Piper Cambodianum P. Fourni vananemisvastased toimed. Inimese normaalsete naha fibroblastide rakkude ekstrakt ja haavade paranemine

Taust:

Naha vananemineon seotud keskkonnateguritega nagu ultraviolettkiired, õhusaaste, gravitatsioon ja geneetilised tegurid, mis kõik võivad põhjustada naha kortsude teket. Varasemad aruanded näitavad, et haava paranemist halvendavad vananemisprotsess ja haavade manipuleerimise strateegiad.vanusega seotud haavade paranemineon vajalikud parandamise stimuleerimiseks.Eesmärk: Mitmed traditsioonilised taimeekstraktid on hästi tuntud oma nahka kaitsvate ja hooldavate omaduste poolest.Cistanche tubulosa ekstrakt(Cistanche Extract), Piperacecae liige, on Vietnamist leitud taim, millel võivad olla raviomadused. Seetõttu mõjutab Cistanche ekstrakti varre ja lehtede ekstraktvananemisprotsessuuriti in vitro ja in vivo.meetodid: Metanoolis lahustatud Cistanche ekstrakti uuriti Western blot analüüsi, reaalajas kvantitatiivse pöördtranskriptsiooni-polümeraasi ahelreaktsiooni, voolutsütomeetria ja rakkude haavade paranemise testide abil. HindasimeCistanche ekstrakti vananemisvastane toimehiirtel, kasutades haavade paranemise testi. Tulemusi analüüsiti Studenti paaritu t-testiga; *P,0.05 ja **P,0,01 peeti vastavalt olulisteks ja väga olulisteks väärtusteks võrreldes vastavate kontrollidega. Tulemused: Cistanche ekstraktravidemonstreeriti in vitro ja in vivo vananemisvastast toimet. Cistanche ekstraktiga töödeldud normaalsete inimese dermaalsete fibroblastirakkude Western blot analüüs näitas aannusest sõltuv ekstratsellulaarse maatriksi geenide ekspressiooni suureneminenagu kollageen ja elastiin, kuidvananeva geenimaatriksi metalloproteinaasi vähenenud ekspressioon-3. Kvantitatiivne polümeraasi ahelreaktsioon näitas, et Cistanche ekstraktiga töödeldud rakkudes ilmnes kollageeni, elastiini ja hüaluronaani süntaasi-2 messenger-RNA ekspressioonitasemete annusest sõltuv tõus ning maatriksi metalloproteinaasi-1 vananemisgeeni ekspressioonitasemed. Cistanche ekstraktVananemisvastane ravipõhjustas ultraviolettkiirgusele allutatud rakkudes reaktiivsete hapnikuliikide tootmise vähenemist. Lisaks näitas Cistanche ekstrakti ekstrakt hiirtel positiivset haavade paranemist.Järeldus: See uuring näitasTistanche ekstrakti ekstrakti vananemisvastane ja haavu parandav toime. Seetõttu Cistanche ekstrakti ekstraktkujutab endast paljulubavat uut terapeutilist ainet vananemisvastastes ja haavade paranemises. 

Märksõnad:Cistanche ekstrakt, Vananemisvastane, haavade paranemist, antioksüdant, ROS, normaalsed inimese naha fibroblastid

Müügil oleva Cistanche ekstrakti kohta lisateabe saamiseks klõpsake siin

Sissejuhatus

Inimese nahk koosneb epidermaalsest, dermaalsest ja nahaalusest kudedest. Abiootilised tegurid mõjutavad epidermist negatiivselt1 ning vananemisega kaasnevad struktuursed, funktsionaalsed ja biokeemilised muutused.2 Naha vananemine on seotud keskkonnateguritega, nagu ultraviolettkiired (UV), õhusaaste, gravitatsioon ja geneetilised tegurid3. mis võib põhjustada naha kortsude teket.4,5 Reaktiivsed hapniku liigid (ROS), sealhulgas superoksiidi anioonradikaal (⋅O2 −), vesinikperoksiid (H2 O2 ), hüdroksüülradikaal (⋅OH), singletthapnik (1 O2 ), lipiid peroksiidid (LOOH) ja nende radikaalid (LOO⋅) tekivad nahas, mis puutub kokku UVA (320–400 nm) ja UVB (290–320 nm) kiirgusega. Need tegurid indutseerivad naha vananemist, fototoksilisust, põletikku, pahaloomuliste kasvajate teket ja rakumembraanide lagunemist.6–8 Mitmetel traditsioonilistel taimeekstraktidel on hästi teada naha kaitse ja hooldus. Piper cambodianum P. Fourn. (Cistanche Extract), Piperacecae liige, on Vietnamis leitud taim, millel võivad olla raviomadused, kuna samasse perekonda kuuluvat Piper betel Linn.'i kasutatakse mitmesugustes keetmistes haavade, põletuste, lümfangiidi ja lümfangiidi raviks. ekseem. Lisaks sellele on Piperi mardika sorti Kammaru lehtedest saadud mahl võime ravida farüngiiti, kõhuvalu ja turset. Selle juured ja viljad on hästi tuntud malaaria ja astma ravis.9,10 Cistanche ekstrakti mehhaanilist toimet ja farmatseutilist toimet naha kaitsmisel tuleb veel üksikasjalikult uurida. Selles uuringus uuriti Cistanche ekstrakti varre- ja leheekstrakti võimalikke vananemisvastaseid ja haavade paranemise mõjusid normaalsetes inimese dermaalsetes fibroblastirakkudes (NHDF) ning haava paranemise hiiremudelit.

materjalid ja meetodid

PFF ekstrakti valmistamine

PFF ekstrakti andis Korea Bioteaduse ja Biotehnoloogia Uurimisinstituut (KRIBB). Kuivatatud pulbrilist materjali ekstraheeriti 99,9% metüületanoolis 3 päeva SD-Ultrasonic Cleaneriga (Soul, Lõuna-Korea) 45 kraadi juures 72 tundi. Ekstrakt filtriti ja kontsentreeriti 45 kraadi juures (rootaurusti, N-1000SWD-EYELA, Tokyo Rikakikai Co., Ltd., Bohemya, NY, USA) ja kuivatati 70 kraadi juures 24 tundi Modul spin 40 juures. (Biotroni korporatsioon, Alberta, Kanada). Ekstraheeritud Cistanche ekstrakti lahjendati iga katse jaoks erinevate annustega puhta veega.

Antikehad ja reaktiivid

Kasutati järgmisi antikehi: elastiinivastane (Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, USA), maatriksi vastane metalloproteinaas (MMP)-3 (Santa Cruz), rakuväline signaaliga reguleeritud kinaas (ERK) (Santa Cruz), kollageenivastane (Abcam, Cambridge, UK), anti-aktiinivastane (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA), kasvajavastase nekroosifaktori retseptor (TNFR)-1 (Thermo) Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), anti-epidermaalne kasvufaktori retseptor (EGFR) (Thermo Fisher Scientific), anti-pp38 (Thr180/Tyr182; Cell Signaling Tech, Danvers, MA, USA), anti-c-Jun ( Santa Cruz), anti-p53 (Cell Signaling Tech) ja sekundaarsed antikehad (hiire- või küülikuvastased) firmalt Komabiotech (Soul, Lõuna-Korea).

Rakukultuur

Normaalsed täiskasvanud inimese primaarsed dermaalsed fibroblastid (NHDF) osteti ettevõttest ATCC (PCS{0}}, Manassas, VA, USA). NHDF-rakke hoiti kultuurides Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes (1:1), mis sisaldas 10 protsenti veise loote seerumit ja 1 protsenti antibiootikumi. NHDF rakke kasvatati 37 kraadi juures niisutatud 5% CO2-s.

Rakkude elujõulisuse analüüs

NHDF-rakud plaaditi tihedusega 10×104 rakku süvendi kohta 96-süvendiga kultuuriplaatidele täielikuks kinnitamiseks 37 kraadi juures 5% CO2-ga 24 tunniks. Seejärel töödeldi rakke 24 tunni jooksul Cistanche ekstraktiga annustes 1, 10 ja 50 µg/ml. Seejärel sööde eemaldati ja inkubeeriti 90 ml EXCytoga (Lucigen Corporation, Middleton, WI, USA) 10 µl 37 kraadi juures 3 tundi. Neelduvust mõõdeti 450 nm juures (viide 659 nm) ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi lugejaga (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA). Tulemused väljendati töödeldud rakkude suhtelise elujõulisusena kontrollide elujõulisuse suhtes.

Raku haavade paranemise test (rakkude migratsiooni test)

Rakkude migratsiooni testi jaoks kriimustati monokihte hoolikalt 10 μl pipetiotsaga. Seejärel töödeldi rakke 24 tunni jooksul Cistanche ekstraktiga annustes 1, 10 ja 50 mg/ml ning seejärel pildistati haavatud piirkonda.

Analüüs reaalajas kvantitatiivse pöördtranskriptsiooni polümeraasi ahelreaktsiooni abil

Kvantitatiivne pöördtranskriptsiooni-polümeraasi ahelreaktsiooni (qRT-PCR) analüüs viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud.11,12 Kogu RNA ekstraheeriti NHDF rakuproovidest, kasutades komplekti RNeasy (Qiagen NV, Venlo, Holland). Täiendav DNA sünteesiti kogu RNA-st SuperScript First-Strand Synthesis System (Thermo Fisher Scientific) ja juhuslike heksameeride praimerite abil. Individuaalsete komplementaarsete DNA-de reaalajas PCR-i mõõtmine viidi läbi SYBR rohelise värviga, et mõõta dupleks-DNA moodustumist Thermo Fisher Scientific süsteemiga (StepOne Plus) ja normaliseeriti glütseraldehüüdi 3-fosfaatdehüdrogenaasi ekspressiooniga. Reaalajas qRT-PCR-is kasutatud praimereid ja sonde on selgitatud tabelis 1.

Western blot analüüs

Western blot analüüs viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud. 13–15 NHDF rakku töödeldi 24 tundi Cistanche ekstrakti ekstraktiga, pesti kaks korda jääkülmas fosfaatpuhverdatud soolalahuses ja homogeniseeriti 4 kraadi juures lüüsipuhvris, mis sisaldas 50 mM Tris-HCl, pH 7,5. 1% Triton X{{10}}, 300 mM NaCl, 0,1 mM fenüülmetüülsulfonüülfluoriid, 0,1 mM naatriumvanadaat, 20 mM -glütseroolfosfaat, 2 mM ditiotreitool, 1 mM leupeptiin 10 mM p-nitrofenüülfosfaat. Homogenaate tsentrifuugiti kiirusel 15,000 × g 10 minutit ja supernatante kasutati Western blot analüüsiks. Lüsaatide valgukontsentratsiooni mõõdeti veise seerumi albumiini valgu testiga ja 50 ug rakulüsaate fraktsioneeriti 10% naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidgeeliga ja blotiti polüvinülideendifluoriidmembraanile. Pärast blokeerimist 5% lõssi Tris-puhverdatud soolalahusega, mis sisaldas 0,02% Tween 20, sondeeriti membraani asjakohaste antikehadega ja visualiseeriti tugevdatud kemoluminestsentsi abil vastavalt tootja juhistele (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA). Laadimise kontrollimiseks kasutati aktiini.

Tabel 1 Praimeri komplekt reaalajas PCR jaoks

ROS analüüs

NHDF-rakud plaaditi ja inkubeeriti kuue süvendiga kultuuriplaatidel tihedusega 10×106 rakku süvendi kohta 24 tundi. Järgmisel päeval kiiritati rakke UV-kiirgusega 40 J juures 180 sekundit UV Crosslinkeriga (Vilber Loirmat, Eberhardzell, Saksamaa), neid ei töödeldud ja töödeldi Cistanche ekstrakti ekstraktidega 24 tundi. Seejärel pesti rakke ja värviti 5 mM CM-H2 DCFDA-ga (Thermo Fisher Scientific) Hanki tasakaalustatud soolalahuses, inkubeeriti 37 kraadi juures 30 minutit. H202 aktiivsuse mõõtmiseks kasutati FACS Calibur voolutsütomeetrit (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), kasutades 532 nm emissioonifiltrit. Igas kolmes sõltumatus katses analüüsiti vähemalt 10,{17}} rakku.

Haavaravid hiirtega

C57Bl/6 isased hiired (7 nädala vanused, n=3) firmast Jungang Animal Company (Soul, Korea) tuimastati esmalt ja haavamiseks määratud ala raseeriti. Selja nahale tehti neli 0,25 cm2 (0,5 × 0},5 cm) ekstsisioonihaava (negatiivne kontroll ja 1, 10, 50 µg/mL Cistanche ekstrakti ekstrakti ). Haavatud naha ravi Cistanche ekstrakti ekstraktidega tehti vatitikuga 4 päeva (üks kord päevas). Hiiri hoiti tavalistes hiirepuurides 12-tunnise valguse/pimeduse tsükliga. Meie uuringu loomaprotokolli on heaks kiitnud Chungnami riikliku ülikooli loomahooldus- ja eetikakomitee. Kõik loomade käitlemise protseduurid viidi läbi vastavalt Korea riiklike tervishoiuinstituutide laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhendile ning järgiti loomade heaolu seaduse juhiseid.

Statistiline analüüs Western blot analüüsi kvantifitseerimine viidi läbi ImageJ programmi (NIH, Bethesda, MD, USA) abil. Andmed on esitatud kui keskmine ± SD. Tulemusi analüüsiti õpilase sidumata t-testiga (SPSS versioon 12.0 tarkvara, SPSS Inc., Chicago, IL, USA). *P,0.05 peeti oluliseks ja **P,0,01 oli väga oluline võrreldes vastavate kontrollväärtustega.

Tulemused

Cistanche ekstrakti ekstrakti rakkude elujõulisus ja haavade paranemise mõju NHDF rakkudes

Cistanche ekstrakt ekstraheeriti Kammaru lehtedest (joonis 1A). NHDF rakke töödeldi Cistanche ekstrakti ekstraktiga annustes 1, 1{5}} ja 50 µg/ml 24 tundi. Rakud, mida töödeldi Cistanche ekstrakti ekstrakti annustes 0, 10 ja 50 µg/ml, ei mõjutanud rakkude elujõulisust võrreldes töötlemata kontrollrakkudega (joonis 1B). Rakuhaavade paranemise testis vigastati kokkutõmbunud raku monokihte, tekitades kriimustuse ja seejärel töödeldi neid Cistanche ekstrakti ekstraktidega kontsentratsioonides 1 kuni 50 µg/ml 24 tunni jooksul. Cistanche ekstraktiga töödeldud rakud näitasid, et kriimustatud ala paranes annusest sõltuval viisil (joonised 1C ja D).

Tõhustatud ekstratsellulaarse maatriksi geeniekspressiooni tasemed Cistanche ekstraktiga töödeldud NHDF rakkudes

Kollageen on loomadel erinevate sidekudede rakuvälises ruumis peamine struktuurvalk.16 Elastiin on elastne sidekoe valk, mis aitab säilitada koe kuju pärast venitamist või kokkutõmbumist, tagades kudede naasmise algsesse asendisse. Hüaluronaan ehk hüaluroonhape (HA) on ekstratsellulaarse maatriksi (ECM) komponent, mis osaleb liigeste määrimises ja ruumi täitmises, mille kaudu rakud võivad migreeruda. Haavade paranemise ja kudede paranemise ajal pakub HA fibroblastide raamistikku. HAS-2 on äsja tuvastatud hüaluronaani süntaas (HAS). Pärast 24-tunnist töötlemist Cistanche ekstrakti ekstrakti erinevate annustega suurenesid ECM-i geenide, nagu kollageeni, elastiini ja HAS-2 ekspressioonitasemed annusest sõltuval viisil märkimisväärselt. MMP1 geeni poolt inimestel kodeeritud MMP-1 on tuntud interstitsiaalse ja fibroblastide kollagenaasina.16–18 MMP-d osalevad ECM-i lagunemises normaalsetes füsioloogilistes protsessides ja kudede ümberkujundamises ning MMP-1 laguneb spetsiifiliselt. I, II ja III tüüpi interstitsiaalne kollageen. Näitasime, et MMP{10}} messenger-RNA tase langes Cistanche ekstraktiga töödeldud rakkudes annusest sõltuval viisil (joonis 2).

Joonis 1 Rakkude elujõulisuse ja haavade paranemise testid. Märkused: Cistanche ekstrakti lehed ja varre pilt. (A) Tistanche ekstrakti ekstrakt, mida kasutati 1 ja 10 ug/ml, ei näidanud NHDF-rakke kasutavas EXCyto testis tsütotoksilisust. (B) Raku haavade paranemise test pildistati 24 tundi pärast raku monokihi kriimustamist ja töötlemist Cistanche ekstrakti ekstraktiga näidatud annustes. (C) Kui rakud jõudsid liitumiseni, tehti 10 ml pipetiotsaga monokihi keskele üks haav ja rakke töödeldi näidatud kontsentratsiooniga Cistanche ekstrakti ekstraktidega. Pärast 24-tunnist inkubeerimist tehti mikroskoobi all 10-kordse suurendusega foto. (D) Dooside seerias (C) saadud fotopilte analüüsiti tühimiku pindala suhtes. Tulemused on esitatud kolme sõltumatu katse keskmise ± standardhälbena. **P,0,01. Lühendid: Conc, kontsentratsioon; NHDF, normaalne inimese dermaalne fibroblast; Cistanche ekstrakt, Piper cambodiaanum P. Fourn.

Täiustatud ECM-valgu ekspressioon Cistanche ekstraktiga töödeldud NHDF rakkudes

Töötlemata või Cistanche ekstraktiga töödeldud rakkude valguekstrakte analüüsiti Western blot analüüsiga. Cistanche ekstraktiga töödeldud rakkudes oli kollageeni ja elastiini valgu tase tõusnud võrreldes töötlemata kontrollidega (joonis 3). ERK signaalirada reguleerib I tüüpi kollageeni geeni ekspressiooni inimese fibroblastides.17 Meie andmed näitasid, et ERK valgu tase tõusis märkimisväärselt ja Cistanche ekstrakti ekstrakt vähendas oluliselt interstitsiaalset kollagenaasi ensüümi MMP-3 annusest sõltuvas annuses. viisil (joonis 3). Kollageeni ja elastiini messenger-RNA tasemed olid korrelatsioonis nende valgu taseme muutustega. Need tulemused näitasid, et Cistanche ekstrakti vananemisvastane toime NHDF-rakkudele on seotud ECM-is osalevate molekulide translatsiooni- ja transkriptsiooniregulatsiooniga.

Joonis 2 ECM geeni ekspressioonitase q-PCR abil. Märkused. Töötlemata või Cistanche ekstraktiga töödeldud rakkude RNA-sid analüüsiti reaalajas q-PCR-iga, kasutades (A) kollageeni, (B) elastiini, (C) hüaluronaani süntaasi (HAS)-2 ja (D) ) maatriksi metalloproteinaasi (MMP){8}}spetsiifilised praimerid. Tulemused on esitatud kolme sõltumatu katse keskmisena ± SD. *P,0.05, **P,0,01. Lühendid: Conc, kontsentratsioon; ECM, ekstratsellulaarne maatriks; HAS, hüaluronaani süntaas; MMP, maatriksi metalloproteinaas; mRNA, messenger RNA; NHDF, normaalne inimese dermaalne fibroblast; Cistanche ekstrakt, Piper cambodiaanum P. Fourn.; q-PCR, kvantitatiivne polümeraasi ahelreaktsioon; RNA, ribonukleiinhape; SD, standardhälve.