Polüoksometalaatide vananemisvastane toime nahale

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Abstraktne:Liigne reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) teke põletiku ja glükoosi tõttu aitab kaasa erinevatele vananemisega seotud muutustele organismis. Seetõttu võib ROS-i tootmise pärssimine ennetada naha kortsude, makulade, tuhmuse ja lõtvuse teket. Kahe polüoksometalaadi (PM: VB2 ja VB3) vananemisvastase toime hindamiseks nahale uuriti selles uuringus, kas need parandasid inimese normaalsete dermaalsete fibroblastide (NHDF) vananemisvastast reaktsiooni oksüdatiivsele stressile, mis on tingitud arenenud glükatsiooni lõpptoodetest (AGE) ) või H2C 2 kokkupuudet. Võrreldes AGE retseptorite mRNA ekspressioonitasemetega rakkudes, mis eksponeeriti ainult AGEE-dele, suurendas täiendav ravi VB2 või VB3-ga oluliselt FEEL-1, FEEL-2 ja RAGE ekspressioonitasemeid. AGE-indutseeritud stressitingimustes suurendas VB-ravi viie kuumašoki valgu ekspressioonitasemeid märkimisväärselt. Seevastu VB-d pärssisid rakusurma indutseerimist ja rakusisest ROS-i tootmist. VB-d avaldasid stressitingimustes nendele kahjulikele sündmustele ka profülaktilist mõju. Lisaks leiti, et VB-ravi takistab nii AQP-1/AQP-3 ekspressiooni pärssimist kui ka H2O2 kokkupuutest põhjustatud hüaluronaani ja elastiini tootmise pärssimist. Need tulemused näitavad VB2 ja VB3 potentsiaali vananemisvastaste ainetena.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Märksõnad:polüoksometalaat; oksüdatiivne stress; HyO2; reaktiivsed hapniku liigid; täiustatud glükatsiooniga lõpptoode; superoksiidi dismutaas; hüaluronaan; akvaporiin

1. Sissejuhatus

Glükatsioon, oksüdatsioon ja krooniline põletik on kolm peamist vananemisega seotud reaktsiooni ning on näidatud, et reaktiivsed hapniku liigid (ROS), mis tekivad ja akumuleeruvad nende reaktsioonide kohtades, kutsuvad esile mitmesuguseid vananemisnähtusi [1-5]. Kuna need vananemisega seotud reaktsioonid tekivad nahas, peetakse ROS-i allasurutud teket tõhusaks kortsude, makulade, tuhmuse ja lõtvuse ennetamisel [6].

Glükeerimine on mitteensümaatiline keemiline reaktsioon, mille käigus suhkrumolekulid või glükoosi metabolismi vaheühendid (nt glütseraldehüüd) kleepuvad aminohappejääkidega erinevates valkudes ja tekitavad lõpuks täiustatud glükatsiooni lõppprodukte (AGE) [7].puritaanid c-vitamiinAGE-d mängivad olulist rolli mitte ainult kogu keha vananemisnähtustes, vaid ka paljudes erinevates haigustes. Näiteks kollageen nahas on looduslikult glükeeritud ja seega suureneb glükoosiproduktide hulk vanusega. On oletatud, et AGE-de suurenemine mängib diabeedi põhjuslikku rolli, tuginedes järeldustele, mis näitavad, et nende sisaldus naha kollageenis oli diabeediga patsientidel kõrgem kui tervetel sama vanusega inimestel [8]. Lisaks on AGE-de teket ja akumuleerumist rakkudes seostatud naha vananemisega [8], Alzheimeri tõvega [9], hüpertensiooniga [10], arterioskleroosiga [1] ja osteoporoosiga [12].

Cistanche on vananemisvastane toime

AGE-sid toodetakse spetsiifilistes patoloogilistes tingimustes, nagu oksüdatiivne stress, ja need toimivad põletikueelsete vahendajatena. Need mõjutavad peaaegu igat tüüpi rakke kehas. Paljud AGE-de rakulised toimed hõlmavad kahte erinevat tüüpi AGE-retseptoreid; üks tüüp on seotud põletiku ja ROS-i tekkega rakusiseste signaaliradade aktiveerimise kaudu, samas kui teine ​​​​tüüp on seotud AGE-de lagunemise ja elimineerimisega retseptori vahendatud kaudu. endotsütoos ja lüsosoomist sõltuv proteolüüs (joonis 1).puritaanid c-vitamiinEndiste AGE retseptorite mõju tuleb alla suruda, samas kui viimaste retseptorite mõju tuleb edendada, et vältida või edasi lükata rakkude vananemist. Esimese rühma AGE retseptorite hulka kuuluvad arenenud glükatsiooni lõpptoodete (RAGE) ja AGE retseptor 2 (AGE-R2) retseptor ning teise rühma retseptorite hulka kuuluvad fastsikliin-EGF-taoline, amiinitüüpi EGF-taoline, linkdomeeni sisaldav. scavenger retseptor-1 (FEEL-1), FEEL-2, AGE-R1, AGE-R3 ja CD36.

AGE retseptoritest aitavad AGE-R1, FEEL-1, FEEL-2 ja CD-36 kaasa ekstratsellulaarsete AGE-de endotsütoosile rakkudesse ja nende lagunemisele fagosoomi-lüsosoomi liitmise kaudu. Teised AGE-retseptorid, nagu AGE-R2, AGE-R3 ja RAGE, suurendavad rakusisest ROS-i teket otseselt või kaudselt NADPH oksüdaasi aktiveerimise kaudu.

DNA, valkude ja lipiidide kahjustus, mis on põhjustatud oksüdatiivse stressi tingimustes tekkivast ROS-ist, on suur rakuline sündmus, mis on tugevalt seotud vananemise kiirenemisega ning geriaatriliste haiguste tekke ja ägenemisega [7,13]. Seetõttu on vananemisprotsessi kontrolli all hoidmiseks oluline pärssida ROS-i kogunemist ja tõsta antioksüdantide, näiteks superoksiidi dismutaasi (SOD) taset[14]. Veelgi enam, akvaporiin (AQP)-1 ja AQP-3, mis kontrollivad veemolekulide läbilaskvust rakumembraanis, ning hüaluronaan ja elastiin osalevad naha niisutamises ja vananemisvastases toimes. On näidatud, et AQP-maa AQP-3 ekspressioonitasemed vähenevad oksüdatiivse stressi tingimustes [15].sistancheElastiini, elastsete kiudude põhivalgu, lagunemist peetakse kortsude tekke põhjuseks, samas kui selle jätkusuutlik ja piisav tootmine on tihedalt seotud naha taastumisega [16,17]. Seetõttu on oluline säilitada neid molekule stressitingimustes, et pärssida naha vananemisnähtusi.

Praeguseks on sünteesitud mitusada polüoksometalaati (PM), mis on metallioksiidid, mis moodustavad mitmeid struktuure, ja mõnel neist on kasvajavastane, viirusevastane ja antibakteriaalne toime[18]. Varem tuvastasime tugeva antibakteriaalse ja viirusevastase toimega 2PM-id (VB2 ja VB3) ning näitasime, et need pärsisid viiruste adhesiooni ja invasiooni rakkudesse, seondudes viirusosakestega[19]. Suurepäraste hügieeniliste omadustega toodete väljatöötamine võib olla võimalik, lisades materjalidesse stabiilseid ja antimikroobseid PM-sid [20].

Käesolevas uuringus uurisime PM-de (VB2 ja VB3) mõju inimese naha fibroblastide stressireaktsioonile AGE-dele ja vesinikperoksiidile (H2O2) ning hindasime nende vananemisvastast toimet.

2. Materjalid ja meetodid

2.1.PMs

VB2(K1H[(VO)(SbWgO3)2]27H-O) ja VB3(Na[SbWg]-19H2O) puistepulbrid sünteesiti meie patenteeritud meetodil (rahvusvahelise patendipublikatsiooni number: WO2{11} }19/230210).Iga lahtine pulber jahvatati uhmris, lahustati ülipuhtas vees ja lahust kasutati katsetes pärast seda, kui see oli läbi 045-um filtri. 2.2.Materjalid

DL-glütseraldehüüd ja HzOg osteti ettevõttest Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Osaka, Jaapan). Veise seerumi albumiin (BSA) (fraktsioon V) osteti firmalt SIGMA (St. Louis, MO, USA).

2.3.BSA glükeerimine

AGE-d valmistati eelnevalt kirjeldatud viisil [21].cistanche benefíciosBSA-d (25 mg/ml) inkubeeriti 0,1 M DL-glütseraldehüüdiga fosfaatpuhverdatud soolalahuses, pH 7,4 (PBS), 37 kraadi juures 7 päeva ja kasutati katsetes AGE-dena. 2.4.Rakukultuurid

Juveniilsest eesnahast (C-12300, PromoCell, Sickingenstr.63/65,69126 Heidelberg, Saksamaa) saadud normaalseid inimese dermaalseid fibroblaste (NHDF) kultiveeriti spetsiaalse fibroblastide kasvusöötmega (C-23010, PromoCell, Sickingenstr). .63/65, 69126 Heidelberg, Saksamaa) 37 kraadi juures 5% CO2-ga.

2.5. VB-de mõju AIGE retseptorite ja kuumašokivalkude (Hsps) mRNA ekspressioonile AGE-ga töödeldud rakkudes

NHDF-e töödeldi AGE-ga (100 ug/ml) 10 ug/ml VB juuresolekul või puudumisel 37 kraadi juures 4 tundi ja kogu RNA ekstraheeriti rakkudest, kasutades TRIzol reagenti (Am-bion). AGE mRNA ekspressioonitasemed retseptorid ja Hsps mõõdeti kvantitatiivse pöördtranskriptsiooni-polümeraasi ahelreaktsiooni (qRT-PCR) meetodil.

2.6. VB-de mõju AQP-1 ja AQP-3 mRNA ekspressioonile HzO2-ga töödeldud rakkudes

VB-de terapeutilise toime hindamiseks oksüdatiivse stressi tingimustes töödeldi NHDF-i {{0}},2 mM HzO2-ga 2 tundi, pesti PBS-iga ja kultiveeriti seejärel 4 tundi 10 ug/ml VB-ga. Nende profülaktilise toime hindamiseks töödeldi rakke 10 ug/ml VB-ga 4 tundi, pesti ja kultiveeriti 0,2 mM H-O2-ga 2 tundi [22].Vananemisvastane cistancheSeejärel ekstraheeriti kogu RNA ja mRNA-de ekspressiooni uuriti qRT-PCR abil.

2.7.qRT-PCR

AGE retseptorite mRNA tasemed, sealhulgas RAGE, FEEL-1 (Stabilin-1), FEEL-2 (Stabilin-2), CD-36, AGE-R1 ,AGE-R2 ja AGE-R3, Hsps-d, nagu Hsp104, gp96, Hsp90, Hsp70, Hsp60 ja Hsp32, ning AQP-d, sealhulgas AQP-1 ja AQP-3, NHDF mõõdeti üheastmelise qRT-PCR ja spetsiifiliste praimerite komplektidega (tabel 1). Sisekontrollina mõõdeti ka glütseraldehüüd-3-fosfaatdehüdrogenaasi mRNA taset [23-28]. Üheetapiline RT-PCR, milles cDNA sünteesi pöördtranskriptsioonireaktsiooni ja qPCR abil võib läbi viia ühes katseklaasis, kasutades PCR matriitsina kogu RNA-d (500 ng), viidi läbi, kasutades Luna Universal One-Step qRT- PCR komplekt. Kasutatud PCR-süsteemiks oli Takara Thermal Cycler Dice Real Time System Ⅱ.mis on cistancheLuna universaalne üheastmeline reaktsioonisegu (2x), 1{6}} μL, Luna WarmStart RT ensüümide segu (2{8}} ×), 1 μL, päripraimer (10 μM), 0,8 μL, pöördpraimer ,0,8 μL ja matriitsi RNA segati ühes reaktsioonisüsteemis ja kogumaht reguleeriti nukleaasivaba veega 20 uL-ni. Reaktsioon koosnes ühest tsüklist 95 kraadi juures 30 sekundit ja 50 tsüklist 95 kraadi juures 5 sekundit ja seejärel 60 kraadi juures 30 sekundit. 4--kordne või suurem muutus mRNA ekspressioonis (2 PCR tsüklit) peeti oluliseks.

2.8. VB-de mõju rakkude elujõulisusele oksüdatiivse stressi tingimustes

Et uurida VB-de mõju rakkude elujõulisusele oksüdatiivse stressi tingimustes, töödeldi rakke vastavalt materjalide ja meetodite jaotises 2.6 kirjeldatule ja kultiveeriti veel 18 tundi spetsiaalses fibroblastide kasvusöötmes. Rakud koguti ja elujõulisust mõõdeti rakkude loenduskomplekti-8 (DOJINDO, Tokyo, Jaapan) abil.

2.9. Intratsellulaarse ROS-i tootmise mõõtmine

Intratsellulaarne ROS mõõdeti fluoromeetriliselt, kasutades diklorofluorestseiindiatsetaati (DCF-DA; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Rakke töödeldi materjalide ja meetodite jaotises 2.6 kirjeldatud viisil, pesti PBS-ga ja inkubeeriti 10 uM DCF-DA-ga temperatuuril. 37 kraadi 20 min. Intratsellulaarset ROS-i taset hinnati fluorestsentsi intensiivsuse mõõtmisega ergastuslainepikkusel 525 nm, kasutades mikroplaadilugejat (SYNERGY/HT, BioTek, Tokyo, Jaapan).

2.10.SOD tootmise mõõtmine

SOD mõõdeti SOD testikomplekti (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) abil. Pärast VB-de ja H2O2-ga töötlemist, nagu on kirjeldatud materjalide ja meetodite osas 2.6, kultiveeriti rakke 24 tundi spetsiaalses fibroblastide kasvusöötmes ja homogeniseeriti pärast lüüsipuhvri lisamist. Pärast tsentrifuugimist segati 10 μL proovi toatemperatuuril 200 uL ksantiinoksüdaasiga ja 30 minuti pärast mõõdeti neeldumine 450 nm juures.

2.11. Hüaluronaani ja elastiini tootmise hindamine

Pärast rakkude töötlemist VB-de ja HzO2-ga, nagu on kirjeldatud materjalide ja meetodite jaotises 2.6, määrati hüaluronaani kvantifitseerimine kultuuri supernatandis, kasutades Hyaluronan Enzyme-Linked Immunosorbent Assay komplekti (R&D sys-tems., Inc., Minneapolis). , MN, USA). Elastiini tootmise mõõtmiseks rakud lüüsiti ja valmistati selge lüsaat. Elastiini kogus lüsaadis määrati, kasutades Human Soluble Elastin ELISA komplekti (Aviscera Bioscience Inc., SK00806-01, Santa Clara, CA, USA).

2.12.Statistiline analüüs

Kõik katsed viidi läbi kolmes eksemplaris. Tulemused on esitatud kui keskmine ± SD. Erinevuste olulisust uuriti Studenti t-testi abil ja erinevusi peeti oluliseks, kui p<0.05.>

3.1. VB-de vananemisvastane toime vanusest põhjustatud stressikeskkonnas

3.1.1.AGE retseptori mRNA-de ekspressioon

Näitasime, et nii VB2 kui ka VB3 avaldasid märkimisväärset antimikroobset toimet erinevate inimese patogeenide vastu, seondudes kõrge afiinsusega mikroorganismidega ja segades koostoimeid peremeesrakkudega. Et veelgi selgitada VB-de võimeid funktsionaalse multipotentsuse osas, püüdsime siin uurida VB-de vananemisvastast toimet nahale. NHDF-i kultiveeriti stressitingimustes VB-dega ja mõõdeti erinevate vananemisvastaste nähtustega seotud parameetrite tasemeid. NHDF on olulised rakud, mis esinevad pärisnahas ja mõjutavad epidermise seisundit koos epidermise keratinotsüütidega. Kui NHDF-i kasvatati ainult seerialahjendatud VB2 või VB3-ga, ei täheldatud olulisi muutusi AGE retseptorite mRNA ekspressioonitasemetes. Kuid ravi AGE-ga kutsus esile enamiku AGE retseptorite ekspressiooni naha fibroblastides. Võrreldes AGE retseptorite mRNA ekspressioonitasemetega vastusena ainult AGE-dele, suurendas täiendav ravi VB2 või VB3-ga nende taset märkimisväärselt. FEEL-1, FEEL-2 ja RAGE mRNA ekspressioonitasemed suurenesid märkimisväärselt (joonis 2).

3.1.2.Hsp mRNA-de ekspressioon

Uurisime VB2 ja VB3 võimet indutseerida Hsp mRNA ekspressiooni AGE-ga töödeldud NHDF-is. VB2 või VB3 lisamisel ei täheldatud nendes erinevate Hsp RNA tasemete muutusi. Kuid kõigi Hsp-de, välja arvatud Hsp90, mRNA tasemed tõusid AGE lisamisega oluliselt ja seda reaktsiooni suurendas märkimisväärselt täiendav ravi VB2 ja VB3-ga (joonis 3).

3.2. VB-de mõju rakkude elujõulisusele oksüdatiivse stressi tingimustes

Järgnevates katsetes uurisime, kas VB-d parandasid NHDF-i reaktsiooni oksüdatiivsele stressile. Kui NHDF puutus kokku oksüdatiivse stressiga 0,2 mM H2O2-ga, vähenes rakkude ellujäämise määr 59 protsendini. Kui VB2 või VB3 lisati nendele rakkudele samades stressitingimustes, taastus rakkude ellujäämise määr oluliselt VB kontsentratsioonist sõltuval viisil. Mis puudutab ravi VB-dega, siis elulemus tõusis 76 protsendini VB2 puhul 300 ug/ml ja 78 protsendini VB3 puhul 300 ug/ml juures. Lisaks, kui NHDF puutus pärast VB2 või VB3-ga töötlemist kokku oksüdatiivse stressiga, muutusid rakud tõenäolisemalt oksüdatiivse stressi suhtes resistentseks. See indutseeritud resistentsus sõltus täielikult VB-de kontsentratsioonist ja rakkude elujõulisuse olulist suurenemist täheldati rakkudes, mida töödeldi VB2 ja VB3-ga kontsentratsioonidel kuni 10 ug/ml (joonis 4).

3.3. VB-de mõju rakusisese ROS-i ja SOD-i tootmisele

VB-de kui vananemisvastaste ainete mõju uurimiseks hinnati VB-de mõju oksüdatiivsest stressist põhjustatud intratsellulaarsele ROS-i tootmisele, kasutades indikaatorina fluorestseeruvat DCF-DA-d (joonis 5a). Fluorestsentsi intensiivsus suurenes rakkudes, mis puutusid kokku H2O2-ga 3.{7}}voldi tavalistest rakkudest. Kui rakke töödeldi pärast H-O2-ga kokkupuudet VB-dega, pärssis rakusisest ROS-i tootmist VB-dega töötlemine kontsentratsioonist sõltuval viisil. Veelgi enam, H2O2-indutseeritud ROS-i tase pärssis märkimisväärselt rakkude eelnev töötlemine VB-dega.

Erinevalt ROS-i tootmisest vähenesid SOD tasemed 56 protsendini kontrollist pärast kokkupuudet H2O2-ga ja taastusid VB-töötlusega kontsentratsioonist sõltuval viisil. Lisaks näis eelnev ravi VB-dega andvat resistentsuse H2O2--indutseeritud SOD tootmise vähenemisele (joonis 5b).

3.4. VB mõju AQP-1 ja AQP-3 mRNA ekspressioonile ning hüaluronaani ja elastiini tootmisele oksüdatiivse stressi tingimustes

Joonisel fig 6a, b on näidatud AQP-1 ja AQP-3 mRNA tasemed, mis on rakupinna molekulid, mis aitavad kaasa naha niisutamisele. AQP-1 ja AQP-3 mRNA ekspressioon vähenes märkimisväärselt, kui NHDF puutus kokku H202-ga, kuid pärast oksüdatiivset stressi taastus VB-ravi abil kontsentratsioonist sõltuval viisil. Rakkude eelnev töötlemine VB-dega andis resistentsuse H2O2--indutseeritud mRNA ekspressioonitasemete vähenemises. VB-de mõju rakkudele täheldati kontsentratsioonidel 1 ug/ml ja rohkem ning VB2 ja VB3 vahel olulisi erinevusi ei täheldatud.

Joonisel fig 7a, b on näidatud kultuuri supernatandis sekreteeritud hüaluronaani kogus ja rakusisese elastiini kogus. Hüaluronaani tase langes pärast H-O2-ravi umbes 50 protsendini kontrollrühma tasemest ja VB-ravi seda vähenemist ei taastanud. Teisest küljest näis, et HO2-indutseeritud hüaluronaani tootmise vähenemine oli minimaalne tänu rakkude varasemale töötlemisele VB-dega kõrgemates kontsentratsioonides (joonis 7a).

Sarnaselt hüaluronaaniga vähenes elastiini tootmine pärast H2O2-ravi kontrollrühma omast 56 protsendini. Seda vähenemist VB-ravi ei taastanud. Teisest küljest näis, et HzOz-indutseeritud elastiini tootmise vähenemine oli enamasti tühistatud rakkude varasema töötlemisega VB-dega kõrgemates kontsentratsioonides. Elastiini tootmine tõusis kontrollist kõrgemale tasemele, kui rakke töödeldi VB2-ga 100 ug/ml või kõrgemal ja VB3-ga 300 ug/ml (joonis 7b).

4.Arutelu

Varem teatasime, et VB-d on väga stabiilsed molekulid, millel on tugev viirusevastane ja antibakteriaalne toime [19]. Lisaks nendele leidudele iseloomustab VB-sid nende äärmiselt madal tsütotoksilisus. Tegelikult on leitud, et need ei avalda tsütotoksilisust isegi siis, kui rakke töödeldakse kontsentratsioonidega, mis on 300 korda kõrgemad kui selles uuringus kasutatud. 2 PM (VB2 ja VB3) mitmekülgsuse uurimiseks keskendusime siin nende vananemisvastasele toimele nahale ning nende võimele kutsuda esile tsütoprotektiivseid vastuseid AGE ja H-Oz-ga kokkupuutunud NHDF-is. Saadud tulemused näitasid selgelt, et VB-de lisamine normaalsetele naha fibroblastidele üksi ei kutsunud esile märkimisväärseid muutusi rakkudes, vaid reguleeris üles tsütoprotektiivsete molekulide ekspressiooni ja leevendas negatiivseid reaktsioone stressile avatud rakkudes. Täpsemalt ei mõjutanud ei VB2 ega VB3 AGE retseptorite või Hsps mRNA ekspressioon NHDF-is, kui seda kasutatakse üksinda (joonised 2 ja 3) AGE-ga kokku puutunud NHDF-is suurendasid VB2 ja VB3 märkimisväärselt AGE retseptorite transkriptsiooni, eriti FEEL-1, FEEL-2 ja RAEV. Eelmises uuringus teatati, et FEEL-1 ja FEEL-2 mängisid tsütokaitses rolli, osaledes rakkude vabade AGE-de endotsütoosis ja nende lagunemises lüsosoomide poolt [29]. Teisest küljest aitab RAGE teadaolevalt kaasa ROS-i tekkele, aktiveerides NADPH oksüdaasi. RAGE täiustatud transkriptsioon võib olla seotud suurenenud ROS-i tootmisega. RAGE puhul tekivad transkriptsiooni käigus splaissmutatsioonid, mille tulemuseks on kaks varianti; üks on RAGE, millel puuduvad rakusisesed domeenid (C-terminaalselt kärbitud RAGE: C-RAGE), mis on rakkudest vabanev lahustuv RAGE valk, ja teine ​​on RAGE, millel puudub rakuväline V domeen (N-terminaalselt kärbitud RAGE:N-RAGE ) [30,31]. Kuna need kaks kärbitud RAGE-d ei toiminud AGE retseptoritena, ei pruugi RAGE suurenenud transkriptsioon tingimata soodustada ROS-i tootmist. See küsimus nõuab edasist uurimist.

Seejärel uurisime VB-de mõju Hsps mRNA ekspressioonile. Hsps ekspressiooni reguleerivad üldiselt keskkonnastress, nagu kuumus, ultraviolettvalgus ja ROS. Hsps täidab chaperone funktsioone, stabiliseerides äsja sünteesitud valke, et tagada õige voltimine või aidates uuesti kokku voltida stressist kahjustatud valke. On näidatud, et Hsp104 vahendab valkude lagunemist[32] ja gp96 osaleb rakusiseses antigeeni esitluses [33]. Hsp90 aitab valkudel korralikult voltida ja püsida stressiga kokkupuutel stabiilsena ning hõlbustab rangelt valitud valkude küpsemist [34]. On näidatud, et Hsp70 reguleerib valkude kvaliteeti, kontrollides nende voltimist, transporti ja lagunemist [35, 36]. Hsp60 säilitab valkude voltimise mitokondrites ja osaleb valkude membraani tungimises mitokondrites [37]. Hsp32 osaleb heemi lagunemises, mille saadustel on antioksüdantne toime [38]. Kuna VB2 ja VB3 on mõlemad võimelised sarnaselt indutseerima Hsps ekspressiooni AGE stressi allutatud rakkudes, näivad VB-d toimivat stressitingimustes tugevate tsütoprotektiivsete ainetena.

Katses, mille eesmärk oli uurida H202-ga kokku puutunud rakkude reaktsiooni, täheldasime rakkude elujõulisuse vähenemist ligikaudu 40 protsenti. Seevastu VB-ravi suurendas kontsentratsioonist sõltuval viisil märkimisväärselt rakkude elujõulisust. Veelgi enam, VB-dega töödeldud ja seejärel H2O2-ga inkubeeritud rakkude vastus (VB-de profülaktiline toime) oli tugevam kui enne VB-ravi H2O2-ga inkubeeritud rakkude vastus (VB-de terapeutiline toime; joonis 4). Selle aluseks olevate mehhanismide selgitamiseks hindasime rakusisese ROS-i ja SOD-i tootmistasemeid. HzO2-ravi suurendas märkimisväärselt rakusisest ROS-i taset, kuid VB2 ja VB3 surusid need alla kontsentratsioonist sõltuval viisil. See VB-de profülaktiline toime ROS-i tootmisele oli samuti tugevam kui selle terapeutiline toime (joonis 5a). Teisest küljest vähendas H2O2 töötlemine oluliselt SOD-i, tugeva ROS-i püüdja, tootmist; SOD kogust vähendasid VB-ravi veidi (joonis 5b). Seetõttu näib, et H2O2-indutseeritud rakusurm on seotud rakusisese ROS-i taseme tõusuga. Kuna VB-d ei mõjutanud märkimisväärselt SOD-i tootmistasemeid, võib pärast VB-ravi täheldatud ROS-i tootmise vähenemine olla tingitud inhibeerivast toimest rakulisele vastusele ROS-i tekkele. Siiani on selles uuringus kasutatud DCF-DA mitmekülgne sond ROS-i tuvastamiseks ja sellel puudub spetsiifilisus, mistõttu ei ole selgitatud, millist ROS-i liiki VB-dega töötlemine pärsib või kas iga ROS-liigi produktsioon on VB-de poolt alla surutud. See probleem nõuab täiendavat selgitamist.

On näidatud, et fibroblastid mängivad rolli epidermise niisutamises ja AQP funktsionaalses rollis, eriti AQP-1 ja AQP-3, mis ekspresseeritakse fibroblastides ja osalevad veemolekulide sissevoolus rakkudesse, äratab üha suuremat tähelepanu. Lisaks on rakkudest sekreteeritud hüaluronaan seotud naha niisutamisega [39]. Käesolevas uuringus vähenesid AQP-1 ja AQP-3 mRNA ekspressioon ning hüaluro-naani sekretsioon oksüdatiivse stressi tõttu (joonised 6a, b ja 7a), kuid need taastusid rakkudes, mida oli töödeldud VB2 või VB3. Sarnaselt eelmistele tulemustele olid VB-indutseeritud leevendavad mõjud oksüdatiivsele stressile tõhusamad, kui nad toimisid profülaktiliselt (joonis 7a, b). Inimestel on 50 protsenti hüaluronaanist nahas [40]. Hüaluronaan väheneb vananedes epidermises, samas kui see säilib pärisnahas. See muutus aitab kaasa niiskuse kadumisele, elastsuse vähenemisele ja naha kokkutõmbumisele [40]. Lisaks on näidatud, et oksüdatiivne stress vähendab kollageeni ja elastiini taset, millele järgneb kortsude teke ja naha taastumise aeglustumine |41]. Käesolevas uuringus pärssis VB-de profülaktiline kasutamine hüaluronaani ja elastiini vähenemist oksüdatiivse stressi tingimustes, mis viitab VB2 ja VB3 potentsiaalile vananemisvastaste ainetena ja nende profülaktilisele kasutamisele vananemisvastase toime avaldamiseks. Siiani oleme demonstreerinud VB mõju inimese fibroblastidele stressitingimustes, kuid VB täpse vananemisvastase toime selgitamiseks nahale on vaja kindlaks teha VB mõju keratinotsüütidele ja viia läbi in vivo katsed. Püüame nende küsimustega varakult tegeleda ja VB mõjusid selgitada. Veelgi enam, kui VB-de kasulikud mehhanismid selguvad, püüame VB-sid rakendada hügieenitoodetele ja kosmeetikatoodetele, et töötada välja väärtuslikke tooteid, mis annavad ühiskonnale rohkem panust.

5. Kokkuvõtted

VB-de mõju käesolevate tulemuste põhjal on kokku võetud joonisel 8. Kui rakke töödeldi ainult VB2 või VB3-ga, erinevates parameetrites muutusi ei täheldatud. Kuid AGE ja HzOz põhjustatud stressitingimustes suurenes rakusisene ROS tootmine. VB2 ja VB3 indutseerisid eelistatult tsütoprotektiivsete molekulide ekspressiooni ja pärssisid ROS-i tootmist, mis võib lõpuks põhjustada tõsiseid haigusi, nagu arterioskleroos ja vähk, aga ka vananemisega seotud nähtusi. VB2 ja VB3 on ühendid, millel mõlemal on tugev viiruse- ja antibakteriaalne toime. Praegused tulemused viitavad VB2 ja VB3 potentsiaalile naha vananemisvastaste ainetena.

Normaalses stressivabas keskkonnas eemaldavad toodetud antioksüdandid homöostaatiliselt ROS-i. Teisest küljest suureneb ROS-i tootmine AGE ja H2O2 põhjustatud stressitingimustes, mis võib põhjustada vananemist, põletikku ja ateroskleroosi. Ilmselt on VB-del võime soodustada antioksüdantide tootmist stressitingimustes ja suurendada rakkude stressireaktsiooni.

See artikkel on välja võetud rakendusest Appl. Sci. 2021, 11, 11948. https://doi.org/10.3390/app112411948 https://www.mdpi.com/journal/applsci