Kalmia Angustifolia ekstrakti antioksüdant, põletikuvastane ja vananemisvastane potentsiaal ning mõnede peamiste ühendite tuvastamine, 1. osa

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Abstraktne:Naha vananemine on vananemisprotsessi kõige nähtavam element, mis tekitab paljudele inimestele suurt muret. Ericaceae perekonna taimedel on üldiselt antioksüdantsed ja põletikuvastased omadused, mis muudab need potentsiaalseteks vananemisvastasteks toimeaineteks. Selle uuringu eesmärk oli hinnata Kalmia angustifolia ekstrakti ohutust ja vananemisvastast efektiivsust, kasutades rekonstrueeritud nahaasendajaid. Ohutuse hindamine viidi läbi, kasutades 3-(4,5-dimetüültiasolüül-2)-2,5-difenüültetrasooliumbromiidi (MTT) analüüsi, samas kui tõhusus oli määratakse, hinnates antioksüdantset ja põletikuvastast aktiivsust ning analüüsides isekoostumismeetodil rekonstrueeritud nahaasendajaid histoloogilise ja immunofluorestsentsvärvimise abil (elastiin, kollageen-1, kollageen-3, akvaporiin-3) . Rakkude elujõulisuse test tuvastas ekstrakti ohutuse kontsentratsioonil kuni 200 ug/ml. Hapnikuradikaalide neeldumisvõime (ORAC) test ja rakupõhine test, milles kasutati 2',7'-diklorofluorestseiindiatsetaati (DCFH-DA), näitasid tugevat antioksüdantset aktiivsust ORAC väärtusega 16 μmol Trolox Equivalent/mg ja pool. maksimaalne inhibeeriv kontsentratsioon (IC50) oli 0,37 ± 0,02 ug/mL, samas kui NO tootmise pärssimisel leiti huvitav põletikuvastane toime, kusjuures NO tootmise inhibeerimise protsent oli 49 ± 2 protsenti 80 ug/ml juures. Ekstrakti eraldamine ja iseloomustamine võimaldas tuvastada ühendeid, mis võivad olla nende bioloogiliste aktiivsuste eest vastutavad, kusjuures kaks neist tuvastati esmakordselt K.cistanche varsAngustifolia: avikularia ja epikatehiin-(2 -O-7, 4 -6)-ent-epikatehiin. Ekstraktiga töödeldud nahaasendajate histoloogilised analüüsid näitasid naha paksuse suurenemist võrreldes kontrollidega. K. Angustifolia ekstrakt suurendas elastiini ja kollageeni ekspressiooni-1, mis tavaliselt vähenevad koos naha vananemisega. Need tulemused viitavad sellele, et K. Angustifolial on paljulubav antioksüdantne efektiivsus ja vananemisvastane potentsiaal.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Märksõnad: nahaasendajad; naha vananemine; looduslikud tooted; aktiivsed koostisosad; Lamba loorber; antioksüdantne aktiivsus; põletikuvastane toime; koetehnoloogia

1. Sissejuhatus

Naha vananemine on paljudele inimestele muret tekitav loomulik füsioloogiline protsess. See on esimene "nähtav märk vananemisest ja naha degeneratsioonist. Seega on vananemisvastaste kosmeetikatoodete koostis viimastel aastatel muutunud olulisemaks tänu soovile piirata seda vananemise ilmingut. Naha vananemist iseloomustab mitmed muutused bioloogilisel tasemel, mis hõlmavad rakkude proliferatsiooni vähenemist, mille tulemuseks on epidermise atroofia, ja nahakomponentide, nagu fibroblastide ning elastiini ja kollageenkiudude vähenemine ning seega naha paksuse vähenemine vanematel täiskasvanutel [1,2] Boreaalne mets on täis uurimata ressursse, millel on suur potentsiaal kosmeetiliste toimeainete arendamiseks.Kalmia angustifolia, tuntud ka kui lamba-loorber, on ericaceae perekonda kuuluv katteseemneline taim.cistanche tubulosa eelised ja kõrvaltoimedSee taim on pärit Põhja-Ameerika idaosast, kuid seda leidub peamiselt Kanada boreaalsetes metsades [3]. Traditsioonilises indiaanimeditsiinis kasutati K. Angustifoliat mitmesuguste põletikuliste terviseprobleemide, nagu kõhuvalud, nikastused ja tursed, raviks. mis viitab sellele, et sellel taimel on põletikuvastased omadused [4]. Erinevatel Ericaceae perekonna taimedel on ka põletikuvastased ja antioksüdantsed omadused, mistõttu on need huvitavad kosmeetilised toimeained. K.angustifolia keemiline koostis ei ole veel hästi dokumenteeritud. Mõned uuringud on tuvastanud mürgiseid ühendeid, nagu grayanotoksiinid, mis on allaneelamisel inimestele mürgised, kuid harva surmavad, ja arbutiin (4-hüdroksüfenüül-D-glükopüranosiid), türosinaasi inhibiitor, mida leidub K. Angustifolia lehtedes. ja kasutatakse depigmenteeriva ainena [5-8]. Hoolimata nendest K. Angustifolias leitud potentsiaalselt mürgistest ühenditest on ka teised uuringud kindlaks teinud, et taimes leidub rohkesti flavonoide, fenoolhappeid, tanniine ja terpeene [9-15]. Mõnel neist ühenditest on huvitav bioloogiline toime ja need võivad seetõttu anda K. Angustifoliale paljulubava vananemisvastase toime, nagu ka teiste taimede puhul.

Cistanche on vananemisvastane toime

Isegi kui on vaja välja töötada uusi dermokosmeetilisi tooteid, mis aitavad vältida naha vananemist, muudavad uued seadused, mis keelavad või piiravad loomkatseid kosmeetikatööstuses, selle tegemise keerulisemaks. Seetõttu on toote tõhususe testimiseks vaja muid võimalusi. In vitro rakukultuuride või nahaasendajate kasutamine on hea alternatiiv kosmeetikatoodete koostisainete skriinimiseks. Mitmed mudelid on heaks kiidetud Euroopa Alternatiivsete Meetodite Valideerimise Keskuses (ECVAM, Ispra, Itaalia) ja neid müüakse kaubanduslikult kosmeetikaettevõtetele, et nad saaksid läbi viia ohutusteste ja vältida loomade kasutamisega kaasnevaid tarbetuid kannatusi [16,17] . Kuid enamikul kaubanduslikult saadaolevatel mudelitel on ainult diferentseeritud epidermis ja neil puudub koostoime keratinotsüütide ja fibroblastide vahel [16]. Viimastel aastatel on ilmunud uued täispaksusega mudelid, mis on muu hulgas võimaldanud uurida vananemisradu ja vananemisvastaseid ühendeid, muutes need kasulikeks vahenditeks loomade kasutamise asendamiseks kosmeetika valdkonnas [18, 19].cistanche tubulosa ekstraktSelle uuringu eesmärk oli esmalt hinnata K. Angustifolia ekstrakti bioloogilist aktiivsust kultiveeritud rakkude monokihtidel ja seejärel hinnata selle ekstrakti vananemisvastast potentsiaali, kasutades nahaasendajaid, mis on rekonstrueeritud isekoostumismeetodi järgi [20,21]. . Selle nahaasendusmudeli tugevus seisneb selles, et see ei sisalda eksogeenseid materjale ja tugineb askorbiinhappe võimele soodustada naha fibroblastide rakuvälise maatriksi tootmist, muutes mudeli täielikult inimeseks.cistanche tubulosa ülevaatedSee uuring tutvustab uut toimeainet, mida saaks kasutada dermokosmeetikatoodetes, ja soovitab kasutada in vitro mudeleid alternatiivina kosmeetikauuringutes.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Taimse materjali ja ekstrakti valmistamine

K.angustifolia koristati 2015. mail Kanadas Quebecis Lac-St-Jeani piirkonnas. Taime tuvastas M. Patrick Nadeau ja kviitungi näidis (nr QFA0617265) deponeeriti Kanadas Ouébecis asuvas Lavali ülikooli Louis Marie herbaariumis. K.angustifolia (2,1 kg) õhust osad jahvatati Fritsch Pulverisette 25 Cutting Milliga (Fritsch, Laval, QC, Kanada) ja ekstraheeriti püstjahuti all veevaba etanooliga (1,5 l, kolm korda) ja EtOH-H2O3:1 ( 1,5 l, kaks korda). Pärast esimesi ekstraheerimisi (EtOH-s ja EtOH-H, O) saadud ekstraktid filtriti ja ühendati. Pärast EtOH aurustamist vaakumis jaotati vesifaas diklorometaaniga (DCM, CHCl; 300 ml, viis korda) ja etüülatsetaadiga (EtOAc; 300 ml, viis korda). EtOAc faas aurustati alandatud rõhul kuivaks, et saada K.angustifolia ekstrakt (222,6 g, 10,6 protsenti). Päev enne töötlemist lahustati pulbri kujul olev ekstrakt põhilahuse saamiseks dimetüülsulfoksiidis (DMSO; Sigma, Oakville, ON, Kanada) ja säilitati seejärel -20 kraadi juures kuni vajaduseni. K.angustifolia soovitud kontsentratsioonid saadi põhilahuse (12,5 või 25 mg/ml) lahjendamisel otse söötmes katsepäeval. DMSO lõppkontsentratsioon oli 0,2 protsenti (ofo), et vältida lahusti toksilisust.

2.2.K. Angustifolia ekstrakti peamiste ühendite eraldamine

Eelnevalt kirjeldatud EtOAc ekstraktist eraldati 30 g kromatograafiaga diaionkolonnis (Mitsubishi Chemicals, Charlotte, NC, USA), kasutades gradiendi tingimustes eluendina MeOH/H2O (40 protsenti). , 50 protsenti , 60 protsenti , 70 protsenti ja 100 protsenti ), et saada neli rikastatud fraktsiooni (AD). Fraktsioon B (2 g) allutati silikageelikolonnis (200 g) ja elueeriti MeOH-DCM gradienditingimustega 5% kuni 15%, et saada neli fraktsiooni (B1-B4). Fraktsioon C (6 g) töödeldi samuti silikageelikolonnis (300 g) ja elueeriti MeOH-DCM gradienditingimustega 5% kuni 25%, et saada seitse fraktsiooni (C1-C7). Fraktsioon C3 (500 mg) puhastati pöördfaasikromatograafiaga C18 kolonnis (120 g, FLH-R33230B-IS120 SiliaSepTM C18, Silicycle, Quebec, QC, Kanada), kasutades 0,1% sipelghapet H, O-MeOH-s. 40 protsenti kuni 60 protsenti. Saadi neli alamfraktsiooni: C3A-C3D koos C3B-ga ja C3C kõrge puhtusastmega, mis sisaldasid peamisi ühendeid. Fraktsioon C4 (2g) puhastati ka pöördfaasikromatograafiaga C18 kolonnis, kasutades 0,1% sipelghapet H2O-MeOH-s 30% kuni 45%. Eraldamisel saadi kolm alafraktsiooni: C4A-C4C, kõrge puhtusastmega C4A ja C4C, millest igaüks sisaldas ühte ühendit. Fraktsioon D (8,7 g) viidi silikageelkolonnidesse (2 × 200 g) ja elueeriti CHCl3-MeOH gradienditingimustega (15:1; 10:1; 5:1), et saada kaheksa fraktsiooni (D). 1-D8). Fraktsioonid D1 kuni D4 kujutasid igaüks peamist ühendit.

2.3. NMR ja GC-MS analüüs

Tuumamagnetresonantsi (NMR) spektrid registreeriti Bruker Avance 400 spektromeetriga (Bruker, Milton, ON, Kanada) sagedusel 400 MHz'H tuumade ja 100 MHz 13C tuumade jaoks, kasutades deutereeritud kloroformi (CDCl3) või deutereeritud metanooli (CH3OD) lahustina. Keemilised nihked on esitatud ppm-des lahusti jääkpiigi suhtes. Kõrge eraldusvõimega massispektromeetria (HRMS) registreeriti massispektromeetril Agilent 6224 MS-TOF (Agilent, Saint-Laurent, QC, Kanada), mis oli varustatud elektropihustusallikaga.

2.4. Biopsiad ja rakkude ekstraheerimine

Primaarsed keratinotsüüdid ja fibroblastid saadi rindade vähendamise operatsioonide biopsiatest. Doonorid olid 18–52-aastased kaukaasia naised. Keratinotsüüdid ja fibroblastid ekstraheeriti biopsiatest, kasutades eelnevalt kirjeldatud isoleerimismeetodit [22, 23]. Biopsiaid inkubeeriti termolüsiinis 4 kraadi juures 16 tundi, et eraldada epidermis pärisnahast. Seejärel eraldati keratinotsüüdid epidermisest trüpsiini abil 30 minuti jooksul, samas kui fibroblastid eraldati dermisest kollagenaasi abil 4 tunni jooksul. Seejärel kultiveeriti rakke soovitud passaažini. Läbisõidul 1 kasutati keratinotsüüte ja 4. passaažil fibroblaste.

2.5. Rakukultuur

Primaarsed fibroblastid (passaaž 4) külvati 4 × 103 rakku/cm² ja kultiveeriti Dulbecco modifitseeritud Eagle Mediumis (DMEM), millele oli lisatud 10 protsenti FB Essence'i seerumit (FBI; Seradigm, Salt Lake City). , UT, USA), 100 UI/ml penitsilliini G (Sigma, Oakville, ON, Kanada) ja 25 ug/ml gentamütsiini (Gemini, West Sacramento, CA, USA). Primaarsed keratinotsüüdid (passaaž 1) külvati 4 × 103 rakku/cm² kiiritatud 3T3 hiire fibroblastide toitekihile ja kultiveeriti DMEM-i ja Ham's F12 kombinatsioonis vahekorras 3:1 (DMEMH), millele oli lisatud 5 protsenti lootekloonit. Ⅱ seerum (Hyclone, Scarborough, ON, Kanada), 5 ug/ml insuliini (Sigma, St. Louis, MO, USA), 0,4 ug/mL hüdrokortisoon (Galen-ova, Saint-Hyacinthe, QC, Kanada), 0,212 ug /mL isoproterenoolvesinikkloriid (Sandoz Kanada, Boucherville, QC, Kanada), 10 ng/ml inimese epidermise kasvufaktor (EGF; Austral Biological, San Ramon, CA, USA), 100 UI/ml penitsilliin G (Sigma, Oakville, ON, Kanada) ) ja 25 ug/ml gentamütsiini (Gemini, West Sacramento, CA, USA). Rakukultuure inkubeeriti 37 °C juures 8% süsinikdioksiidi (CO2) atmosfääris. Rakukultuuri söödet vahetati iga kahe päeva järel, kokku kolm korda nädalas.

2.6. Tsütotoksilisuse test

K.angustifolia ekstrakti toksilisust hinnati primaarsetel keratinotsüütidel, kasutades {{0}}(4,5-dimetüültiasolüül-2)-2,{{5} }difenüültetrasooliumbromiidi (MTT) analüüs. MTT test on kolorimeetriline test, mis põhineb kollase tetrasooliumisoola (MTT) ensümaatilisel redutseerimisel lilladeks formatsaani kristallideks. Seda ensümaatilist reaktsiooni katalüüsib metaboolselt aktiivsetes rakkudes mitokondriaalne suktsinaatdehüdrogenaas. Seega kasutatakse seda rakkude elujõulisuse hindamiseks raku metaboolse aktiivsuse alusel. Lühidalt, päeval 0 kanti tervete doonorite P3 keratinotsüüdid tihedusega 5 × 103 rakku süvendi kohta 96-süvendiplaadile kiiritatud 3T3 hiire fibroblastide toitekihile. 2. päeval lisati ravi. 4. päeval lisati plaadile MTT värvaine (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide, Sigma, St. Louis, MO, USA) kontsentratsioonis 0,5 mg/ml steriilses fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS) 1x. Seejärel inkubeeriti plaati 3 tundi (37 kraadi, 8 protsenti CO) ja formazaan ekstraheeriti värske isopropanooli ja vesinikkloriidhappe (HCl) lahusega. Neelduvust loeti lainepikkusel 570 nm, kasutades mikroplaadilugejat (SpectraMax Plus 384 Microplate Reader, Molecular Devices, San José, CA, USA). 2.7. Hapnikuradikaalide neeldumisvõime (ORAC) test

K.angustifolia ekstrakti antioksüdantsete omaduste hindamiseks viidi läbi hapnikuradikaalide neeldumisvõime (ORAC) test, nagu on kirjeldanud Ou et al. mõningate muudatustega [24]. Lühidalt öeldes viidi analüüs läbi 384-süvendiplaadil Fluoroskan Ascent FLTM plaadilugejaga (Labsystems, Milford, MA, USA). Erinevates kontsentratsioonides Troloxi (6-hüdroksü-2,5,7,8-tetrametüülkromaan-2-karboksüülhape; E-vitamiini analoog) valmistati ette standardkõver. testitavate proovide võrdlemiseks selle positiivse kontrolliga. Katse viidi läbi temperatuuril 37,5 kraadi ja pool 7,4 paralleelselt tühja prooviga.cistanche UKFluorestseiini fluorestsentsi registreeriti iga 60 sekundi järel fluoromeetriga pärast 2,2'-asobis(2-amidinopropaan)divesinikkloriidi lisamist. Fluorestsentsi mõõdeti ergastuse lainepikkusel 485 nm ja emissiooni lainepikkusel 538 nm. Tulemused arvutati, kasutades tühikatse ja proovikõvera fluorestseiini lagunemise all olevate alade erinevusi. ORAC väärtuste tulemused väljendati mikromoolides Troloxi ekvivalenti (TE) milligrammi μmol TE/mg kohta või mikromoolides TE mikromooli kohta (umol TE/mol).

2.8. Antioksüdandi aktiivsust hinnati rakupõhise analüüsi abil

Antioksüdantset aktiivsust hinnati rakupõhise analüüsiga, kasutades 2',7/-diklorofluorestseiindiatsetaati (DCFH-DA), nagu on kirjeldanud Girard-Lalancette jt koos mõningate muudatustega [25]. Lühidalt, inimese naha WS1 fibroblaste (ATCC⑧ CRL-1502, Manassas, VA, USA) inkubeeriti 60 minutit 100 μL 5 µM DCFH-DA-ga Hanksi tasakaalustatud soolalahuses (HBSS, HyClone, Marlborough, MA, USA) . Seejärel, et hinnata ekstrakti antioksüdantset aktiivsust, inkubeeriti rakke 60 minutit K.angustifolia ekstrakti ja positiivsete kontrollide (kvertsetiin ja Trolox) kasvavate kontsentratsioonidega. Oksüdatiivse stressi korral lisati 100 μl 400 μM tertbutüülhüdroperoksiidi (t-BuOOH), et saada süvendites lõppkontsentratsiooniks 200 μM t-BuOOH. Seejärel mõõdeti fluorestsentsi kohe ja 90 minuti pärast, kasutades automaatset Fluoroskan Ascent FLTM plaadilugejat (Labsystems, Milford, MA, USA). Fluorestsentsi hinnati ergastuse lainepikkusel 485 nm ja emissiooni lainepikkusel 538 nm. Antioksüdantne aktiivsus väljendati DCFH oksüdatsiooni inhibeerimise protsendina.

2.9. Põletikuvastane toime, hinnatud nitriti kvantifitseerimisega

Põletikuvastast toimet hinnati lämmastikoksiidi (NO) tootmise pärssimise hindamisega K.angustifolia ekstrakti poolt, nagu on kirjeldanud Legault et al. [26]. Lühidalt, hiire makrofaage RAW 264.7 (ATCC⑧ TIB-71, Manassas, VA, USA) inkubeeriti kasvavate kontsentratsioonidega K. Angustifolia ekstraktiga ja seejärel stimuleeriti 100 ng/mL lipopolüsahhariidiga (LPS). Positiivset kontrolli, Nw-nitro-L-arginiini metüülestri vesinikkloriidi (L-NAME), kasutati ka kahes erinevas kontsentratsioonis – 250 µM (67 ug/mL) ja 1 mM (270 ug/mL). Rakuvabad supernatandid koguti 24 tundi pärast LPS-stimulatsiooni ja NO kontsentratsiooni hinnati kohe Griessi reaktsiooni abil. Neeldumist loeti lainepikkusel 540 nm, kasutades Multiskani plaadilugejat (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Nitriti olemasolu määrati NaNO standardkõvera abil. Inaktiveeritud rakke (ainult söötmega eksponeeritud) kasutati negatiivse kontrollina ja aktiveeritud rakke positiivse kontrollina.

2.10.Nahaasendajate tootmine

Terved nahaasendajad valmistati isekokkupanemise meetodil, mida osaliselt muudeti 6-süvendiplaatide [20,21] abil. Lühidalt, tervete doonorite P5 fibroblastid külvati tihedusega 1,5 × 105 rakku süvendi kohta ja kultiveeriti 26 päeva DMEM-is, millele oli lisatud 50 ug/ml (pluss)-naatrium-L-askorbaati (Sigma, St. Louis, MO, USA). kuni moodustasid manipuleeritavad lehed. Seejärel eraldati kaks fibroblasti lehte ja asetati üksteise peale, et moodustada naha ekvivalent. Nahaekvivalente inkubeeriti 37 kraadi juures 8% CO atmosfääris veel kaks päeva, et võimaldada lehtede sulandumist ja seega moodustada nahaasendajate uus dermaalne kiht. Pärast seda perioodi külvati tervete doonorite P2 keratinotsüüdid nahaekvivalendile 1 × 10 kraadi rakud/ekvivalent, et moodustada nahaasendajate epidermaalne kiht ja kultiveeriti seitse päeva DMEMH-s, millele oli lisatud 50 ug/ml (pluss) -naatrium-L-askorbaat (Sigma, St. Louis, MO, USA), et võimaldada keratinotsüütide proliferatsiooni. Seejärel tõsteti nahaasendajad õhu-vedeliku liidesele, et soodustada rakkude diferentseerumist. Õhu-vedeliku liidesel kultiveeriti nahaasendajaid söötmega, milles puudus EGF, et saada kihistunud epiteel, mis esindab in vivo nahka. Neliteist päeva pärast õhu-vedeliku piirpinnale tõstmist töödeldi nahaasendajaid kolm korda nädalas ühe nädala jooksul kultuurisöötmes (K. Angustifolia ekstrakti lõppkontsentratsiooniga 25 ug/ml) lahjendatud ekstrakti põhilahusega. Pärast kokku 56-päevast kultiveerimist võeti nahaasendusbiopsiad ja analüüsiti histoloogia ja immunofluorestsentsvärvimisega.

2.11. Histoloogilised analüüsid

Iga seisundi nahaasendusbiopsiad fikseeriti HistoChoice'i lahuses (Amresco, Solon, OH, USA) ja sisestati parafiinvahasse. Seejärel lõigati 5 μm paksused lõigud ja värviti Massoni Trichrome'iga, kasutades Weigerti hematoksüliini, fuchsin-ponceau ja aniliinsinise värvaineid. Dermise ja elava epidermise paksust mõõdeti ImageJ tarkvaraga (National Institutes of Health (NIH), Bethesda, MD, USA). Paksuse mõõtmiseks analüüsiti kolme erinevat rakupopulatsiooni ja igaühe kohta tehti kaks tüüpilist pilti seisundi kohta ja 10 mõõtmist pildi kohta kokku 60 mõõtmise kohta seisundi kohta.

2.12. Immunofluorestsentsvärvimine

Iga seisundi nahaasendusbiopsiad sisestati Tissue-Tek OCT ühendisse (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA), külmutati vedelas lämmastikus ja hoiti seejärel -80 kraadi juures kuni vajaduseni. Positiivse kontrollina kasutati normaalse inimese naha külmutatud lõike. Kaudne immunofluorestsentsvärvimine viidi läbi atsetoonis fikseeritud 6 um paksustel krüosektsioonidel. Peamised kasutatud antikehad olid: küüliku polüklonaalne anti-elastiin (gG) (lahjendus 1:800, Abcam, Cambridge, MA, USA), küüliku polüklonaalne anti-kollageen-1 (IgG) (lahjendus 1:300, Cedarlane, Burlington, ON, Kanada), küüliku polüklonaalne anti-kollageen-3 (IgG) (lahjendus 1:200, Cedarlane, Burlington, ON, Kanada) ja küüliku polüklonaalne anti-akvaporiin-3(IgG) (lahjendus 1:500, Abcam, Cambridge, MA, USA). Sekundaarne antikeha oli eesli küülikuvastane IgG (H pluss L)Alexa 488 (lahjendus 1:1600, Life Technologies, Eugene, OR, USA). Rakkude tuumad märgistati pärast sekundaarset antikeha kinnitussöötmega DAPI Fluoromount-G (SouthernBiotech, Birmingham, AL, USA). Iga valgu fluorestsentsi intensiivsuse poolkvantifitseerimiseks mõõdeti ImageJ tarkvara abil (National Institutes of Health (NIH), Bethesda, MD, USA) immunofluorestsentsvärvimise pikslite intensiivsust. Lühidalt, kogu uuritud valgu nahakihti (dermis või elav epidermis) analüüsiti, mõõtes iga piirkonna keskmist halli väärtust. Töödeldud nahaasendajate fluorestsentsi intensiivsust võrreldi kontrollnahaasendajate fluorestsentsi intensiivsusega, et hinnata ravi käigus täheldatud valgu ekspressiooni muutust.

2.13. Statistiline analüüs

Tulemused väljendati kui keskmine ± standardhälve. MTI testi, antioksüdantsete rakupõhise analüüsi ja põletikuvastase toime statistiline analüüs viidi läbi ühesuunalise dispersioonanalüüsiga (ANOVA), millele järgnes Dunnetti post hoc test (p-väärtus).<0.05 compared="" to="" control="" at="" 0="" μg/ml）="" or="" a="" bonferroni's="" post="" hoc="" test=""><0.05 compared="" to="" controls).="" thickness="" measurements="" were="" analyzed="" with="" a="" t-test.="" results="" were="" considered="" significant="" when=""><0.05. statistical="" analyses="" were="" performed="" with="" r="" software="" (v3.5.2,="" rcmdr="" v2.5-1,="" r-core="" team="" 2018,="" r="" foundation,="" vienna,="">

See artikkel on välja võetud ajakirjast Antioxidants 2021, 10, 1373. https://doi.org/10.3390/antiox10091373 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants