sisaldada nii XRE-d kui ka ARE-d (antioksüdantidele reageerivad elemendid) ning kirjeldatud on Nrf2/ARE ja AhR/XRE reguleeritud signaalimise vastasmõju [109]. Seetõttu on huvitav selgitada, kuidas kurkumiin soodustab selle erinevaid kasulikke vananemisvastaseid toimeid tasakaalu kaudu Nrf2 ja AhR-ga reguleeritud signaalide vahel.
Meie kombineeritud lähenemisviisid näitasid, et kurkumiin pärsib AHR{0}} aktiivsust. Imetajatel oletati, et kurkumiini AhR-i inhibeerivat toimet vahendab otsene LBD seondumine [110] või AhR-i fosforüüliva proteiinkinaas C pärssimine[79]. Teine uuring näitas, et AhR-i transkriptsiooniline aktiivsus sõltub raku redoksseisundist ja kromatiini struktuurist, mida mõlemat mõjutab kurkumiin [111]. Kuigi AHR-1 ei seo TCDD-d, seob see XRE-d in vitro,[36] kuid süstemaatilised uuringud, mis käsitlevad polüaromaatsete süsivesinike või teiste imetajate AhR ligandide potentsiaali AHR-i-1 moduleerida, puuduvad peamiselt selle hindamiseks sobivate vahendite puudumine. Meie uuringud üritavad seda lünka täita ja kasutada lutsiferaasi testidega seotud AHR{8}} ekspresseerivaid Cos7 rakke (Larigot et al.; esitatud koos selle uuringuga) ja C. elegans LBD in silico modelleerimist, ning näitasid, et kurkumiin pärsib AHR-i. -1 aktiivsus, kuid tõenäoliselt mitte otsese LBD sidumise kaudu. Meie uuringus kasutatud in vitro test kinnitas, et CeAhR ei aktiveerita klassikalise ksenobiootikumide signaalimise kaudu. Siiski ei näita see AhR-i seondumisest tingitud tegevusi muude DNA järjestustega peale "klassikalise" XRE, mida leidub CYP1A1-s, näiteks PON1-s leitud polüfenoolile (kvertsetiinile) reageeriv XRE [112, 113]. Immunovärvimine inimese primaarses EC-s vaidleb vastu ka kurkumiini indutseerivale AhR tuuma translokatsioonile, mis koos migratsioonivõime soodustava toimega AhR üleekspresseerivates rakkudes võib samuti viidata sellele, et kurkumiin pärsib AhR aktiivsust.
Teeme ettepaneku, et kurkumiini inhibeeriv toime, selle asemel, et tugineda AhR-i seondumisele, hõlmab selle antioksüdantset võimet, mis võib tõepoolest olla seotud Nrf2/SKN-1 aktiveerimisega või isegi sellest sõltuda. Imetajate AhR-i aktiveerib ROS LBD-st sõltumatu oksüdatiivse modifikatsiooni kaudu [85], kuid meie andmed näitavad, et AHR-1 aktiivsuse indutseerimiseks prooksüdandi rotenooni poolt on vaja LBD-d. ROS-vahendatud AhR aktiveerimise kaudne mehhanism on tugeva AhR ligandi FICZ moodustumine[114]. Siiski on FICZ suur tasapinnaline molekul, mis meie in silico mudeli järgi ei sobiks AHR-1 LBD-ga. Kuigi täpset mehhanismi, mille abil ROS soodustab AHR-1 aktiivsust ja inhibeerib kurkumiin (kas otsese ROS-i kustutamise või kaudselt Nrf2 või muude antioksüdante reguleerivate geenide aktiveerimise kaudu), tuleb veel kindlaks teha, toetab seda tugevalt meie leiud: rotenoon aktiveerib AHR-1 ja ahr-1 mutandid näitavad rohkem mtROS-i, vähendavad mitokondriaalset membraanipotentsiaali ning on tundlikumad H, O ja juglooni ning UVB ja BaP suhtes [25] , mis mõlemad toodavad ROS-i[115,116]. Selles kontekstis on huvitav märkida, et ahr-1 mutantidel on mitokondrite funktsioonid kerged muutused, mis sarnanevad mitohormeesi funktsioonidega [117. See viitab sellele, et kogu-1 ammendumine (ja võimalik kurkumiin AHR-i inhibeerimise kaudu-1) võib soodustada tervislikku seisundit kerge mitokondriaalse stressi kaudu, mis teadaolevalt pikendab C.elegani eluiga tänu võõrutusgeenidele, mida sarnaselt moduleeritakse teises{19}}. {20}} mutandid [118 119]. Veelgi enam, see, kas Nrf2/SKN-1 ja mitokondrid mängivad kurkumiinravi ajal rolli AHR-1 aktiivsuse moduleerimisel, on huvitav võimalus, mida tuleb veel kinnitada.
Üldiselt, kasutades ära mitmeid omadusi, mida nematoodi C.elegans pakub in vivo uuringute jaoks, oletame, et AhR-i esivanemate funktsioon võib olla pigem antioksüdantsete kui ksenobiootiliste vastustega seotud faasi ll-ensüümide reguleerimises. Vastupidiselt kõrgest ROS-i tasemest põhjustatud kahjulikele mõjudele võib AhR-defitsiidist tingitud kasulikke mõjusid vahendada kerge mitokondrite stress ja/või kerge ROS-i tootmine (mitohormees), mis samuti sõltuvad Nrf2/SKN-st-1. Pakume ka tugevaid tõendeid kurkumiini ja AhR vahelise koostoime kohta. AhR signaaliülekande kurkumiini pärssimine on evolutsiooniliselt konserveerunud ja seda ei vahenda tõenäoliselt AhR LBD-ga seondumine, vaid pigem kurkumiini ROS-i eemaldavad omadused või Nrf2/SKN -1 aktiveerimine. Kurkumiin võib tõepoolest aktiveerida Nrf2 signaaliraja erineval viisil [91]. Lõpuks näitasid meie andmed, et kurkumiin soodustab vananemisvastast toimet ka sõltumatul viisil nii C.elegans'is (suurenenud GST-4 ekspressioon ja oksüdatiivse stressi resistentsus) kui ka inimese primaarses EC-s (suurenenud Sod2 ekspressioon ja migratsioonivõime). ), mis võib samuti selgitada kurkumiini aditiivset mõju ja AHR{14}} funktsiooni kadumist polüQ-d ekspresseerivate loomade tervisele.
5. Kokkuvõtted
Kokkuvõtteks näitasime in silico, vitro ja in vivo lähenemisviiside originaalse kombinatsiooni abil, et kuigi CeAhR aktiveerimine kaitseb oksüdatiivse stressi eest varases elus, siis selle vähenenud ekspressioon takistab vananemist ja vahendab kurkumiini kasulikku vananemisvastast toimet (joonis 7). . Kurkumiin võib seega aidata tasakaalustada erinevate transkriptsioonifaktorite aktiivsust, mis on seotud detoksikatsiooni/antioksüdantsete reaktsioonidega (AhR pärssimine ja Nrf2 aktiveerimine) tingimustes, kus need on muutunud (suurendab AhR-i ja vähendab Nrf2/SKN-i-1), nagu vananemine või vanusega seotud häired. Meie töö lisab AhR-i niigi ulatuslikele multifunktsionaalsetele ja kontekstispetsiifilistele tegevustele veelgi keerukamaks, millel on oluline mõju organismi tervisele ja elueale. Lisaks avab see ukse täiendavatele uuringutele, kasutades nematoodide süsteemi, et avastada ja uurida AhR-i esivanemate funktsioone, mida imetajatel on vähem tõenäoline.
See artikkel on välja võetud ajakirjast Antioxidants 2022, 11, 613. https://doi.org/10.3390/antiox11040613 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants
