Apikaalne nihkepinge suurendatud orgaaniliste katioonide transport inimese OCT2/MATE-s{1}}Transfekteeritud Madin-Darby koera neerurakud hõlmavad tsiliaarset tuvastamist

Rohkem informatsiooni:emily.li@wecistanche.com

Aishwarya Jayagopal, Paul R. Brakeman, Peter Soler, Nicholas Ferrell, William Fissell, Deanna L. Kroetz ja Shuvo Roy

Bioinseneri ja teraapiateaduste (AJ, PS, DLK, SR) ja pediaatria (PRB) osakonnad,

California Ülikool San Francisco (UCSF), San Francisco, California;

ja meditsiini osakond, nefroloogia osakond, Vanderbilti ülikooli meditsiinikeskus, Nashville, Tennessee (NF, WF)

ABSTRAKTNE

Aktiivne transport möödaneeru-proksimaalsed tuubulid mängivad olulist rolli ravimi dispositsioonis. Ravimi väljatöötamise ajal on hinnanguliseltneeru-eritumine on annuse määramisel olulised. Neeru bioreaktorid, mis reprodutseerivad neeru füsioloogilisi sugulasi, nagu voolust põhjustatud nihkepinge, võivad paremini ennustada in vivo ravimite käitumist kui praegused in vitro mudelid. Selles uuringus uurisime nihkepinge rolli 4-(4-(dimetüülamino)-stürüül)-N-metüülpüridiiniumjodiidi (ASP pluss) aktiivsel transpordil Madin-Darby koerte poolt.neerudrakudeksogeenselt ekspresseerivad inimese orgaaniliste katioonide transportijad orgaanilised katioonide transporterid 2 (OCT2) ja mitme ravimi ja toksiini ekstrusioonivalk 1 (MATE1). Pideva söötme perfusiooniga paralleelsel plaadil kultiveeritud rakud moodustasid tiheda monokihi, millel oli kõrge inuliinibarjäär. Vastuseks suurenevale nihkepinge tasemele (0.2-2 dynes/cm) näitasid rakud ASP pluss transpordi vastavat suurenemist, saavutades maksimaalse 4.2-kordse kasvu 2 juures. dynes/cm² võrreldes staatilistes tingimustes kultiveeritud rakkudega. Seda transporti inhibeeriti imipramiiniga, mis näitab, et nihkepinge tingimustes toimus aktiivne transport. Rakud, mis puutusid kokku nihkepingega 2 dynes/cm², näitasid ka RNA ekspressiooni suurenemist nii transfekteeritud inimestel kui ka endogeensel OCT2-l (vastavalt 37- ja 20- korda). Ripskeste eemaldamine ammooniumsulfaadiga kõrvaldas nihke mõju ASP-le ja transpordile 0,5 dynes/cm² juures, ilma et see mõjutas ASP-d ja transporti staatilistes tingimustes. Need tulemused näitavad, et nihkepinge mõjutab orgaaniliste katioonide aktiivset transportineeru-torukujulineepiteelirakud ripsmetest sõltuval viisil.

Cistanche on hea neerufunktsiooni jaoks

Sissejuhatus

Hoolimata suurtest edusammudest optimaalsete ravimikandidaatide valimise prekliinilistes meetodites, on ravimite väljatöötamine endiselt pikk ja kulukas protsess, mille turustatavate uute molekulaarsete üksuste saagis on väga väike (Watkins, 2011). Prekliiniliste mudelite peamine puudus on võimetus ennustada kliirensit ja toksilisust inimestel. Ligikaudu 30 protsenti ravimitest, mis on prekliinilistes uuringutes edukad, ebaõnnestuvad inimestel ootamatute kliirensi väärtuste või toksilisuse tõttu (Kola ja Landis, 2004).

Neer on in vitro rakukultuuri modelleerimisel eriti oluline sihtmärk, kuna see vastutab enam kui kolmandiku kõigi ravimite ja enamiku metaboliitide elimineerimise eest (Morrissey et al., 2013). Theneeru-proksimaalne tuubul on oluline ravimite testimisel arenduse ajal, kuna see teostab suurema osa ravimikandidaatide aktiivsest transpordist ja on eriti tundlik toksiliste vigastuste suhtes (Giacominiet al., 2010). Theneeru-tuubulon epiteelirakkude monokiht, mille filtraat voolab üle apikaalse pinna. Torukujulise epiteeli all on basaalmembraan ja külgnevad peritubulaarsed kapillaarid võimaldavad vett uuesti imenduda ja tervitada. Proksimaalse tuubuli mikrokeskkond, eriti vedeliku nihkepinge ja apikobasaalsed onkootilised gradiendid, reprodutseeritakse tavaliste rakukultuurimeetoditega mittetäielikult. Epiteelirakkude bioreaktorid, mis püüavad kinni silmapaistva in vivo füsioloogia, võivad parandada in vitro analüüsidest tuletatud kliirensi ja toksilisuse prognooside täpsust (Pfaller ja Gstraunthaler, 1998; Astashkina et al., 2012).

Kasvavad tõendid näitavad, et proksimaalsete tuubulite rakkude morfoloogia ja funktsionaalsus võivad varieeruda sõltuvalt kasvukeskkonnast, nagu kasvupinna poorsus, kokkupuude vedelikuga mõlemal küljel ja/või vedeliku nihkepinge. Essigi ja Friedlanderi (2003) ning meie labori (Ferrell jt 2010) varasem töö on näidanud, et torukeste vedelikuvoolust põhjustatud ümberkorraldused proksimaalsete tuubulite rakkude apikaalses aktiini tsütoskeletis (Ferrell et al., 2010) . Seejärel on mitmed uuringud näidanud, et nihkepinge mõjutab ekspressioonitasemeid ja mitmete neeldumiste ja väljavoolu transporterite, sealhulgas naatrium-vesiniku antiporter 3. Na/K-ATPaasi, glükoosi transporterid, epiteeli naatriumikanali ja endotsütoosi retseptorid, megaliini ja tubuliini ekspressioonitaset. (Duan jt, 2010; Raghavan jt, 2014; Jansen jt. 2016; Ernandez et al., 2018). Teised tööd on näidanud, et nihkevool torukujulises bioreaktorisüsteemis orienteerub ja pikenebneeru-torukujulinerakud mööda vooluteed (Venzac et al. 2018). In vitro tõendid näitavad, et mõned muutused tsütoskeleti struktuuris ja transpordifunktsioonis on tõenäoliselt seotud ripsmete mehhanosensoorse funktsiooniga (Overgaard et al. 2009; Raghavan et al.. 2014); aga vähesed uuringud on käsitlenud nihkepinge mõju neerurakkudes olevate ravimite transporteritele. Lisaks on vähe teada erinevate nihkekiiruste mõjust raku funktsionaalsusele, eriti püsiva kokkupuute korral nihkepingega. Enamikus uuringutes on arvesse võetud ühte nihkepinge määra ja tehtud vaid lühiajalisi katseid (1-6 tundi), mistõttu on raske eristada nihke tegelikku mõju ja raku stressireaktsiooni järskudele muutustele mikrokeskkonnas (Duan jt 2010; Jang jt2013: Maggiorani jt 2015).

Siin kasutati mikrofluidset bioreaktorit, et uurida nihkepinge järkjärgulise taseme mõjuneeru-proksimaalsete tuubulite rakkude ravimite transportijad orgaanilised katioonide transporterid 2 (OCT2) ja mitme ravimi ja toksiini ekstrusioonivalk 1 (MATE1). Näitame, et kasvav apikaalne nihkepinge suurendab orgaaniliste katioonide transporti ja transporteri ekspressiooni ning et ripsmed on seotud selle raku vastusega nihkepingele.

Materjalid ja meetodid

Seadme valmistamine ja kokkupanek. Oleme varem avaldanud oma paralleelse plaadiga bioreaktori disaini, mis tagab reguleeritava kõrgusega vedeliku voolutee rakkude apikaalsel küljel ja staatilise reservuaari basaalküljel (Brakeman et al., 2016). Siin esitatud töö jaoks kohandasime oma eelmist disaini, et luua nelja eraldi vooluteega multipleksitud seade, mis võimaldab testida korraga nelja bioloogilist tingimust (joonis 1). Iga seade koosneb kolmest kihist: alus, millel on 5-ml apikaalne reservuaar, keskmine plaat Snapwelli sisendi hoidmiseks (Costar, Corning, Corning, NY), mille rakupindala on 1,12 cm², ja ülemine plaat, mis sisaldab 1- kuni 2- ml basolateraalne reservuaar. Plaadid

töödeldi polüsulfoonist, et võimaldada steriliseerimist autoklaaviga. Laserlõigatud silikoontihendid kõrgusega 500- kuni 1000-um asetati iga plaatide komplekti vahele vedelikukambrite tihendamiseks ja apikaalsele küljele kanali kõrguse määramiseks. Bioreaktor pandi kokku kruvide abil. Meediumipaak ja mullilõks olid sisseehitatud kolonn. Sisse- ja väljalaskeavad ühendati okaspistikute abil 16- mm siseläbimõõduga Masterflex LS14 silikoontoruga (Cole Parmer Lab Supplies, Vernon Hills, IL). Vedeliku vool ja seega apikaalne nihkepinge määrati ja kontrolliti peristaltilise pumbaga (Cole Parmer).

Rakukultuur ja voog. MDCK rakud, mis olid transfekteeritud kas tühja vektori või paari sissevõtu- ja väljavoolu transportijaga (hOCT2/hMATE1) (Konig et al.2011), tarnis dr Martin Fromm (Erlangen, Saksamaa) ja neid kultiveeriti minimaalne oluline sööde Earle'i tasakaalustatud soolalahusega (UCSF Cell Culture Facility), mis sisaldab 10 protsenti veise loote seerumit (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) ja 1 protsenti penitsilliini-streptomütsiini (UCSF Cell Culture Facility). Topelttransfekteeritud rakkude söötmele lisati viissada mikrogrammi milliliitri kohta hügromütsiini (UCSF Cell Culture Facility) ja 100 mg/h ml genetsiini (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Voolukatsete jaoks kasutati hOCT2/hMATE1 MDCK rakku plaaditi Snapwelli sisestuste (Corning) alumisele küljele tihedusega 300,{11}} rakku süvendi kohta (250,000 rakku/cm), kasvatati staatilistes tingimustes kuni liitumiseni ja asetati seejärel Apikaalset söötme voolu suurendati 7 päeva jooksul 0,1-lt 1-6mlmin-ni, kuni saavutati soovitud nihkepinge, ja jäeti seejärel enne katsetamist stabiilseks 72 tunniks. Rakke kasvatati staatilistes tingimustes sama kaua kui kontrolle. .

Immunofluorestsents. Rakud fikseeriti 4% paraformaldehüüdiga (Thermo Fisher Scientific), permeabiliseeriti 0,1% Triton-Xin PBS-iga (Sigma-Aldrich) ja blokeeriti veise seerumi albumiiniga (Sigma-Aldrich). Seejärel inkubeeriti neid 1:50 lahjendusega Alexa 488 märgistatud zonula occludens-1 hiire monoklonaalse antikehaga (Life Technologies, Carlsbad, CA) või primaarse atsetüülitud tubuliini hiire monoklonaalse antikehaga (Life Technologies) 60 minutit. A-tubuliini antikehaga töödeldud rakke inkubeeriti seejärel sekundaarse 561 hiirevastase kitse antikehaga (Life Technologies) ja falloidiiniga (Thermo Fisher Scientific) F-aktiini värvimiseks. Pildistamine viidi läbi Nikoni (Tokyo, Jaapan) spektraalse konfokaalse mikroskoobiga, millel oli 40x õliobjektiiv.

Barjääri jõudlus. Inuliin, 5000 Da polümeer, on hästi tuntud glomerulaarfiltratsiooni kiiruse marker ja proksimaalse tuubuli lekke marker in vivo (Sohtell et al, 1983):

Apikaalsele söötmele lisati FITC-märgistatud inuliin (Sigma-Aldrich) ja lasti läbi seadmete voolata. Proove koguti basaalreservuaarist iga 24 tunni järel ja analüüsiti inuliini sisaldust Genios Pro fluorestsentsplaadilugeja abil (Tecan, Mannedorf, Šveits). Raku monokihi barjäärifunktsioon arvutati apikaalses ja basaalsektsioonis mõõdetud inuliini taseme põhjal, nagu on kirjeldatud valemis 1. Siin on Capital inuliini kontsentratsioon apikaalses sektsioonis ja C Mal on kontsentratsioon basaalsektsioonis. Inuliinileke arvutati kontsentratsioonina basaal (doonori) sektsioonis jagatuna raku pindalaga 24 tunni pärast.

ASP pluss transport. Transdutseeritud transportergeenid indutseeriti 10 mM Na-butüraadiga (Sigma-Aldrich) 24 tundi enne transpordikatset, nagu eelnevalt kirjeldatud (Konig et al, 2011). Vajadusel inkubeeriti rakke 30 minuti jooksul inhibiitoriga (500 µM imipramiini või 1 mM tsimetidiiniga (Sigma-Aldrich)), millele järgnes 25 µM 4-(4-dimetüülamino) lisamine. stürüül-N-metüülpüridiinium (ASP pluss) (Life Technologies) ja inkubeerimine 1 tund. Proovid koguti apikaalsest ja basaalsöötmest. Seejärel loputati rakke kolm korda jääkülma fosfaatpuhverdatud soolalahusega ja lüüsiti, et mõõta ASP pluss akumulatsiooni ja transporti. Transpordikatsed viidi läbi samaaegselt nihkepinge all olevate rakkudega ja kultiveeriti staatilistes tingimustes. ASP pluss kontsentratsioon kvantifitseeriti Genios Pro fluorestsentsplaadilugejaga (Tecan) ergastuslainepikkusel 485 nm ja emissiooni lainepikkusel 590 nm.

Valkude kvantifitseerimine. Rakud lüüsiti öö läbi loksutades 1% SDS-10 M NaOH lüüsipuhvriga. Valgusisaldust mõõdeti standardse Pierce BCA valguanalüüsi komplekti (Thermo Fisher) abil. Vajadusel normaliseeriti valgusisaldus vastavalt raku kasvupiirkonnale.

RNA ekspressioon. RNA ekstraheeriti rakkudest, kasutades RNeasy RNA ekstraheerimiskomplekti (Qiagen, Hilden, Saksamaa), ja cDNA genereeriti skriptikomplekti (Bio-Rad, Hercules, CA) abil. cDNA-d kasutati inimese ja koera OCT2 ja MATE1 tuvastamiseks ning koera P-glükoproteiin (P-GP) kvantitatiivse pöördtranskriptaasi-polümeraasi ahelreaktsiooni abil, kasutades Tagmani testi ja sonde (Applied Biosystems) Fast Realtime PCR seadmel (Applied Biosystems). Ribosomaalset valku S18 (RS-18) kasutati majapidamiskontrollina. Nihkepinge mõju transporteri ekspressioonile analüüsiti 4ACt meetodil, kasutades transporteri tasemeid, mis on väljendatud RS-18 suhtes (Peters et al.2007; Schmittgen ja Livak, 2008). P-GP-d kasutati nihkepinge globaalsete mõjude mõõtmiseks transporteri ekspressioonile.

Decilatsioon. Rakke kasvatati liitumiseni ja seejärel inkubeeriti 30 mM ammooniumsulfaadi (Fluka AG) puudumisel või juuresolekul 24 tundi enne ASP pluss transpordi mõõtmist (Oxergard et al 2009). Ripsmete olemasolu määrati a-tubuliini kuvamisega, nagu siin juba kirjeldatud.

Statistika. Kõik katsed viidi läbi kolmes eksemplaris, igas katses tehti vähemalt kaks tehnilist kordust. Andmed on väljendatud keskmisena ± SD ja graafikuna kasti ja viskide graafikutena. Statistilised analüüsid viidi läbi paaritu ühe- või kahesuunalise dispersioonanalüüsiga ja P-väärtusega<0.05 was="" considered="" significant.="" data="" were="" analyzed="" using="" prism="" version="" 6.0="" (graphpad,="" san="" diego,="">

Tulemused

Raku morfoloogia ja barjäärifunktsioon. Immunofluo hiljutine allavoolu paigutatud rakkude analüüs näitas ühtlast ühekihilist moodustumist tiheda ühendusega valguga zonula occludens -1, mis paiknes rakkudevahelistes tihedates ühenduskohtades nii staatilistes kui ka voolutingimustes (joonis 2, A–C). Valgu üldsisalduse kvantifitseerimine näitas vastusena nihkepingele valgusisalduse suurenemist ühekordse kihi ruutsentimeetri kohta kuni 16- korda (joonis 2D). Järgmisena mõõtsime inuliini, proksimaalse tuubulite lekke markeri, läbilaskvust kogu monokihis. Seadmete barjääri jõudlusmäär oli 97,9 protsenti 6 1,42 protsenti 7 päeva kultiveerimisel kuni 2 düüni/cm2 nihkepinge all (joonis 2E), mille tulemuseks oli lõplik inuliini lekke määr 6. päeval 6 1. {15}},13–0,69 mg/cm2 päevas.

Nihkepinge mõju orgaaniliste katioonide transpordile. OCT2 ja MATE1 autofluorestseeruva substraadi ASP plus transporti mõõdeti 1 tund erinevatel nihkepingetasemetel (0.2-2 dynes/cm²). MDCK rakud, mis ekspresseerivad eksogeenselt hOCT2 ja hMATE1, näitasid ASP pluss transpordi 4,{9}}kordset suurenemist vastusena nihkepingele 2 dynes/cm², mis kajastub nii raku akumulatsiooni (joonis 3A) kui ka transtsellulaarse transpordi (joonis 3A) näitajates. 3B). Nihkepinge mõju ASP-le pluss akumulatsioonile või transtsellulaarsele transpordile oli sarnane nihkepinge 0,5 ja 2 dynes/cm² korral. Et teha kindlaks, kas aktiivne ASP pluss transport suurenes, mõõdeti ASP plussi ülekandumist rakkude poolt, mis puutusid kokku 0,2 dynes/cm nihkepingega kas eeltöötlusega 500 uM imipramiiniga, OCT{20} } ja MATE{21}}spetsiifiline inhibiitor. ASP pluss transporti inhibeeris imipramiin 60,3% ± 15,8% nihkepinge tingimustes, võrreldes 47,6% ±19,7% staatilistes tingimustes (joonis 3C).

Selle tähelepaneku paremaks mõistmiseks mõõdeti nihkepinge mõju inimese OCT2 (transfekteeritud), koera OCT2 (endogeenne) ja koera P-GP (endogeenne) ekspressioonile rakkudes, mis puutusid kokku erineva nihketasemega 72 tunni jooksul pärast nihkejõu aeglane tõus 7 päeva jooksul (joonis 4). Võrreldes staatilistes tingimustes kultiveeritud rakkudega näitasid nihkele eksponeeritud MDCK rakud transfekteeritud inimese ja endogeense OCT2 ekspressiooni suurenemist (vastavalt kuni 3{9}} ja 20- korda), ilma märkimisväärse mõjuta. transfekteeritud MATE1 või endogeense P-GP ekspressiooni kohta.

Cilia roll vastusena nihkele. Pildistamine näitas, et topelttransfekteeritud MDCK rakud ekspresseerivad ripsmeid nii staatilistes kui ka voolutingimustes (joonis 5, A ja E). Rakkude kokkupuude 30 mM ammooniumsulfaadiga 24 tunni jooksul põhjustas ripsmete täieliku kadumise (joonis 5, C ja G). Oluline on see, et detsiiliatsioonil ei olnud rakumembraani ühendustele suurt mõju, mida mõõdeti F-aktiini kujutisega, mis kinnitab tiheda ühendusega valgud rakumembraani ühenduskohtades epiteelirakkudes (joonis 5.D ja HD (Stevenson ja Begg. 1994). Kuigi nendel piltidel on F-aktiini värvumine mõningal määral paksenenud, ei olnud see järjekindel leid ja seetõttu me seda efekti kvantitatiivselt ei mõõtnud. Leevendus ei mõjutanud staatilistes tingimustes kultiveeritud rakkude transporti. kõrvaldas nihkepinge mõju ASP-le pluss transpordile rakkudes, mis olid avatud nihkejõule 0,5 dynes/cm² (joonis 6).

Arutelu

Neerud mängivad keskset rolli ravimite elimineerimisel inimkehast. In vitro ravimite testimisel on oluline täpselt jäljendada neerufüsioloogia keerukust, eriti vedeliku voolu osas. On näidatud, et vedelikuvoolust tulenev nihkepinge mõjutab raku morfoloogiat ja ioonide transportereid in vitro, kuid selle mõju kohta ravimitransporteritele on vähe teada (Duan et al., 2010; Ferrell jt, 2012; Jansen et al., 2016). . Lisaks on enamikus varasemates uuringutes mõõdetud ainult lühiajalise nihke (1-6 tundi) mõju, mis tõenäoliselt ei eralda täielikult nihkepinge mõju muudest rakuliste stressireaktsioonidest (Duan et al..2010; Jang et al. 2013; Maggiorani et al.. 2015). Nendes uuringutes keskendusime vedelikuvoolust tuleneva püsiva (7-päevase) nihkepinge mõjule ravimi transpordile, et paremini jäljendada püsivat nihkepinget, mida kogevadneeru-torukujulinerakud in vivo.

Arusaamine, kuidas ravimitransportöörid reageerivad püsivale nihkepingele, võib parandada in vitro ennustusi ravimite in vivo käitlemise kohta neerude kaudu. Täpselt kavandatud neerude in vitro mudelid võivad standardida prekliinilised testid ja vähendada ravimi ebaõnnestumise määra.

Selles töös kasutati paralleelse plaadiga mikrofluidset bioreaktorit, et määrata püsiva nihkepinge mõju OCT2 ja MATE1 orgaaniliste katioonide transpordile.neeru-tuubulrakuliin. Nendes uuringutes võeti arvesse mitut rakuliini, sealhulgas inimese rakuliine, nagu inimese proksimaalsed tuubulirakud Hopferi rühmast (Orosz et al, 2004) ja RPTEC-id (CRL-4031: American Type Culture Collection, Manassas, VA) ( Wieser et al., 2008), kuid topelttransfekteeritud hOCT2 / hMATE1 MDCK rakke peeti selle uuringu jaoks kõige sobivamaks valikuks mitmel põhjusel. Esiteks näitavad MDCK rakud järjekindlalt tugevat kinnitust transwelli sisestustele, mis võimaldab neil vastu pidada vedeliku voolu esialgsele pingele. Teiseks moodustavad need rakud tihedaid monokihte, mis takistab lekkimist ja on oluline markeri substraatide transtsellulaarse transpordi uurimiseks. Lõpuks võimaldab transporterite eksogeenne ekspressioon aktiivset transporti ja häirete mõju paremini tuvastada.

Allavoolu paigutatud rakud moodustasid konfluentse monokihi ja lokaliseerisid tiheda ühendusega valgu raku perifeeriasse. Samuti säilitasid nad kõrge barjäärifunktsiooni, mõõdetuna inuliini läbilaskvuse järgi. Epiteelirakkude võime moodustada ühekihiline kiht, mis takistab vedeliku ja valgu lekkimist, on tuubuli nõuetekohaseks toimimiseks äärmiselt oluline. Siin oli leke läbi MDCK rakkude minimaalne, alla 1 ug/cm² päevas ja oluliselt väiksem kui inimrakkude kaudu. Oleme varem näidanud, et inimese neerurakkude monokihtidel on inuliini leke 10-20 ug/cm² päevas (Brakeman et al., 2016), mis toetab järeldust, et hOCT2/hMATE1 MDCK rakud moodustasid tugeva monokihi.

ASP plusi transport suurenes oluliselt hOCT2 / hMATE1 MDCK rakkudes, mis olid 72 tunni jooksul kokku puutunud erineva tasemega nihkepingega, võrreldes staatiliste kontrollidega. ASP plusi võtab endasse OCT2 (SLC22A2) ja väljastab MATE1 (SLC47A1), kaks orgaanilise katiooni transportijat, mis töötavad koos, et hõlbustadaneeru-sageli kasutatavate ravimite, nagu metformiin ja tsisplatiin, sekretsioon (Biermann jt 2006; Wittwer et al. 2013). Sarnaseid nihkepinge mõjusid on teatatud proksimaalsete tuubulioonide transporterite puhul. Vastuseks suurenenud nihkepingele on teatatud albumiini omastamise, ioonide reabsorptsiooni ning megaliini ja tubuliini ekspressiooni ja funktsiooni suurenemisest (Overgaard et al..2009; Duan jt.2010: Ferrell et al..2012:Raghavan et al., 2014). Kokkupuudeneeru-proksimaalsed tuubulirakud nihkepingele on samuti seotud vähenenud apoptoosi ja kiirema taastumisega ägedast tsisplatiini toksilisusest ning orgaanilise aniooni transpordi suurenenud inhibeerimisega (Jang et al.2013). Kuna vedelikuvoolust tulenev nihkepinge esineb pidevalt proksimaalses tuubulis, toetavad need leiud ühiselt füsioloogilisemate in vitro mudelisüsteemide kasutamist, et ennustada neerude ravimi dispositsiooni ja toksilisust. Tähelepanuväärne on see, et nihkepinge 0.5 ja 2.0 düüni/cm² vahel ei ole transporteri funktsioonis olulist erinevust. Varasemad Essigi ja Friedlanderi (2003) uuringud on leidnud, et raku morfoloogia muutuse esilekutsumiseks on vajalik minimaalne nihke nihke tase 0,17 dynes/cm2, ja teistes uuringutes on mõõdetud mõju rakkudele. füsioloogia kuni 1 dyne/cm² (Duan et al., 2010). See on esimene uuring, mis uurib erinevate kõrgemate ja püsivate nihkepingetasemete mõju neerude ravimitransporterite funktsionaalsusele ning on võimalik, et bioloogilise erinevuse suurusjärk nihkepinge 0,5 ja 2,0 dynes/cm² vahel, mida me saame. hinnatud ei olnud piisavalt suur, et võimaldada tuvastada erinevusi nende nihkepinge tasemete vahel meie analüüsides. Kuigi on vaja täiendavat uurimist, valgustavad meie tulemused füsioloogiliselt oluliste mudelite jaoks vajalikke tingimusi ja haigusest tingitud suurenenud nihkepinge mõju neerude ravimite käitlemisele.

Üks meie eksperimentaalsete meetodite piiranguid on see, et me käsitlesime transporti ainult pH 7,4 juures, kasutades söödet pH 7,4 nii apikaalsel kui ka basaalküljel, imiteerides eelnevalt hOCT2/hMATE1 MDCK rakkude jaoks kirjeldatud eksperimentaalseid meetodeid (Konig et al.. 2011). Apikaalne kuni basaalne pH-gradient võib mõjutada OCT2 ja MATE1 funktsiooni ning füsioloogilistes tingimustes on tavaliselt pH-gradient (Muller et al., 2013). Seetõttu piirasid meie meetodid meie võimet hinnata apikaalse kuni basaalse pH gradiendi ja OCT2 ja MATE1 funktsioonide nihkepinge vahelist koostoimet. Kuna kasutasime kõigis katsetingimustes ühtlast pH-d 7, 4, ei ole see pH-gradiendi puudumine tõenäoliselt mõjutanud meie tulemusi, kuid see võib potentsiaalselt piirata meie leidude rakendatavust OCT2 ja MATE1 transpordile apikaalse kuni basaalse pH gradiendi juuresolekul.

Üllataval kombel suurenes transfekteeritud inimese ja endogeense OCT2 mRNA ekspressioon rakkudes, mis olid avatud kõikidele nihkepinge tasemetele, võrreldes staatiliste kontrollidega. See transporteri ekspressiooni ülesreguleerimine oli spetsiifiline, ilma mõõdetava mõjuta endogeensele P-GP ekspressioonile ega transfekteeritud MATE1-le. Transporteri ekspressiooni ülesreguleerimine annab ülevaate suurenenud transpordi taga olevast mehhanismist ja võib olla tingitud suurenenud mRNA stabiilsusest või suurenenud mRNA transkriptsioonist. Huvitav on märkida, et nii transfekteeritud kui ka endogeensed transporterid olid ülesreguleeritud, mis on ootamatu, kuna transfekteeritud OCT2 ekspresseeriti tsütomegaloviiruse promootori all ja selle suhtes ei tohiks kehtida endogeensed geeniekspressiooni reguleerivad mehhanismid. Kuigi see tähelepanek on üllatav, pole see enneolematu. On teatatud sarnasest toimest OAT1 transfekteeritud proksimaalsetele tuubulirakkudele, mis on avatud perfusioonile, kuid suurenenud ekspressiooni mehhanism jääb ebaselgeks (Jansen et al., 2016). Teises uuringus leiti, et Nrf2 signaalimine mängib rolli endogeense MATE2-K ekspressiooni suurendamisel vastuseks nihkepingele (Fukuda et al., 2017). Selle edasine uurimine on õigustatud ja see on tulevaste uurimiste objektiks.

Samuti tuvastasime, et apikaalse nihkevoolu kasutuselevõtt suurendas valgusisaldust rakkude ruutsentimeetri kohta. See efekt oli sama ulatusega nii 0,5 kui ka 2 dynes/cm² nihke kohta, sarnane mRNA ekspressiooni ja ASP pluss transpordi puhul täheldatud efektiga. On tõendeid selle kohta, et nihkepinge põhjustab pikemat kasvuneeru-epiteelirakud, mille tulemuseks oleks suurem rakkude maht ruutsentimeetri kohta ja seega tõenäoline valgusisalduse suurenemine ruutsentimeetri kohta; see varem avaldatud nähtus oli siiski vaid väike tähelepanek suuremas andmekogumis ja seda ei olnud kvantifitseeritud (Long et al., 2017). Üldvalgu suurenemine rakkudes, mida kasvatatakse apikaalse nihkevoolu juuresolekul, võib esindada normaalset valgusisaldust terveteleneeru-torukujulineepiteelirakud, mida saab saavutada ainult rakkude kokkupuutel apikaalse nihkevooluga. Seetõttu võib staatilises kultuuris kasvatatud rakkude madalam valgusisaldus kujutada endast ebanormaalset raku seisundit, mis võib kliiniliselt ilmneda madala apikaalse filtraadi voolu korral, nagu äge neerukahjustus. See nähtus väärib edasist uurimist.

Ciliadel on teadaolevalt mehhanosensoorsed rollid proksimaalses tuubulis (Raghavan ja Weisz, 2016). Seetõttu mõõdeti ripsmete eemaldamise mõju transporteri funktsioonile, et teha kindlaks, kas need mängivad siin kirjeldatud suurenenud OCT2 ja MATE{2}}vahendatud transpordis kriitilist rolli. ASP ja transpordi nihkest sõltuva suurenemise täielik blokeerimine ripsmete eemaldamisega meie uuringutes on sarnane Raghavani jt uuringutes leitud toimega. (2014), kes näitasid vastusena vedeliku voolule endotsütoosi ripsmetest sõltuvat ülesreguleerimist. Ammooniumsulfaadil on tõenäoliselt muud iseloomustamata mõjud raku käitumisele ja funktsionaalsusele, mis võivad kaudselt mõjutada lahustunud aine transporti. Vaatamata võimalikele sihtmärgivälistele mõjudele testib see detsiiliatsioonimeetod tsiliaarse tundlikkuse rolli orgaaniliste lahustunud ainete transporteri poolt vahendatud liikumisel. Praegu ei ole teada ripsmete mehaaniliste sensoorsete valkude ja transporteri vahelise signaaliülekande mehhanism. Üks hüpotees on see, et orgaaniliste katioonide transporterite funktsiooni muudab ioonide transport. On teada, et ripsmete eemaldamine muudab proksimaalsetes tuubulite rakkudes lahustunud aine liikuvust, vähendades täpsemalt Nat/K pluss . ATPaasi membraani lokaliseerimine ja paratsellulaarse transpordi modifitseerimine (Overgaard et al., 2009). Võimalik, et see põhjustab muudatusi funktsioonis MATE1, mis on H gradiendist sõltuv antiporter. Teine hüpotees on see, et nihkepinge tuvastamine mõjutab orgaaniliste katioonide transporterite ekspressiooni. Nihkepinge moduleerib MATE{11}}K funktsiooni Nrf2 signaalimise kaudu (Fukuda et al., 2017). Teised orgaanilised katioonide transporterid võivad reageerida sarnaselt nihkepingele, mis mehhaaniliste sensoorsete ripsmete eemaldamisel elimineeritakse. Suur osa sellest on teadmata ja nõuab täiendavat uurimist. Huvitav on see, et ripsmete eemaldamine ei avaldanud olulist mõju ASP-le pluss transpordile rakkude poolt, mis olid avatud nihkepingele 0, 2 dynes / cm², kuid tugevat mõju täheldati, kui nihkepinget suurendati 0, 5 dynes / cm2-ni. See viitab sellele, et ripsmed tajuvad nihkepinge läve; omakorda annavad ripsmed märku muutustest transporteri ekspressioonis ja funktsioonis, enne kui on oodata mõõdetavat mõju transpordile. Üldiselt annab orgaanilise katiooni transpordi sõltuvus nihkepinge tsiliaarsest tajumisest ülevaate mehhaanilise sensoorse signaaliülekande rajast ja minimaalsest stressitasemest, mis võib olla vajalik tugeva reaktsiooni käivitamiseks nihkele.

Kokkuvõttes näitavad need andmed, et vedeliku voolust tulenev nihkepingel on oluline mõju orgaanilise katiooni transporteri funktsioonile ja ekspressioonile MDCK rakkudes. Lisaks sõltus orgaanilise katiooni transpordi ülesreguleerimine ripsmete olemasolust. Teeme ettepaneku, et apikaalne nihkepinge on mis tahes in vitro modelleerimise oluline komponentneeru-torukujulinerakud ja on tõenäoliselt oluline komponent ravimite renaalse sekretoorse kliirensi ja nefrotoksilisuse modelleerimisel. Spetsiifiline mehhanism, mille abil mehaanilised pingesignaalid suurendavad transporteri aktiivsust ja ekspressiooni, on endiselt ebaselge ja vajab täiendavat uurimist.

Viited

Astashkina A, Mann B ja Grainger DW (2012) In vitro rakukultuurimudelite kriitiline hindamine suure läbilaskevõimega ravimite skriinimiseks ja toksilisuseks. Pharmacol Ther, 134:82–106.

Biermann J, Lang D, Gorboulev V, Koepsell H, Sindic A, Schröter R, Zvirbliene A, Pavenstädt H, Schlatter E ja Ciarimboli G (2006) Inimese orgaanilise katiooni transporteri regulatiivsete mehhanismide ja olekute iseloomustus 2. Am J Physiol Cell Physiol 290:C1521–C1531.

Brakeman P, Miao S, Cheng J, Lee CZ, Roy S, Fissell WH ja Ferrell N (2016) Modulaarne mikrofluidiline bioreaktor, millel on täiustatud läbilaskevõime polariseeritud neeruepiteelirakkude hindamiseks. Biomicrofluidics 10:064106.

Duan Y, Weinstein AM, Weinbaum S ja Wang T (2010) Nihkepingest põhjustatud muutused membraani transporteri lokaliseerimises ja ekspressioonis hiire proksimaalsetes tuubulite rakkudes. Proc Natl Acad Sci USA 107:21860–21865.

Ernandez T, Udwan K, Chassot A, Martin PY ja Feraille E (2018) Unioni nefrektoomia ja apikaalse vedeliku nihkepinge vähendavad ENaC arvukust kanali põhirakkude kogumisel. Am J Physiol Renal Physiol 314:F763–F772.

Essig M ja Friedlander G (2003) Tubulaarne nihkepinge ja neerude proksimaalsete torukujuliste rakkude fenotüüp. J Am Soc Nephrol 14 (lisa 1): S33–S35.

Ferrell N, Desai RR, Fleischman AJ, Roy S, Humes HD ja Fissell WH (2010) Mikrofluidiline bioreaktor integreeritud transepiteliaalse elektritakistuse (TEER) mõõteelektroodidega neeruepiteelirakkude hindamiseks. Biotechnol Bioeng 107:707–716.

Ferrell N, Ricci KB, Groszek J, Marmerstein JT ja Fissell WH (2012) Albumiini käitlemine neerutuubulaarsete epiteelirakkude poolt mikrofluidses bioreaktoris. Biotechnol Bioeng 109:797–803.

Ferrell N, Ricci KB, Desai RR, Groszek J, Marmerstein JT ja Fissell WH (2012) Mikrofluidiline bioreaktor epiteelirakkude uurimiseks vedeliku nihkepinge all. FASEB J 26:911.3.

Fukuda Y, Kaishima M, Ohnishi T, Tohyama K, Chisaki I, Nakayama Y, Ogasawara-Shimizu M ja Kawamata Y (2017) Vedeliku nihkepinge stimuleerib MATE2-K ekspressiooni läbi Nrf2 raja aktiveerimise. Biochem Biophys Res Commun 484:358-364.

Giacomini KM, Huang SM, Tweedie DJ, Benet LZ, Brouwer KLR, Chu X, Dahlin A, Evers R, Fischer V, Hillgren KM jt; International Transporter Consortium (2010) Membraanitransporterid ravimiarenduses. Nat Rev Drug Discov 9: 215–236.

Jang KJ, Mehr AP, Hamilton GA, McPartlin LA, Chung S, Suh KY ja Ingber DE (2013) Inimese neeru proksimaalsed tuubulid kiibil ravimite transpordi ja nefrotoksilisuse hindamiseks. Integr Biol 5:1119–1129.

Jansen J, Fedecostante M, Wilmer MJ, Peters JG, Kreuser UM, van den Broek PH, Mensink RA, Boltje TJ, Stamatialis D, Wetzels JF jt. (2016) Biokonstrueeritud neerutuubulid väljutavad tõhusalt ureemilisi toksiine. Sci Rep 6:26715.

Kola I ja Landis J (2004) Kas farmaatsiatööstus võib vähendada kulumise määra? Nat Rev Drug Discov 3:711–715.

König J, Zolk O, Singer K, Hoffmann C ja Fromm MF (2011) Topelttransfekteeritud MDCK rakud, mis ekspresseerivad inimese OCT1/MATE1 või OCT2/MATE1: orgaaniliste katioonide omastamise ja transtsellulaarse translokatsiooni määrajad. Br J Pharmacol. 163:546-555.

Long KR, Shipman KE, Rbaibi Y, Menshikova EV, Ritov VB, Eshbach ML, Jiang Y, Jackson EK, Baty CJ ja Weisz OA (2017) Proksimaalse tuubuli apikaalset endotsütoosi moduleerib vedeliku nihkepinge mTOR-sõltuva raja kaudu. Mol Biol Cell 28:2508-2517.

Maggiorani D, Dissard R, Belloy M, Saulnier-Blache JS, Casemayou A, Ducasse L, Grès S, Bellière J, Caubet C, Bascands JL jt. (2015) Nihkepingest põhjustatud epiteeli organisatsiooni muutus inimese neerutuubulite rakkudes. PLoS One 10:e0131416.

Morrissey KM, Stocker SL, Wittwer MB, Xu L ja Giacomini KM (2013) Neerutransportöörid ravimite väljatöötamisel. Annu Rev Pharmacol Toxicol 53:503–529.

Müller F, König J, Hoier E, Mandery K ja Fromm MF (2013) Orgaanilise katiooni transporteri OCT2 ning mitme ravimi ja toksiini väljapressimise valkude MATE1 ja MATE{3}}K roll viirusevastase lamivudiini transpordi- ja ravimite koostoimetes. Biochem Pharmacol 86:808–815.

Orosz DE, Woost PG, Kolb RJ, Finesilver MB, Jin W, Frisa PS, Choo CK, Yau CF, Chan KW, Resnick MI jt. (2004) Normaalsete täiskasvanud inimese proksimaalsete tuubulite rakkude kasv, immortaliseerimine ja diferentseerumispotentsiaal. In Vitro Cell Dev Biol Anim 40:22–34.

Overgaard CE, Sanzone KM, Spiczka KS, Sheff DR, Sandra A ja Yeaman C (2009) Deciliation on seotud epiteelirakkude ristmike ja pinnadomeenide dramaatilise ümberkujundamisega. Mol Biol Cell 20:102-113.

Peters IR, Peeters D, Helps CR ja Day MJ (2007) Mitme sisemise võrdlusgeeni (majahoidja) analüüsi väljatöötamine ja rakendamine koerte geeniekspressiooni uuringute täpseks normaliseerimiseks. Vet Immunol Immunopathol 117:55–66.

Pfaller W ja Gstraunthaler G (1998) Nefrotoksilisuse testimine in vitro{1}}mida me teame ja mida me peame teadma. Environ Health Perspect 106 (lisa 2): 559–569.

Raghavan V, Rbaibi Y, Pastor-Soler NM, Carattino MD ja Weisz OA (2014) Primaarsete ripsmete vahendatud apikaalse endotsütoosi nihkepingest sõltuv regulatsioon neerude proksimaalsetes tuubulite rakkudes. Proc Natl Acad Sci USA 111:8506-8511.

Raghavan V ja Weisz OA (2016) Mehaanilise sensoorse rolli tuvastamine proksimaalse tuubuli funktsiooni reguleerimisel. Am J Physiol Renal Physiol 310:F1–F5.

Schmittgen TD ja Livak KJ (2008) Reaalajas PCR andmete analüüsimine võrdleva C(T) meetodi abil. Nat Protoc 3:1101–1108.

Sohtell M, Karlmark B ja Ulfendahl H (1983) FITC-inuliin neerutuubulite markerina rottidel. Acta Physiol Scand 119:313–316.

Stevenson BR ja Begg DA (1994) Tsütokalasiin D kontsentratsioonist sõltuv mõju MDCK epiteelirakkude tihedatele ühendustele ja aktiini filamentidele. J Cell Sci 107: 367-375.

Venzac B, Madoun R, Benarab T, Monnier S, Cayrac F, Myram S, Leconte L, Amblard F, Viovy JL, Descroix S jt. (2018) Muutunud läbimõõduga väikeste torude projekteerimine neerurakkude organisatsiooni uurimiseks. Biomicrofluidics 12: 024114.

Watkins PB (2011) Ravimiohutuse teadused ja kitsaskoht ravimite väljatöötamisel. Clin Pharmacol Ther, 89:788–790.

Wieser M, Stadler G, Jennings P, Streubel B, Pfaller W, Ambros P, Riedl C, Katinger H, Grillari J ja Grillari-Voglauer R (2008) hTERT üksi jäädvustab neerude proksimaalsete tuubulite epiteelirakud, muutmata nende funktsionaalseid omadusi. Am J Physiol Renal Physiol 295:F1365–F1375.

Wittwer MB, Zur AA, Khuri N, Kido Y, Kosaka A, Zhang X, Morrissey KM, Sali A, Huang Y ja Giacomini KM (2013) Tugevate, selektiivsete mitme ravimi ja toksiini väljapressimise transporteri 1 (MATE1, SLC47A1) inhibiitorite avastamine retseptiravimite profileerimise ja arvutusliku modelleerimise kaudu. J Med Chem 56:781-795.