Erinevate kurkumiliikide türosinaasivastased omadused ja Curcuma Amada aktiivsete ühendite eraldamine

Jesmin Akter1 ● Md. Zahorul Islam1,2 ● Md. Amzad Hossain1 ● Kensaku Takara1

1 Põllumajandusteaduskond, Ryukyuse ülikool, Okinawa, Jaapan

2 Farmakoloogia osakond, veterinaarteaduskond, Bangladeshi põllumajandusülikool, Mymensingh, Bangladesh

Rohkem informatsiooni:Scotty.Wang@wecistanche.com

Abstraktne

Kurkumit kasutatakse India subkontinendil traditsiooniliselt nahakosmeetikana mõnel religioossel ja kultuurilisel üritusel. Selles uuringus võrreldi nelja Curcuma spp., nimelt C. xanthorrhiza, C. aromatic, C. amada ja C. zedoaria türosinaasi inhibeerivaid omadusi. Türosinaasi inhibiitorite biotesti juhitud eraldamine ja puhastamine, kasutades silikageelikolonni ja kõrgfektiivset vedelikkromatograafiat. Ühendite struktuurne identifitseerimine viidi läbi, kasutades1H NMR,13C

NMR ja vedelikkromatograafia-tandem-massispektromeetria. C. amada näitas suurimat türosinaasi inhibeerivat aktiivsust IC50 väärtusega 53,4 ug/ml. Seetõttu valiti see türosinaasi inhibiitorite eraldamiseks ja puhastamiseks. Puhastatud ühendid olid sederoon (1), furanodienoon (2), 1,5-epoksü-3-hüdroksü-1-(3,4-dihüdroksü-5-metoksüfenüül){ {13}}(4-hüdroksüfenüül)heptaanid (3), 3,5-dihüdroksü-1-(3,4-dihüdroksüfenüül)-7-({{22 }}hüdroksü-3-metoksüfenüül)heptaanid (4) ja 1,5- epoksü-3-hüdroksü-1-(3,4-dihüdroksü-5-metoksüfenüül) -7-(4-hüdroksü-3-metoksüfenüül)heptaanid (5). Seene IC50 väärtusedtürosinaasi vastaneühendite 1, 2, 3, 4 ja 5 aktiivsus oli vastavalt 108,2, 89,2, 92,3, 21,7 ja 41,3 uM. Need ühendid inhibeerisid ka rakusisest türosinaasi aktiivsust, vähendades seega melaniini sünteesi B16F10 melanoomirakkudes. Ühend 4 oli oluliselt tugevamtürosinaasi vastaneaktiivsust kui arbutiinil (positiivne kontrollravim). Türosinaasi inhibeerivas toimes ühendi 5 ja arbutiini vahel olulist erinevust ei täheldatud. Meie leiud viitavad kindlalt sellele, et C. Amanda on paljulubav looduslike türosinaasi inhibiitorite allikas melanogeneesi ennetamiseks ja seda võiks kasutada valgendava kosmeetikavahendina.

Märksõna: Curcuma amada ● Aktiivsed ühendid ● NMR ● Anti-türosinaas ● Antimelanogeenne

Clakkuda Cistanche'i türosinaasi vastu

Sissejuhatus

Melaniin on juuste ja naha must pigment ning see on oluline naha kaitsmiseks UV-kiirguse eest. Pigmenti toodavad melanotsüütide rakud, mis esinevad dermise basaalkihis füsioloogilise protsessi kaudu, mida nimetatakse melanogeneesiks. Melaniini ebanormaalne tootmine põhjustab aga dermatoloogilisi häireid, nagu tedretähnid, melasma, lentigiinid, vanuselaigud, efeliidid ja põletikujärgne hüperpigmentatsioon [1]. Toiduainetööstuses põhjustab puu- ja köögiviljade hüperpigmentatsioon toiteväärtuse ja turuväärtuse märkimisväärset langust [2]. Melanogeneesi saab kontrollida türosinaasi, imetajate, taimede, mikroorganismide ja seente melaniini sünteesi kiirust piirava ensüümi aktiivsuse pärssimisega [3]. Seetõttu hoiab türosinaasi aktiivsuse pärssimine ära hüperpigmentatsiooni ja viib naha valgenemiseni. Samuti kontrollib see köögiviljade ja puuviljade kvaliteeti, reguleerides köögiviljade ja toidu soovimatut pruunistumist. Enamik nahka valgendavaid aineid, nagu hüdrokinoon, aselaiinhape, kojiinhape ja arbutiin, on tugevad türosinaasi inhibiitorid. Siiski on neil mitmesuguseid soovimatuid toimeid, nagu tsütotoksilisus, okronoos, vitiliigo, ärritus, naha koorumine ja punetus [4]. Veelgi enam, kojic hape ja -arbutin näitavad halba koostise stabiilsust ja naha läbimisvõimet ning madalat efektiivsust in vivo [5]. Mõned orgaanilised ja anorgaanilised elavhõbeda soolad on melanogeense toimega ja neid kasutatakse nahka valgendavates ainetes. Naha kaudu imendumisel võivad elavhõbedaühendid aga põhjustada toksilisi mõjusid, nagu naha värvimuutus, neerukahjustus, allergiline reaktsioon ja armistumine [6]. Seega on vaja uurida vähemtoksilisi ja tõhusamaid türosinaasi inhibiitoreid. Kurkum (sugukond: Zingiberaceae; perekond: Curcuma), traditsiooniline ravimtaim, mis kasvab valdavalt Aasia ja Aafrika troopilistes ja subtroopilistes piirkondades, omab laia farmakoloogiliste funktsioonide spektrit. Seda on India subkontinendil traditsiooniliselt kasutatud abielueelsetes rituaalides tuhandeid aastaid nahka valgustava ainena. Arvatakse, et kurkum parandab naha jumet, vähendades näo juuste kasvu, aknet ja naha vananemist [7, 8]. Seetõttu on kurkumiga täiendatud nahahooldustooted turul müügil [9]. Tuvastatud on üle 70 erinevate keemiliste ja farmakoloogiliste omadustega kurkumi liigi/sordi. Siiski puudub teaduslik teave erinevate kurkumiliikide melanogeensete omaduste ja kurkumis sisalduvate potentsiaalsete aktiivsete komponentide kohta. Kurkuminoidid on peamised aktiivsed ühendid, mis vastutavad enamiku kurkumi bioloogiliste aktiivsuste eest. Kurkuminoididel on potentsiaali kosmeetikatoodetesantioksüdant, põletikuvastane,ja nahka helendav aine [7, 8]. Samas leidsime ühes varasemas uuringus kurkumis kurkuminoidisisalduses olulisi erinevusi ja mõned liigid (C. amada, C. zedoaria) ei sisaldanud isegi kurkumiini [10]. Teatasime ka seenevastasest,antioksüdantja kurkumi erinevate liikide ja sortide veresooni laiendav toime [10–13]. Seetõttu oli selle uuringu eesmärk hinnata erinevate kurkumiliikide, nimelt C. xanthorrhiza, C. aromatica, C. amada ja C. zedoaria mõju türosinaasi ensüümile ja teha kindlaks spetsiifilised keemilised ühendid, mis põhjustavad kurkumit.türosinaasi vastanetegevust. Samuti hindasime puhastatud toimeainete türosinaasi inhibeerivat aktiivsust ja melanogeenset toimet melaniini sünteesile B16F10 melanoomirakkudes.

Tulemused ja arutlus

Nelja erineva kurkumiliigi hulgas näitas C. amada MeOH ekstrakt maksimaalset seente türosinaasi inhibeerivat toimet IC50 väärtusega 53,4 ± 2,7, millele järgnesid C. xanthorrhiza, C. aromatic ja C. zedoaria (joonis 1a). Kurkumiin on kurkumi (Curcuma longa) peamine aktiivne komponent ja sellel on lai valik bioloogilisi toimeid, sealhulgas vähivastane, põletikuvastane, antibakteriaalne, seenevastane ja antioksüdantne toime. See näitas 75-korda tugevamat türosinaasivastast toimet kui arbutiin ja kojhape [14]. Eelmises uuringus teatasime aga, et kurkumiini sisaldus varieerus erinevates kurkumiliikides [10].

Kurkumiin esines C. xanthorrhiza ja C. aromaatsete puhul, kuid puudus C. zedoaria ja C. amada puhul [10]. Selle uuringu huvitavad järeldused on, et ilma kurkumiinita näitas C. amada tugevat türosinaasi inhibeerivat toimet. See tulemus näitab, et mõned C. amada aktiivsed ühendid peavad olema tingitud selle tugevast türosinaasivastasest toimest. C. xanthorrhiza ja C. aromatica türosinaasivastane toime võib olla tingitud nende kurkumiinisisaldusest. Siiski ei saanud me välistada ka teiste ühendite olemasolu. C. amada MeOH ekstrakt fraktsioneeriti vee, n-heksaani ja EtOAc-ga. Nende kolme fraktsiooni hulgas näitas EtOAc oluliselt tugevamat inhibeerivat toimet kui vesi ja n-heksaan (joonis 1b). Seetõttu võeti EtOAc osa edasiseks fraktsioneerimiseks. Kuue fraktsiooni türosinaasivastane toime [n-heksaan:EtOAc; 100:0 (F1), 80:20 (F2), 60:40 (F3), 40:60 (F4), 20:80 (F5) ja 0:100 (F6)] võrreldi C. amada EtOAc osast. Nende kuue fraktsiooni hulgas näitasid F6 ja F3 oluliselt kõrgemat türosinaasivastast aktiivsust kui teised (joonis 1c). Seejärel tuvastati fraktsioonide F3 ja F6 viie ühendi keemilised struktuurid nende1H NMR ja13C NMR spektrite järgi. Tippandmed olid järgmised:

Ühend 1:

värvitu nõelakujuline kristall; UV λmax: nm 234, 285. ESI-MS (pluss) m/z: 247,3 [M pluss H] pluss, 229,4 [M pluss H-H2O] pluss. 'H-NMR (CD3OD): 8 7,22 (1H, s, H{15}}), 5,59 (1H, br d, J=12 Hz, H{{2{86}}}}) 3,99 (IH, s, H{24}}), 3,85 (1H, d, J=16 Hz, H-9a), 3,69 (1 H, d, J=16 Hz, H-9b), 2,57 (1 H, dddd, J=13, 13, 12, 4 Hz, H-2a), 2,26 (1 H, m, H{{46) }}a), 2,20 (1H, m, H{{50}}b), 2,09 (3H, s, H-13), 1,57 (3H, s, H-15), 1,32 (1 H, ddd, J=13, 13, 4 Hz, H-3b), 1,28 (3H, s, H{69}}). 13C-NMR (CD3OD): 8 194,2 (C{75}}) 160,2 (C{78}}), 139,7 (C12), 132,8 (C{84}}), 132,0 (C{87}}). ), 124,3(C{90}}), 123,0(C{93}}), 67,8(C{96}}), 65,2(C{90}}), 42,5(C{102}} ), 39,0 (C{105}}), 25,4 (C-2), 15,7 (C-15), 15,4(C-14), 10,7(C{117}} ) (täiendavad andmed). Nende andmete võrdlemisel kirjanduses avaldatutega [15, 16] tuvastati, et aine on zederoon (joonis 2). See on seskviterpeen, mis eraldati varem C. amadast ja C. zedoariast ning selle valuvaigistava, põletikuvastase, seenevastase ja tsütotoksilise toime tõttu [12, 17–20].

Ühend 2:

Värvitu õli; UV λmax: nm 243, 280. ESIMS (pluss) m/z: 231.{83}} [M pluss H] pluss, 223,3 [M pluss H-H2O] pluss. 'H-NMR (CD3OD): 8 7,16 (1 H, s, H{14}}), 5,83 (1H, s, H{18}}), 5,21 (1 H, dd, J=12 Hz , 5 Hz, H-1), 3,73 (1H, d, J=16 Hz, H-9a), 3,63 (1H, d, J=16 Hz, H -9b), 2,45 (1 H, ddd, J=15 Hz, 11 Hz, 4 Hz, H-3a), 2,31 (1 H, m, H-2a ), 2,2 0 (1H, dddd, J=12 Hz, 12 Hz, 12 Hz, 4 Hz, H-2b), 2,06 (3H, s, H{{57} }), 1,92 (3H, s, H{61}}), 1,89 (1H, m, H-3b), 1,25 (3H, s, H{69}}). 13C-NMR (CD3OD): 8 191,8 (C{75}}), 158,6 (C{78}}), 147,6 (C{81}}), 140,0 (C{84}}), 136,1 (C) C-10), 133,3 (C-5), 132,0 (C-1), 124,6 (C-11), 123,1 (C{99}}), 42,4 (C) C-9), 41,4 (C-3), 27,3 (C-2), 19,3 (C-14), 15,9 (C-2), 9,9 ( C-13) (täiendavad andmed). Nende andmete võrdlemisel kirjanduses avaldatutega [21] tuvastati, et aine on furanodienoon (joonis 2). See eraldati Lindera pulcherrima (Nees.) Benth. endine konks. f [22], Curcuma zedoaria [19], Curcuma amada [12] ja Curcuma wenyujin [23]. See on furanooskviterpenoid, millel on seenevastane [12], põletikuvastane [19], vähivastane [24], antibakteriaalne ja antioksüdantne toime [22].

Ühend 3:

Kollakas õli; UV λ max: nm 275. ESIMS (pluss) m/z: 383,3 [M pluss Na] pluss, 361,3 [M pluss H] pluss, 343,2 [M pluss H-H2O] pluss. 'H-NMR (CD3OD): 8 6,99 (2H, dd, J=9, 2 Hz, H-2´´, -6´´), 6,67 (2H, d, J=9 Hz, H-3´´, -5´´), 6,52 (2H, s, H-2´, -6´), 4,63 (1H) , br b, J=12 Hz, H-1), 4,21 (1 H, m, H-3), 3,89 (1 H, m, H-5), 3,85 ( 3H, s, 5'-OCH3), 2,63 (2H, m, H-7), 1,82 (1H, m, H-2a), 1,78 (1 H, m, H{{6{ {107}}}}a), 1,73 (1 H, m, H-2b), 1,69 (1 H, m, H-4a), 1,68 (1 H, m, H{{72} }b), 1,53 (IH, m, H-4b). 13C-NMR (CD3OD): 8 156,3 (C-4´´), 149,5 (C-5´), 146,4 (C{88}}´), 134,5 (C{91}} ´), 134,44 (C-1´), 134,41 (C-1´´), 130,4 (C-2´´, -6´´), 116,1 (C{ {104}}´´, -5´´), 108,0 (C-2´), 102,8 (C-6´), 75,2 (C-1), 72,6 ( C-5), 65,6 (C3), 56,6 (5'-OCH3), 41,1 (C-2), 39,5 (C{131}}), 39,2 (C{134}}) 31,8 (C-7) (täiendavad andmed). Nende andmete võrdlemisel kirjanduses avaldatud andmetega [25] tuvastati, et aine on 1,5-epoksü-3-hüdroksü-1-(3,4-dihüdroksü{ {145}} metoksüfenüül)-7-(4-hüdroksüfenüül)heptaanid (joonis 2). See eraldati Zingiber officinale risoomidest ja uuriti nende antioksüdantseid omadusi [25].

Ühend 4:

Viskoosne siirup; UV λ max: nm 281. ESIMS (pluss) m/z: 385,3 [M pluss Na] pluss, 363,3 [M pluss H] pluss, 345,2 [M pluss H-H2O] pluss. 'H-NMR (CD3OD): 8 6,75 (1 H, d, J=2 Hz, H-2´), 6,68 (1 H, d, J=8 Hz, H{{21) }}´), 6,64 (1H, J=8 Hz, H-5´´), 6,61 (1H, J=2 Hz, H-2´´), 6,60 (1H, dd, J=8, 2 Hz, H-6´), 6,49 (1 H, dd, J=8, 2 Hz, H-6´´), 3,80 (3H, s, 3'-OCH3), 3,73 (2H, m, H-3, -5), 264-2,47 (4H, m, H{{59) }}a, -1b, -7a, -7b), 1.71-1,65 (4H, m, H-2a, {{ 68}}b, -6a, -6b), 1,61 (2H, m, H-4a, -4b). 13C-NMR (CD3OD): 5 148,8 (C{81}}´), 146,1 (C{84}}´´), 145,4 (C{87}}´), 144,2 (C{81}}'). ´´), 135,24 (C-1´ või C-1´´), 135,22 (C-1´ või C-1´´), 121,8 (C{{101 }}´), 120,6 (C-6´´), 116,5 (C-2´´), 116,3 (C-5´´), 116,1 (C-5´ ), 113,2 (C-2´), 70,94 (C-3 või C-5), 70,92 (C-3 või C-5), 56,4 (3 ´-OCH3), 44,9 (C{132}}), 40,8 (C-2, -6), 32,3 (C-1), 32,1 (C{142}}) (Täiendavad andmed). Nende andmete võrdlemisel kirjanduses avaldatutega [26, 27] tuvastati, et aine on õli 3,5-dihüdroksü-1-(3,4-dihüdroksüfenüül){{150 }} (4-hüdroksü-3-metoksüfenüül)heptaanid (joonis 2). See eraldati Tacca chantrieri [26] ja Curcumalonga L. [27] risoomidest. Need on diarüülheptanoidid, millel on tsütotoksiline [26] ja kasvajavastane [27] toime.

Ühend 5:

Värvitu õli; UV λ max nm: 279. ESI-MS (pluss) m/z: 413,3 [M pluss Na] pluss, 391,3 [M pluss H] pluss, 373,3 [M pluss HH2O] pluss. 'H-NMR (CD3OD): 8 6,76 (1H, s, H-2´´), 6,67 (1H, d, J=8 Hz, H{{20}} ´´), 6,21 (1 H, dd, J=8, 2 Hz, H-6´), 6,53 (2H, s, H-2´, -6´´ ), 4,63 (1 H, br d, J=12 Hz, H-1), 4,21 (1 H, m, H-3), 3,83 (3H, s, 5'-OCH3) 3,78 (3H, s, 3-OCH3), 2,65 (2H, m, H{55}}), 1,84 (1 H, m, H-2a), 1,79 (1 H, m, H-6a), 1,74 (1 H, m, H-2b), 1,69 (1 H, m, H-4a), 1,68 (1 H, m, H{{ 75}}b), 1,53 (IH, m, H-4b). 13C-NMR (CD3OD): 8 149,5 (C{85}}´), 148,8 (C{88}}´´), 146,4 (C{91}}´), 145,4 (C{94}}}). ´´), 135,3 (C-1´), 135,2 (C{-1´´), 134,4 (C-4´), 121,9 (C-1´´), 116,1 (C-5´´), 113,4 (C-2´´), 108,0 (C{-2´), 102,7 (C-6´), 75,2 (C{ {121}}), 72,5 (C-5), 65,6 (C-3), 56,6 (5'-OCH3), 56,3 (3''-OCH3), 41,2 (C{140}). }), 39,4 (C-4), 39,3 (C-6), 32,2 (C-7) (täiendavad andmed). Nende andmete võrdlemisel kirjanduses avaldatud andmetega [20] tuvastati, et aine on 1,5-epoksü-3-hüdroksü-1-(3,4-dihüdroksü{ {157}}metoksüfenüül)- 7-(4-hüdroksü-3-metoksüfenüül)heptaanid (joonis 2) ja nende bioloogilise aktiivsuse kohta teave puudub. Ühendid 3, 4 ja 5 eraldasime esimest korda C. amadast. Kõik ühendid näitasid seene türosinaasi inhibeerivat toimet

Viis ühendit, nimelt sederoon, furanodienoon, 1,5-epoksü-3-hüdroksü-1-(3,4-dihüdroksü-5-metoksüfenüül)- 7-( 4-hüdroksüfenüül)heptaanid, 3,5-dihüdroksü-1-(3,4-dishyhüdroksüfenüül)-7-(4-hüdroksü-3- metoksüfenüül)heptaanid ja 1,5-epoksü-3-hüdroksü-1-(3,4-dihüdroksü-5-metoksüfenüül)- 7-(4- hüdroksü-3-metoksüfenüül)heptaanid, eraldati fraktsioonidest F3 ja F6. Eraldatud ühendid näitasid türosinaasivastast toimet kontsentratsioonist sõltuval viisil. Viiest ühendist näitas ühend 4 oluliselt tugevamat türosinaasivastast toimet kui arbutiin. Ühendi 5 ja arbutiini türosinaasivastases toimes ei esinenud olulisi erinevusi (joonis 3). Eraldatud ühendi mõju rakkude elujõulisusele uuriti hiire B16F10 melanoomirakkudel. Rakke töödeldi 50, 100, 200 ja 400 μM ühendi kontsentratsioonidega 48 tundi. Eraldatud ühendid ei näidanud tsütotoksilist toimet kuni 200 µM, kuid ligikaudu viiskümmend protsenti rakusurmadest täheldati kõigil juhtudel 400 µM kontsentratsiooni juures (joonis 4). Seega kasutati nende rakusisese antitürosinaasi ja melanogeense toime hindamiseks kontsentratsioone kuni 200 μM.

Eraldatud ühendite melanogeense ja türosinaasivastase toime määramiseks hinnati nende mõju melaniini sisaldusele ja türosinaasi aktiivsusele B16F10 melanoomirakkudes. Nagu on näidatud tabelis 1, inhibeerisid meie eraldatud ühendid annusest sõltuvalt rakusisese melaniini sisaldust ja türosinaasi aktiivsust. Ühend 4 oli nii melaniini kui ka türosinaasi inhibeeriva toime poolest oluliselt tugevam kui positiivne kontrollravim arbutiin. Ühendi 5 ja arbutiini vahel olulist erinevust ei täheldatud. Kuna raku türosinaas suurendab melaniini tootmist, on türosinaasi aktiivsuse vähendamine tõhus strateegia melanogeensete ainete väljatöötamiseks. Selleks hindasime rakusisese türosinaasi aktiivsuse ja melanogeneesi inhibeerivaid omadusi B16F10 melanoomirakkudes. Sarnaselt seente türosinaasi inhibeeriva toime leidudele inhibeerivad eraldatud ühendid rakusisest türosinaasi aktiivsust ja melanogeneesi annusest sõltuval viisil. Eraldatud ühendite türosinaasivastane toime andis tulemuseks nende melanogeensed omadused. Nende ühendite türosinaasi ja melanogeense vastase toime järjekord oli ühend 4 > arbutiin > 5 > 2 > 3 > 1. Ühendi 4 arvutatud IC50 väärtus oli oluliselt madalam kui arbutiinil. Ühendi 4 efektiivsus oli 1.9- kuni 5-} korda kõrgem kui ülejäänud neljal ühendil. Ühendil 5 oli ka tugev türosinaasivastane toime, mis oli võrreldav arbutiini omaga. Meie tulemused näitasid, et ühendeid 4 ja 5 saab kasutada potentsiaalsete looduslike türosinaasi inhibiitorite ja nahka valgendavate kosmeetikavahenditena. Arvatakse, et oksüdatiivne stress on seotud melaniini ületootmise aluseks oleva mehhanismiga [28]. Seetõttu on antioksüdantset rolli uuritud paljude nahahaiguste, sealhulgas fotokartsinogeneesi või melanoomi korral [9]. Meie ja teised teatasid varem C. amada [13, 29] antioksüdantsetest omadustest, mis võivad olla vastutavad isoleeritud ühendite melanogeense toime eest. Selles uuringus tuvastasime eraldatud ühendite inhibeeriva toime rakusisese melaniini sünteesile ja -MSH poolt indutseeritud türosinaasi aktiivsusele. Seega saab meie eraldatud ühendeid kasutada funktsionaalse kosmeetika ainetena tõhusate nahka valgendavate ravimeetodite väljatöötamiseks.

Järeldus

Soovitame kindlalt, et C. amada võib mängida olulist rolli tõhusa türosinaasi inhibiitorina. C. amadat ja selle bioaktiivseid ühendeid võiks kasutada kosmeetikatööstuses looduslike valgendavate ainetena, toiduainetööstuses pruunistusvastaste ainetena ning meditsiinivaldkonnas hüperpigmentatsiooni raviks. Sellegipoolest on vaja täiendavaid uuringuid, et uurida eraldatud ühendite melanogeenset toimet loommudelites.

materjalid ja meetodid

Kemikaalid

Seente türosinaas ja arbutiin osteti ettevõttest Sigma–Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). L-Tyrosine pärines ettevõttest Wako pure Chemical Industries Ltd. (Osaka, Jaapan). Metanool (MeOH), etüülatsetaat (EtOAc) ja n-heksaan osteti ettevõttest Nacalai Tesque (Kyoto, Jaapan). Osteti silikageel (63–200 μm, Kanto Chemical Co. Tokyo, Jaapan) ja MeOH-d4 (CD3OD, Merck KGaA, Saksamaa).

Taimse materjali ettevalmistamine Neli erinevat kurkumiliiki, nimelt C. xanthorrhiza, C. aromatica, C. amada ja C. zedoaria, kasvatati halli pinnasega põllul (jäme liiv 3,6%, peen liiv 30,9%). , muda 24,3 protsenti , savi 32,8 protsenti , pH 7,4, NO{{10}}N 0,07 protsenti , NH4-N 0,08 protsenti, P 4,6 ng/g, K 42,9 ng/g) kl. lähistroopilise põllu teaduskeskus, Ryukyuse ülikool, Okinawa, Jaapan. Kuu keskmine temperatuur, õhuniiskus ja sademete hulk viljelusperioodil olid vastavalt 17–29 kraadi, 61–83 protsenti ja 22–369 mm. Pakuti ühiseid agronoomilisi tavasid, sealhulgas väetist ja niisutamist. Risoomid korjati siis, kui kõik liigi võrsed täielikult närbusid. Risoomid pesti, viilutati ja kuivatati kuumaõhuahjus 50 kraadi juures 72 tundi.

Proovide ekstraheerimine

Ekstraheerimine viidi läbi erineva kurkumipulbri (300 g) lahustamisega MeOH-s (3 L) toatemperatuuril (25 kraadi) ja atmosfäärirõhul ning hoiti kaks päeva pideva magnetsegamisega, et vältida õhuga oksüdeerumist ja päikesevalguse eest varjamist. Lahustis lahustuvad ühendid filtriti, kasutades filterpaberit (nr. 2, Advantec, Tokyo Roshi Kaisha Ltd., Tokyo, Jaapan). Kasutatud taimsele materjalile lisati värskeid lahusteid (MeOH) ja protsessi korrati kolm korda. Taimseid ühendeid sisaldavad filtreeritud lahused kuivatati pöördaurustis alandatud rõhul 40 kraadi juures. Kõikide ekstraktide saagist hoiti eksperimentaalsete analüüside jaoks külmikus 4 kraadi juures.

Türosinaasi inhibeerimise test

Türosinaasi inhibeerimise aktiivsus määrati vastavalt eelmisele meetodile [30], mõõdeti türosiini substraadil türosinaasi ensüümi toimel tekkinud DOPA kroomi kontsentratsiooni. Lühidalt öeldes lahustati uuritav proov 80% MeOH-s, et saada erinevad kontsentratsioonid (25, 50 ja 100 µg/ml). 96-Süvendiplaat paigaldati järgmises järjekorras: 120 μL fosfaatpuhvrit (20 mM, pH 6,8), 20 μL proovi ja 20 μL seene türosinaasi (500 U/mL 20 mM fosfaadis puhver). Pärast 15-minutilist inkubeerimist 25 kraadi juures käivitati reaktsioon 20 µl 0,85 mM L-türosiini lahuse lisamisega ja inkubeeriti seejärel 10 minutit 25 kraadi juures. Türosinaasi aktiivsus määrati neeldumise mõõtmisega 470 nm juures, kasutades mikroplaadilugejat (Biotek Powerwave XS2 spektrofotomeeter). Arbutiini kasutati positiivse kontrollina, samas kui 80 protsenti MeOH-d kasutati negatiivse kontrollina. Türosinaasi inhibeerimise protsent arvutati järgmiselt:

kus C on negatiivse kontrolli neeldumine, B on pimekatse neelduvus ja S on uuritava proovi neeldumine.

Bioaktiivsete ühendite eraldamine Curcuma amada toorekstraktist

Arvestades nelja kurkumiekstrakti tulemusi, näitas C. amada teistest oluliselt kõrgemat türosinaasivastast aktiivsust. Seetõttu viidi läbi C. amada toorekstraktist aktiivsete ühendite puhastamine biotesti teel. Türosinaasivastaste ühendite tuvastamiseks viidi läbi C. amada toorekstrakti fraktsioneerimine, nagu on kirjeldatud joonisel 5. Toorekstrakt lahjendati destilleeritud veega ja seejärel ekstraheeriti n-heksaaniga, millele järgnes EtOAc. Seejärel segati võrdsed kogused iga lahustit ja toorekstrakti lahust, loksutades 3 minutit jaotuslehtris. Kõik fraktsioonid kontsentreeriti kuivaks pöördaurustis 40 kraadi juures. Nende kolme fraktsiooni türosinaasivastane toime määrati ülaltoodud protseduuri kohaselt. Kuna EtOAc fraktsioonil oli kõrgeim türosinaasivastane aktiivsus, valiti see bioaktiivse ühendi eraldamiseks ja puhastamiseks. Aktiivne EtOAc fraktsioon aurustati kuivaks ja kromatografeeriti silikageelikolonnis (75 g) (30 × 3 cm). Elueerimine viidi läbi n-heksaani ja EtOAc-ga, suurendades EtOAc kogust [100:0 (F1), 80:20 (F2), 60:40 (F3), 40:60 (F4), 20:80 (F5) ja 0:100 (F6)]. Nende kuue fraktsiooni türosinaasivastane toime viidi läbi vastavalt ülaltoodud protseduurile ja enamik aktiivsusi leiti F3 ja F6 puhul. Fraktsioonid F3 ja F6 puhastati C18 pöördfaasi HPLC-ga (COSMOSIL 5C18-AR-II; Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Jaapan), mis oli varustatud vee ja atsetonitriiliga kui liikuv faas voolukiirusega 2,5 ml min-1, tuvastati 280 nm juures.

Kolm piiki F3-st elueerusid 9,55, 13,66 ja 16,47 minuti pärast ning F6-st neli piiki elueerusid 11,56, 12,2{41}}, 12,75 ja 1503 minuti pärast värvitute valgete ainetena, millest inhibeerivad aktiivsus tuvastati viies piigifraktsioonis, mis elueeriti 9,55 ja 16,47 minuti pärast F3-st ning 11,56, 12,75 ja 15.03 min (täiendavad andmed) F6-st (joonis 5). Eraldatud ühendid (~10 mg) lahustati MeOH-d4-s ja seejärel viidi läbi spektraalanalüüs. Tuumamagnetresonantsi (NMR) spektrid registreeriti toatemperatuuril BRUKER NMR spektromeetritega (500 MHz 1 H ja 125 MHz 13 °C jaoks). Keemilised nihked (δ) registreeriti osades miljoni kohta (ppm) tetrametüülsilaani (TMS) kui sisestandardi suhtes. Massispektromeetria katsed viidi läbi Watersi massispektromeetriga, kasutades elektropihustusionisatsiooni (ESI − MS) sondi järgmistes instrumentaaltingimustes: Kolonn: COSMOSIL 5C18-AR-II, (2 × 150) mm. Lahusti A: vesi (0,1 protsenti sipelghapet), lahusti B: atsetonitriil, voolukiirus: 4 ml/min, süstimismaht: 100 µL, tööaeg: 35 min, ajaprogramm F3 jaoks: 75 protsenti B (0 min) → 75 protsenti B (20 min) → 100 protsenti B (20,1 min) → 100 protsenti B (27 min) → 75 protsenti B (27,1 min) → 75 protsenti B (35 min). Ajaprogramm F6 jaoks: 45 protsenti B (0 min) → 45 protsenti B (14 min) → 100 protsenti B (14,1 min) → 100 protsenti B (20 minutit) → 45 protsenti B (20,1 min) → 45 protsenti B (25 minutit) min). Pumba režiim: binaarne gradient. Ahju detailid: CTO-20AC, temperatuur 40 kraadi . MS ionisatsioonirežiim: ES ( pluss ), kapillaarpinge: 4,0 kV, koonuspinge: 20 V, lähtetemperatuur: 120 kraadi, desolvatseerimistemperatuur: 350 kraadi, koonusgaasi vool: 100 L/h, desolvatseerimisgaasi vool: 800 L /h (täiendavad andmed).

Eraldatud ühendite türosinaasivastane toime

Eraldatud ühendid lahustati MeOH-s kontsentratsioonides 5, 10, 30, 50, 100 ja 200 µM iga ühendi kohta. Türosinaasivastane aktiivsus määrati eelnevalt kirjeldatud protseduuri abil.

Türosinaasi ja melanogeneesi rakusisene inhibeerimine isoleeritud ühendite poolt

Rakukultuur

B16F10 melanoomirakke kasvatati Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes (DMEM), millele oli lisatud 10 protsenti kuumaga inaktiveeritud veiseloote seerumit (FBS) ja 1 protsenti penitsilliini (10,{6}} U/mL)/streptomütsiini (100 ug/ml). temperatuuril 37 kraadi niisutatud atmosfääris, mis sisaldab 5 protsenti CO2.

Rakkude elujõulisus

B16F10 rakud plaaditi 96-süvendiga plaadile tihedusega 5 × 104 rakku süvendi kohta. 24 tunni pärast eksponeeriti rakke erinevatel kontsentratsioonidel eraldatud ühendiga ja inkubeeriti veel 48 tundi 37 °C juures. Pärast inkubeerimist määrati rakkude elujõulisus MTS-testiga. Lisati 20 mikroliitrit MTS lahust ja inkubeeriti 60 minutit. Pärast inkubeerimist määrati rakkude neeldumine 490 nm juures, kasutades mikroplaadilugejat (Benchmark Plus).

Eraldatud ühendite türosinaasivastane ja melanogeenne toime

Rakulise melaniini sisalduse ja türosinaasi aktiivsuse määramine viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [31], väikeste muudatustega. B16F10 melanoomirakud plaaditi 96-süvendiga plaadile tihedusega 5 × 104 rakku süvendi kohta. 24 tunni pärast eksponeeriti rakke eraldatud ühendi või arbutiini erinevate kontsentratsioonidega. 1 tunni pärast lisati 100 nM melanotsüüte stimuleerivat hormooni (-MSH) ja rakke inkubeeriti veel 48 tundi 37 °C juures. Türosinaasivastase aktiivsuse uuringu jaoks pesti rakke seejärel jääkülma fosfaatpuhvriga ja lüüsiti fosfaatpuhvriga (pH 6,8), mis sisaldas 1 protsenti Triton-X-i (90 µl süvendi kohta). Plaate külmutati -80 kraadi juures 30 minutit. Pärast sulatamist ja segamist lisati igasse süvendisse 10 μl 1% L-DOPA-d. Pärast 2-tunnist inkubeerimist 37 kraadi juures mõõdeti neeldumist lainepikkusel 490 nm. Melaniinisisalduse analüüsi jaoks pesti rakke kaks korda fosfaatpuhvriga ja lahustati seejärel 100 µl NaOH-s (1 N), mis sisaldas 10 protsenti DMSO-d. Proove inkubeeriti 80 kraadi juures 1 tund ja segati melaniini lahustamiseks. Segatud homogenaadi optiline tihedus mõõdeti 490 nm juures.

Statistiline analüüs

Tulemused on väljendatud keskmisena ± SEM. Statistilisi erinevusi kahe keskmise vahel hinnati Studenti t-testiga. Viidi läbi mitu võrdlust, kasutades ühesuunalist dispersioonanalüüsi, millele järgnes Bonferroni test. Erinevusi peeti olulisteks, kui P <>

See on meie väsimusevastane toode! Lisateabe saamiseks klõpsake pildil!

Viited

1. Solano F, Briganti S, Picardo M, Ghanem GH. Hüpopigmenteeritud ained: uuendatud ülevaade bioloogilistest, keemilistest ja kliinilistest aspektidest. Pigment Cell Res. 2006;19:550–71.

2. Loizzo MR, Tundis R, Menichini F. Looduslikud ja sünteetilised türosinaasi inhibiitorid kui pruunistusvastased ained: värskendus. Compr Rev Food Sci Food Saf. 2012;11:378–98.

3. Lin YS, Chen HJ, Huang JP, Lee PC, Tsai CR, Hsu TF jt. Türosinaasi inhibeeriva toime kineetika Viti vinifera lehtede ekstraktide abil. Biomed Res Int. 2017: 5232680.

4. Manini P, Napolitano A, Westerhof W, Riley PA, d' Ischia M. Naha depigmenteeriva aine monobensooni türosinaas-katalüüsitud oksüdatsiooni tekitatud reaktiivne ortokinoon: isesidumise ja tioolkonjugatsiooni reaktsioonid ning võimalikud tagajärjed melanotsüütidele mürgisus. Chem Res Toxicol. 2009;13:1398–405.

5. Couteau C, Coiffard L. Ülevaade nahka valgendavatest ainetest: ravimid ja kosmeetikatooted. Kosmeetika. 2016;3:27.

6. Al-Saleh I, Shinwari N, El-Doush I, Billedo G, Al-Amodi M, Khogali F. Elavhõbedatasemete võrdlus albiinode ja pigmenteerunud hiirte erinevates kudedes, keda on töödeldud kahte erinevat marki elavhõbedast nahka helendava kreemiga. Biometallid: Int J roll Met ions Biol, Biochem, Med. 2004;17:167–75.

7. Gopinath H, Karthikeyan K. Kurkum: maitseaine, kosmeetika ja ravi. India J Dermatol Venereol Leprol. 2018;84:16–21.

8. Vaughn AR, Branum A, Sivamani RK. Kurkumi (Curcuma longa) mõju naha tervisele: kliiniliste tõendite süstemaatiline ülevaade. Phytother Res. 2016;30:1243–64.

9. Baliga MS, Katiyar SK. Fotokartsinogeneesi kemopreventsioon valitud toidutaimede abil. Photochem Photobio Sci. 2006;5:243–53.

10. Akter J, Hossain MA, Sano A, Takara K, Islam MZ, Hou DX. Erinevate kurkumiliikide ja tüvede (Curcuma spp.) seenevastane toime Fusarium Solani Sensu Lato vastu. Pharm Chem J. 2018;52:292–7.

11. Akter J, Islam MZ, Hossain MA, Kawabata S, Takara K, Nguyen H jt. Endoteelist sõltumatu ja kaltsiumikanalist sõltuv sigade ajuarteri lõdvestamine erinevate kurkumiliikide ja -tüvede poolt. J Tradit Complement Med. 2018; 9:297–303.

12. Akter J, Takara K, Islam MZ, Hossain MA, Sano A, Hou DX. Curcuma amada seenevastaste ühendite eraldamine ja struktuurne selgitamine. Asian Pac J Trop Med. 2019;12:123–9.

13. Akter J, Hossain MA, Takara K, Islam MZ, Hou DX. Erinevate kurkumiliikide ja sortide (Curcuma spp) antioksüdantne toime: toimeainete eraldamine. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharm. 2019;215:9–17.

14. Khunlad P, Tundulawessa Y, Supasiri T, Chutrtong W. Kurkumipulbri (Curcuma longa Linn.) kurkuminoidide türosinaasi inhibeeriv aktiivsus. J SWU Sci. 2008;24:125–39.

15. Giang PM, poeg PT. Seskviterpenoidide eraldamine Vietnami kurkuma aromaatse salisbi risoomidest. J Chem. 2000;38:96–9.

16. Asem SD, Laitonjan SW. Curcuma caeca Roxb risoomi zederooni struktuuri ja mittelineaarsuse seose uurimine. Ind J Chem. 2012;51:1738–42.

17. Faiz Hossain C, Al-Amin M, Rahman KM, Sarker A, Alam MM, Chowdhury MH jt. Valuvaigistav põhimõte Curcuma amadast. J Etnopharmacol. 2015;163:273–7.

18. Ahmed Hamdi OA, Syed Abdul Rahman SN, Awang K, Abdul Wahab N, Looi CY, Thomas NF, Abd Malek SN. Curcuma zedoaria risoomide tsütotoksilised koostisosad. Sci World J. 2014;2014:321943.

19. Makabe H, Maru N, Kuwabara A, Kamo T, Hirota M. Curcuma zedoaria põletikuvastased seskviterpeenid. Nat Prod Res. 2006;20:680–5.

20. Kikuzaki H, Nakatani N. Zingiber officinale risoomidest pärinevad tsüklilised diarüülheptanoidid. Fütokeemia. 1996;43:273–7.

21. Dekebo A, Dagne E, Sterner O. Furanosesquiterpenes pärit Commiphora sphaerocarpa ja sellega seotud tõelise mürri lisanditest. Fitoteraapia. 2002;73:48–55.

22. Joshi SC, Mathela CS. Lindera pulcherrima (Nees.) Benth lehtede eeterliku õli ja selle koostisosade furanodienooni ja kurserenooni antioksüdantne ja antibakteriaalne toime. endine konks. f. Pharmacogn Res. 2012;4:80–4.

23. Yang FQ, Li SP, Zhao J, Lao SC, Wang YT. GC-MS tingimuste optimeerimine, mis põhineb analüütide eraldusvõimel ja stabiilsusel üheksa seskviterpenoidi samaaegseks määramiseks kolmes Curcuma risoomi liigis. J Pharm Biomed Anal. 2007;43:73–82.

24. Li YW, Zhu GY, Shen XL, Chu JH, Yu ZL, Fong WF. Furanodienoon pärsib rakkude proliferatsiooni ja ellujäämist, pärssides ER signaaliülekannet inimese rinnavähi MCF-7 rakkudes. J Cell Biochem. 2011;112:217–24.

25. Tao QF, Xu Y, Lam RY, Schneider B, Dou H, Leung PS jt. Diarüülheptanoidid ja Zingiber officinale risoomidest pärinev monoterpenoid: antioksüdandid ja tsütoprotektiivsed omadused. J Nat Prod. 2008;71:12–17.

26. Yokosuka A, Mimaki Y, Sakagami H, Sashida Y. Uued diarüülheptanoidid ja diarüülheptanoidglükosiidid Tacca chantrieri risoomidest ja nende tsütotoksiline toime. J Nat Prod. 2002;65:283–9.

27. Jiang JL, Jin XL, Zhang H, Su X, Qiao B, Yuan YJ. Kasvajavastaste koostisosade tuvastamine Curcuma longa L. kurkuminoidides koostise ja aktiivsuse seose põhjal. J Pharm Biomed Anal. 2012;70:664–70.

28. Marrot L, Meunier JR. Naha DNA fotokahjustus ja selle bioloogilised tagajärjed. J Am Acad Dermatol. 2008;58:139–48.

29. Policegoudra RS, Abiraj K, Channe Gowda D, Aradhya SM. Mango ingveri (Curcuma amada Roxb.) risoomist pärineva antioksüdandi ja antibakteriaalse ühendi eraldamine ja iseloomustamine. J Chromatogr B Anal Technol Biomed Life Sci. 2007;852:40–8.

30. Tadtong S, Viriyaroj A, Vorarat S, Nimkuntat S, Suksamrarn S. Antityrosinase and antibacterial activities of mangosteen pericarp extract. J Health Res. 2009;23:99–102.

31. Li X, Guo L, Sun Y, Zhou J, Gu Y, Li Y. Bicalein inhibeerib melanogeneesi ERK signaaliraja aktiveerimise kaudu. Int J Mol Med. 2010;25:923–7.