Anastatiini derivaadid leevendavad müokardi isheemia-reperfusioonikahjustust antioksüdatiivsete omaduste kaudu

Lisateabe saamiseks võtke ühendusttina.xiang@wecistanche.com

Abstraktne:(±)-Anastatiinid A ja B on Anastatica hierochunticast eraldatud flavonoidid. Eelmises uuringus töötati välja kakskümmend neli anastatiinide di- ja triasendatud uut derivaati ning hinnati nende esialgset antioksüdantset toimet. Käesolevas uuringus uuriti täiendavalt müokardi isheemia-reperfusiooni (I/R) kaitsvat toimet ja 24 derivaadi süstemaatilist antioksüdantset võimet. Ühend 13 oli kõigist uuritud ühenditest kõige tugevam, mis suurendas H9c2 rakkude elulemust 80,82 protsendini. Ühendi 13 antioksüdantset võimet hinnati raud(III) redutseeriva antioksüdantsuse, 2,2'-asino-bis (3-etüülbensotiasoliin-6-sulfoonhappe) radikaalide püüdmise ja 2,2-difenüül{ {20}}pikrüülhüdrasüülanalüüsid. Täheldati, et ühend 13 vähendas oluliselt infarkti piirkondi ja parandas histopatoloogilisi ja elektrokardiogrammi muutusi müokardi I/R kahjustusega rottidel. Lisaks vähendas ühend 13 seerumi laktaatdehüdrogenaasi, kreatiinkinaasi ja malonüüldialdehüüdi lekkekiirust roti müokardi kudedest ning suurendas glutatiooni ja superoksiidi dismutaasi aktiivsust pärastmüokardi I/R vigastusrottidel. Kokkuvõttes järeldasime, et ühendil 13 oli oma ulatusliku antioksüdantse toime tõttu tugev kardioprotektiivne toime müokardi I / R kahjustuse vastu nii in vitro kui ka in vivo.

Märksõnad: flavonoidide derivaadid; H9c2 rakud; hüpoksia/reoksügenatsioon; kardioprotektiivne toime

Tooteteabe saamiseks klõpsake siin

1. Sissejuhatus

Südame isheemiatõbi (IHD) on peamine surmapõhjus kogu maailmas [1]. Verevoolu õigeaegne taastamine võib tõhusalt parandada haiguse kliinilist tulemust; reperfusioon ei ole siiski riskivaba, kuna reperfusiooni enda poolt põhjustatud rakukahjustus on suur. Seetõttu on äärmiselt oluline töötada välja tõhusad ravistrateegiad müokardi isheemia-reperfusiooni (I/R) kahjustuse vastu [2]. Müokardi I/R vigastuse mehhanism on väga keeruline; see hõlmab apoptoosi, oksüdatiivset stressi [3], kaltsiumi ülekoormust [4] ja põletikku [5].Oksüdatiivne stressvõib viia apoptoosini erinevate signaaliülekanderadade kaudu, sealhulgas signaaliga reguleeritud kinaas (ERK), c-Jun aminoterminaalne kinaas (JNK), p53 (kasvaja valk p53) ja p66shc variandi aktiveerimine. Lisaks võib liigne reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) tootmine põhjustada pöördumatuid kahjustusi rakumembraanidele ja rakumolekulidele, nagu DNA, nukleiinhapped, valgud, lipiidid, ning käivitada ahelreaktsioone, kahjustades veelgi müokardi kude. Oksüdatiivne stress [6], mis on põhjustatud tasakaalustamatusest vabade radikaalide moodustumise ja ROS-i eemaldamise vahel, mängib olulist rolli I/R vigastuse I patogeneesis. Seetõttu on strateegiad, mis kaitsevad müokardi oksüdatiivse stressi eest, väga olulised. müokardi I/R vigastusest. Seetõttu on antioksüdantidel põhinevad strateegiad nende potentsiaalsete vabade radikaalide eemaldamise võime tõttu kasulikud I / R vigastuste ravis.

Kliinilistes uuringutes kasutati antioksüdante, et vähendadamüokardi I/R vigastusjagunevad peamiselt kahte tüüpi: ensüümid ja mitteensüümid. Ensüümid nagu katalaas ja glutatioonperoksidaas vähendavad vesinikperoksiidi kontsentratsiooni, et vältida rakukahjustusi; mitteensümaatilised antioksüdandid nagu E-vitamiin, C-vitamiin, -karoteen jne, nõrgestavad koe oksüdatiivset stressireaktsiooni, et vähendada koekahjustusi ja soodustada funktsionaalset paranemist. Mõlema rakendamisel on aga praegu teatud piirangud. Ensüümpreparaatide suur molekulmass ei soodusta imendumist [8]. Samuti on teatud probleeme mitteensüümide stabiilsusega, mis põhjustab ravimite halva stabiilsuse, mistõttu need oksüdeeruvad kergesti [9].Flavonoidid, kui teatud tüüpi mitteensümaatilised antioksüdandid, on teatatud, et neil on mitmesugused tugevad omadused, sealhulgas antioksüdant, vähivastane, antiapoptootiline ja kardiovaskulaarne kaitse [10]. Need takistavad väga reaktiivsete oksiidide teket ja pärsivad oksüdatiivseid reaktsioone, eemaldades ROS-i, nagu vesinikuradikaale ja peroksünitritit. Anastatiinid A ja B [11] on hepatoprotektiivse toimega flavonoidid. Anastasius A ja B on Anastatica hierochuntica (alatüüp Anastatica, perekond Brassicaceae) aktiivsed komponendid. Praegu on anastatiinide A ja B keemilise sünteesi ja struktuursete modifikatsioonide kohta väga vähe teateid. 2003. aastal eraldati Anastatica hierochuntica aktiivsed ühendid, millel ilmnes hepatoprotektiivne toime D-galaktoosamiini poolt põhjustatud tsütotoksilisuse vastu esmaselt kultiveeritud hiirte hepatotsüütides. Nakashima ja Eman on samuti näidanud, et ühendid avaldavad in vitro antioksüdantset ja vähivastast toimet. Anastatiinide A ja B ning nende derivaatide farmakoloogiline toime, samuti nende sünteesiprotseduurid on aga ebaselged. Seetõttu püüdsime sünteesida anastatiine A ja B ning mõningaid nende derivaate ning hinnata nende antioksüdantset toimet hüpoksia korral.reoksüdeerimine(H/R) mudel, mis on tõhus müokardi I/R vigastuse uurimiseks [12].

Eelmises uuringus sünteesisime anastatiine A ja B ning nende analooge ning hindasime nende antioksüdantide võimeid, kasutades H2O2 (vesinikperoksiidi) põhjustatud oksüdatiivse kahjustuse rakukultuuri mudelit13. Meie varasemad tulemused näitasid, et anastatiinidel A ja B on tugev hepatoprotektiivne toime, mis näib olevat seotud nende antioksüdantsete võimetega.

Käesolevas uuringus sünteesiti anastatiinid A ja B ning 24 nende derivaati ning hinnati nende antioksüdantseid võimeid, kasutades redutseeriva võimsuse ja radikaalide püüdmise teste. Lisaks kasutati ühendite kardioprotektiivse toime hindamiseks H/R lihtsat H9c2 rakumudelit ja müokardi I/R vigastuse roti mudelit.

2. Tulemused

2.1.H/R mudeli loomine

Na2S, O4 töötlemise kontsentratsiooni hinnati nii, nagu on näidatud joonisel 1A, ja H9c2 rakkude ellujäämismäär vähenes Na2S2O4 kontsentratsiooni suurenemisega. 4 mM Na, S, Oa all vähenes rakkude elujõulisus alla 50 protsendi (vastavalt 13,7, 25 ja 43,4 protsenti reoksügeenimisajal 2,1 ja 0 h) , ja rakkude elujõulisuse vähenemise tase oli madalam. Seetõttu kasutati hüpoksilise ravi jäljendamiseks 4 mM Na2S2O4 kontsentratsiooni. Joonisel fig 1B on näidatud, et 4 mM Na2S2O4 töötlemine 2 tunni jooksul ilma reoksüdeerimiseta (0 h) vähendas oluliselt rakkude elujõulisust ja püsis stabiilsena. Tingimusel, et NazS2O4 kontsentratsioon oli 4 mM 2-tunnise hüpoksia matkimise ajal, vähendas 2-tunnist reoksüdeerimist rakkude ellujäämise määra 17,37 protsendini (joonis 1C). Nagu on selgelt näidatud joonisel 1D, muutis 10 μM resveratrooli H/R põhjustatud vähenenud rakkude elujõulisuse, mis oli tugevam kui sama kontsentratsioon gallushape (74,34 vs. 60,44 protsenti gallushappe puhul).

Selle tulemusel loodi hüpoksia/reoksüdatsioonimudel, kasutades Na2S, O4 lõppkontsentratsioonil 4 mM 2 tunni jooksul matkivat hüpoksiat, millele järgnes kultiveerimine normaalses DMEM-is (Eagle'i söötme Dulbecco modifikatsioon)/kõrge glükoosisisaldusega, et jäljendada reoksüdatsioonikahjustust. . Positiivse kontrollina kasutati resveratrooli lõppkontsentratsioonis 10 μM.

2.2. Anastatiinid ja nende kahjustused parandavad H/R-ravi all olevate H9c2 rakkude elujõulisust

Esiteks uurisime anastatiinide A ja B (joonis 2A, B) ja nende derivaatide mõju H9c2 rakkude elujõulisusele MTT-s (3-(4,5)-dimetüültiahiaso(-z-y1){{ 10}},5-difenüültetrasooliumromiidi) test [13]. Ühendid 20a, 21a, 22a, 20b, 22b, 20c, 20c', 21c, 22c, 10 ja 11 ei olnud H9c2 rakkudele oluliselt tsütotoksilised (joonised 3A, B, tabel S2). Anastatiinid A ja B, nende derivaadid ja resveratrool (positiivne kontroll) muutsid hüpoksiast põhjustatud rakukahjustuse tagasi (joonis 4). Mudelrühmas vähenes rakkude elujõulisus 20,31 protsendini, mida suurendas resveratrool 82,68 protsendini ning anastatiin A ja ühendid 22b, 22c, 24b, 24c, 13 ja 14 suurendasid rakkude ellujäämise määra enam kui 70 protsendini ( 71.49,71.00, 76.50, 73.24, 77.57, 80.82 ja 77.13 protsenti). Seetõttu oli ühendil 13 (joonis 2C) tugevaim kaitsev toime anastatiinide derivaatide seas H/R vigastuse korral ja seda kasutati järgmistes katsetes.

2.3. Ühend 13 leevendab H/R-indutseeritud rakukahjustusi ja oksüdatiivset stressi

Ühendi antioksüdantse võime uurimiseks kolmoksüdatiivne stressÜhendite antioksüdantse võime hindamiseks valiti indikaatorid LDH (laktaatdehüdrogenaas), GSH (L-glutatioon) ja SOD (superoksiiddismutaas). LDH on müokardi rakkudes esinev stabiilne tsütoplasmaatiline ensüüm, mis müokardi rakumembraani vigastuse korral vabaneb kiiresti rakust rakukultuuri söötmesse. Mida tõsisem on vigastus, seda kõrgem on LDH tase söötmes. Joonis 5A näitas, et 2-tunnine hüpoksia, millele järgnes 2-tunnine reoksüdeerimine, suurendas oluliselt LDH vabanemist (478,98 U/L vs. 55,84 U/Lin tühja rühmas, p<0.001), which="" was="" inhibited="" by="" resveratrol="" (284.07="" u/l="" vs.="" the="" model="" group=""><0.01) and="" compound="" 13(276.61="" u/l="" vs.the="" model="" group,=""><0.001).gsh can="" act="" as="" a="" hydrogen="" donor="" for="" glutathione="" catalase="" (cat),="" eliminating="" o2-="" and="" its="" derivatives="" in="" the="" organism,="" thereby="" cells="" are="" protected="" from="" oxidant="" damage.="" additionally,="" sod="" can="" catalyze="" the="" disproportionation="" of="" superoxide="" anions="" and="" protect="" cells="" from="" damage.="" as="" shown="" in="" figure="" 5b,="" c,="" compound="" 13="" significantly="" increased="" gsh="" release="" and="" sod="" activity=""><0.01）. it="" increased="" gsh="" level="" to="" 39.93="" μmol/gprot="" which="" was="" higher="" than="" the="" level="" in="" the="" model="" group="" （18.2="" μmol/gprot）="" but="" slightly="" lower="" than="" that="" in="" the="" resveratrol="" group.="" additionally,="" it="" reversed="" h/r-induced="" reduction="" in="" sod="" activity="" by="" increasing="" sodlevel="" from="" 12.00="" u/mgprot="" to="" 22.98="" u/mgprot.="" these="" findings="" demonstrate="" that="" compound="" 13="" has="" a="" protective="" effect="" on="" h9c2="" cells="" subjected="" to="" h/r="">

2.4. Ühendi 13 antioksüdantne toime

Vitamin C(Vc) was used as an antioxidant control in order to evaluate the antioxidant effects of resveratrol and compound 13 intuitively. FRAP assay was used to evaluate the reducing power of the compound that can transfer ions from Fe3+ into Fe2+ to determine the antioxidant capacity of compounds. The results of the experiment showed that the reducing power of compound 13 was 354.80 mg/mmol, significantly stronger than the values obtained for the positive control Vc (127.47 mg/mmol) and resveratrol (261.91 mg/mmol) (Figure 6A).ABTS (2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)and DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) are stable free radicals insolvent, but when a radical scavenger is added to the solvent, the result is a reduction in the number of free radicals and the degree of reduction in the number of free radicals is directly proportional to the antioxidant capacity. Figure 6B, C show the ABTS and DPPH radical scavenging abilities of compound 13. The results indicate that compound 13 had the strongest scavenging activity on ABTS and DPPH with EC50 values of 1.38 and 0.07 mM, respectively. The antioxidant capacities of the compounds tested in all three antioxidant assays followed the same trend: compound 13>resveratrool. Seetõttu võib ühendi 13 antioksüdantne võime olla kõrgem kui teistel tüüpilistel antioksüdantidel.

2.5. Anastatiini derivaadi 13 mõju müokardi I/R vigastusele rottidel

2.5.1. Ühendi 13 mõju oksüdatiivsele stressile ja antioksüdantsete ensüümide aktiivsusele

Müokardi vigastuse taset hinnati oksüdatiivse stressi markeri ja antioksüdantsete ensüümide aktiivsuse tuvastamise teel. Hinnati ühendi 13 mõju MDA (malondialdehüüdi) aktiivsusele müokardi koes, samuti LDH, CK (kreatiinkinaasi), GSH ja SODin seerumi tasemeid. Nagu on näidatud joonisel 7, põhjustas I/R vigastus LDH (joonis 7A) ja CK (joonis B) taseme tõusu ning GSH (joonis 7C) ja SOD aktiivsuse olulise vähenemise (joonis 7D) (p<0.001). the="" level="" of="" mda(figure="" 7e)increases="" after="" i/r="" injury,="" which="" is="" a="" critical="" diagnostic="" marker="" of="" i/r="" injury.="" however,="" pretreatment="" with="" a="" positive="" control="" drug="" and="" different="" concentrations="" of="" compound="" 13="" significantly="" alleviated="" these="" injuries.="" ldh="" activity="" obtained="" for="" the="" i/r="" model="" group="" was="" 771.37="" u/ml,="" which="" was="" remarkably="" decreased="" to="" 416.129="" u/ml="" under="" resveratrol="" treatment.="" in="" the="" high-and="" low-dose="" 13="" groups,="" ldh="" activity="" decreased="" to="" 408.05="" and="" 462.81="" u/ml,="" respectively="" similar="" trends="" were="" observed="" for="" other="" myocardial="" injury="" markers,="" including="" the="" level="" of="" ck,="" gsh,="" sod,="" and="" mda="" release.="" these="" results="" indicated="" that="" compound="" 13="" exerted="" protective="" effects="" against="" oxidative="" stress-induced="" i/r="" injury="" in="" a="" dose-dependent="">

2.5.2. Ühendi 13 mõju elektrokardiogrammi (EKG) muutustele ja südame löögisagedusele

Müokardi I/R vigastusest põhjustatud tüüpilised EKG (elektrokardiogrammi) muutused on näidatud joonisel 8. Võrreldes normaalse EKG-ga (joonis 8A), võib müokardi I/R vigastus põhjustada ORS-i (elektrokardiograafilise laine osa) amplituudi suurenemist (joonis 8B); QRS-laine ja ST-laine liitmine (joonis 8C); ST-segmendi (intervall S- ja T-laine vahel) kõrgus (joonis 8D); ja ST-segmendi inversioon (joonis 8E). Pärast 15-minutilist LAD-i ligeerimist suurenes QRS-i amplituud mudelirühmas märkimisväärselt, umbes 0,5 mV-lt 1,2 mV-le (joonis 9A), samas kui kõigis ravirühmades täheldati madalamat QRS-i amplituudi tõusu (alates umbes 0,4 mV kuni 1, 0,8 ja 0,6 mV vastavalt resveratrooli, väikese annuse 13 ja suure annuse 13 rühma puhul) (joonis 9B-D ). Lisaks täheldati sarnast trendi ligeerimisel 30 min. Reperfusiooni ajal hakkas QRS-i amplituud vähenema; mudelirühma QRS-laine jäi aga kogu perioodi kõrgeimaks. Pärast 20-minutilist reperfusiooni vähenes QRS-i amplituud mudelirühmas ligikaudu {{30}},8 mV-ni, ravirühmas oli väärtus ligikaudu 0,6, 0,5, 0,5 mV. vastavalt resveratrooli, väikese annuse 13 ja suure annuse 13 rühma. Üldiselt vähendasid ravi resveratrooliga, väikese annusega 13 ja suure annusega 13 patoloogilist QRS-i amplituudi tõusu võrreldes mudelrühmaga nii isheemia kui ka varajase reperfusiooniprotsessi ajal, mis võib olla tingitud nende müokardi kaitsvast aktiivsusest.

Koos EKG jälgimisega tuvastati tähelepanelikult ka südame löögisageduse muutusi. Nagu on näidatud tabelis S3, vähendas 30-minutiline ligeerimine südame löögisagedust dramaatiliselt kõigis rühmades, samas kui olulisi erinevusi ravirühmade ja mudelrühmade vahel ei tuvastatud. Pärast 2-tunnist reperfusiooni südame löögisagedus tõusis, kuid olulisi muutusi üheski rühmas ei leitud.

2.5.3. Ühendi 13 mõju infarktipiirkonnale ja histopatoloogilistele muutustele

Müokardi vigastuse taseme hindamiseks värviti südamekuded TTC-ga (2,35-trifenüültetrasooliumkloriid) ja tuvastati histopatoloogilised muutused. Nagu on näidatud joonisel fig 10, ei täheldatud võltsrühmas pärast TTC-värvimist müokardis mingeid muutusi, samas kui I/R rühmas täheldati umbes 30 protsenti valgetest infarktipiirkondadest. Resveratrooli rühmas ja väikese annusega 13 rühmas vähenes infarktiga piirkond märkimisväärselt, umbes 10 protsendini, ja suure annuse 13 rühmas vähenes infarktiga piirkond ligikaudu 5 protsendini. Joonisel 10 on kujutatud HE (hematoksüliin-eosiin) värvimise uuringu tulemus: mudelrühma koelõikudes täheldati südamerakkude, osaliselt lahustunud membraanide ja tuumade suurenemist ning põletikuliste rakkude infiltratsiooni. Kuid eeltöötlus ühendiga 13 leevendas neid histopatoloogilisi muutusi oluliselt. TTC-värvimise ja HE-värvimise tulemused näitasid, et ühend 13 võib vähendada I/R-indutseeritud müokardiinfarkti annusest sõltuval viisil.

3. Arutelu

Anastatiinide A ja B potentsiaalset antioksüdantset aktiivsust silmas pidades sünteesis meie labor 24 anastatiinide derivaati ning viis läbi eelanalüüsi ühendite tsütotoksilisuse kohta PC-12 suhtes ja nende tsütoprotektiivse toime kohta HO-indutseeritud oksüdatiivses kahjustuses [13] . Selles uuringus viisime peamiselt läbi 24-st tugevaima antioksüdantse toimega derivaadist 13 põhjaliku bioloogilise hindamise.

Käesolevas uuringus tuvastati müokardi I/R kahjustus H9c2 rakkudes H/R-ravi indutseerimise teel. Uuringu tulemused näitasid, et anastatiinid A ja B ning nende uuritud derivaadid parandasid H9c2 rakkude elujõulisust pärast H/R-ravi. Ühend 13 leiti olevat 26 uuritud ühendi hulgast kõige tugevam ja seetõttu valiti see edasiseks hindamiseks. LDH (rakukahjustuse marker), SOD ja GSH (oksüdatiivse stressi markerid) aktiivsus tuvastati H9c2 rakkude supernatantides pärast H/R-ravi. Leidsime, et eeltöötlemine testitavate ühenditega vähendas oluliselt LDH taset ning suurendas SOD ja GSH taset rakkudes. Seega oletasime, et anastatiini derivaatidel oli kardioprotektiivne toime, mis võib olla tingitud nende võimest oksüdatiivset stressi maha suruda. DPPH ja ABTS analüüse kasutatakse ühendi radikaale püüdva jõu hindamiseks [14]. Selle tulemusena oli ühendil 13 kõrge antioksüdantne võimsus ja see püüdis madalatel EC50 väärtustel ära ABTS ja DPPH, mis viitab veelgi oksüdatiivse stressi allasurumisele. LAD ligeerimine on levinud meetod müokardi I/R mudelite loomiseks. Hinnates QRS-kompleksi amplituudi enne isheemiat, pärast isheemiat ja pärast reperfusiooni, leidsime, et eeltöötlus ühendiga 13 võib isheemia ja varajase reperfusiooni ajal oluliselt leevendada ventrikulaarset arütmiat. Lisaks mõjutas ühend 13 ka müokardiinfarkti infarktipiirkondi ja histopatoloogilisi muutusi. Need tulemused koos järeldustega, et ühend 13 pärssis oksüdatiivset stressi ja suurendas annusest sõltuval viisil antioksüdantsete ensüümide taset roti seerumis, näitasid, et ühendil 13 oli tugev toime müokardi kahjustuse vastu.

Kokkuvõtteks võib öelda, et anastatiini derivaatidel oli tugev antioksüdantne toime, kusjuures ühend 13 näitas testitud ühendite seas kõrgeimat antioksüdantset aktiivsust. Anastatiinide derivaatide mõju oksüdatiivse stressiga seotud signaaliradadele vastutavad mehhanismid vajavad veel arutamist. Astaksantiin (karotenoidi alatüüp) võib eemaldada ROS-i ja leevendada veelgi isheemia-/reperfusioonikahjustust [15]. Ravimid, mis võivad takistada ROS-i teket, võivad olla paljulubavad oksüdatiivse stressiga seotud haiguste [4], näiteks rakuteraapia ja südame-veresoonkonna haiguste korral. Lisaks pärsib ROS hüpoksiast indutseeritava faktori -1 (HF-1) sihtgeeni ekspressiooni hüpoksiat, millel on väidetavalt kardioprotektiivne toime isheemia-reperfusioonikahjustusele [16]. Me oletame, et ROS ja HIF{10}} regulaatorvalk võivad mängida üliolulist rolli ühendi 13 kardioprotektiivses toimes. Tournefolhape B (TAB), mis on saadud Hiina taimsest meditsiinist, kaitseb müokardi I/R vigastuse eest [17 ]. Uuring näitas TAB olulist rolli endoplasmaatilise retikulumi (ER) stressis, apoptoosis ja PI3K (fosfatidüülinositool 3 kinaas) / AKT (valgu kinaas B) radadel müokardi I/R kahjustuse ravis. Müokardi I/R kahjustusega võivad olla seotud ka teised rajad, nagu mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi (MAPK) rada [18] ja AMPK (5'-monofosfaadiga aktiveeritud proteiinkinaasi) signaalirada [19]. Seetõttu on järgmine samm alustada ROS-i ja HIF-1 regulatoorsete valkudega ning kasutada TAB-vahendatud teid, et uurida mehhanisme, mille abil 13 avaldab antioksüdantset toimet ja kaitseb müokardi I/R-i. Lisaks tuleks selle uuringu rakutasandi katsed läbi viia ka inimese rakuliinidega.

4. Materjalid ja meetodid

4.1. Rakukultuur

Roti kardiomüotsüütide H9c2 rakuliin osteti ettevõttelt Nanjing Kebai Biotechnology Company (Nanjing, Hiina). Rakke kultiveeriti DMEM/kõrge glükoosisisaldusega keskkonnas (Hyclone, USA) ja lisati 10% FBS-i (Lanzhou Minhai Biological Engineering co.LTD, Lanzhou, Hiina) ja 1% penitsilliini/streptomütsiini (Hyclone, Marlborough, MA, USA) niisutatud ruumis. inkubaatoris 37 kraadi juures 5% CO2-ga.

4.2. Rakkude elujõulisuse test

Rakkude elujõulisust mõõdeti MTT testi abil. H9c2 rakud külvati 96-süvendi plaadile tihedusega 1 × 10* rakku süvendi kohta 24 tundi. Seejärel töödeldi rakke anastatiinidega A ja B ning nende derivaatidega 48 tundi või eeltöödeldud anastatiinidega A ja B ning nende derivaatidega, millele järgnes H / R-ravi. Seejärel lisati MTT (20 µl süvendi kohta) ja kultiveeriti 37 kraadi juures 4 tundi. Neeldumist mõõdeti lainepikkusel 578 nm, kasutades mikroplaadilugejat (Tecan, Infinite 50). Rakkude elujõulisus tühja rühmas loeti 100 protsendiks.

4.3. Hüpoksia/reoksügenatsiooni (H/R) mudel ja ravimite administreerimine

4.3.1.H/R mudel

NazS, O4 kasutati hüpoksilise seisundi jäljendamiseks, mis reageerib [20] hapnikuga ja vähendab hapniku pinget. Na2S, O4 optimaalsete kontsentratsioonide määramiseks viidi läbi seitse kontsentratsiooni 0,5, 1, 2, 3, 4, 5 või 6 mM. Optimaalse hüpoksiaaja valimiseks viidi pärast Na2S2O4 lahusega töötlemist läbi kultuurid 0,5, 1,2, 3 või 4 tundi. Kultiveerimine normaalses DMEM/kõrge glükoosisisaldusega söötmes 0, 1, 2, 3 või 4 tundi viidi läbi, et jäljendada reoksügeenimisaega [21].

4.3.2. Ravimiamet

Ravimi manustamiseks jaotati anastatiinid A ja B ning nende derivaadid (keemilised struktuurid tabelis S1) kahte rühma: anastatiinid A ja selle derivaadid ning anastatiinid B ja selle derivaadid. Positiivse kontrollina kasutati resveratrooli, millel oli antioksüdantse toime tõttu kardioprotektiivne toime. Positiivse kontrolli kontsentratsiooni määramiseks hinnati resveratrooli ja teist antioksüdantset ühendit, gallushapet (3-100 μM）), kasutades MTT testi, milles rakke töödeldi 48 tundi 【22】. Üldiselt töödeldi H9c2 rakke 30 minutit enne H/R-ravi anastatiinidega A ja B ning nende derivaatidega (lõppkontsentratsioon 10 uM) ning 10 uM resveratrooliga.

4.4.Antioksüdantide võimsuse hindamine

4.4.1. Raudmetalli redutseeriva antioksüdandi võimsuse (FRAP) test

FRAP test viidi läbi vastavalt Oivuani meetodile 【23】. Kokku pipetiti 25 μL 1% kaaliumferritsüaniidi K3Fe (CN)6 ja 10 μL ühendit 13, c-vitamiini (askorbiinhape, Vc) ja resveratrooli (0).{{8} Lisati } mM) pluss 1 × PBS (pH=6,6). Segu hoiti 20 minutit 50-kraadises veevannis, millele järgnes kiire jääga jahutamine. Seejärel lisati järjestikku 25 μl 10% trikloroäädikhapet (TCA), 0,1% raudkloriidi (FeCl) ja destilleeritud vett. Segu kanti 96-süvendiga plaadile ja neelduvust analüüsiti lainepikkusel 650 nm. Standardkõvera koostamiseks kasutati Vc lahust (20-200 ug/mL). Antioksüdandi võimed arvutati lineaarse kalibreerimiskõvera põhjal ja esitati Vc ekvivalentidena.

4.4.2.ABTS-meetod

ABTS-i radikaalide eemaldamise aktiivsus [24] viidi läbi vastavalt Sugahara et al. ja Re et al. ABTS-lahust lahjendati neeldumise spektrofotomeetriliseks reguleerimiseks 650 0,70±0.02 nm juures ja ABTS-i eemaldamise aktiivsust mõõdeti vastavalt järgmine valem: E=((Akontroll-Ablank)-(A2 -A1)/(A kontroll-Ablank))) × 10, kus kontroll on 130 μL ABTS-i sisaldava kontrollreaktsiooni neeldumine · pluss töölahus ja 5,5 μL proovilahjendit (DMSO) ning Ablank on 130 μL naatriumatsetaatpuhvri ja 5,5 μL DMSO neeldumine. A on 130 μL ABTS pluss töölahuse (naatriumatsetaatpuhvri) ja 5,5 μL ühendi 13 (002-20 mM) neeldumine ning Az on 130 μL naatriumatsetaatpuhvri ja 5,5 μL (ühendi) neeldumine. 0.02-20 mM). Kõiki segusid segati vorteksiga 30 sekundit ja inkubeeriti toatemperatuuril 10 minutit, millele järgnes neeldumise mõõtmine lainepikkusel 650 nm. ECs0 arvutati, kasutades lineaarset seost ühendi kontsentratsiooni ja ABTS-i inhibeerimise protsendi tõenäosuse vahel.

4.5. Isheemia-reperfusiooni mudel

4.5.1.Loomade eest hoolitsemine

Sprague Dawley (SD) rotid saadi PLA Military Academy of Medical Sciences Laboratory Animal Centerist (Peking, Hiina). Viiskümmend isast SD-rotti kaaluga {{0}} g aklimatiseeriti ühe nädala jooksul toatemperatuuril 23±1 kraadi 12-tunnise valguse/pimeduse tsükliga ning anti toitu ja vett. Rotid jagati viide rühma: tühirühm (rotid ei saanud mingit ravi, vaid tehti näidisoperatsioon), mudelrühm (rotid said vehiikulit ja MI/R operatsiooni), resveratrooli rühm (rotid said 200 mg/kg resveratrooli ja MI/R). operatsioon), väikese annuse 13 rühm (rotid said 100 mg/kg ühendit 13 ja MI/R operatsioon) ja suure annuse 13 rühm (rotid said 200 mg/kg ühendit 13 ja MI/R operatsioon). Ühendid valmistati 0,5% naatriumkarboksümetüültselluloosis ja doseeriti suspensioonina 1 ml/kg suukaudselt üks kord päevas seitsme päeva jooksul. Kõik loomkatsed viidi läbi vastavalt riiklike tervishoiuinstituutide laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhendile ning Tianjini teadus- ja tehnoloogiaülikooli akadeemilise komitee poolt heaks kiidetud.

4.5.2. Katseprotokoll

Sprague Dawley rotid anesteseeriti 20 protsendi uretaaniga (0,8 ml/100 g) ja seejärel teostasime müokardi isheemia vasaku eesmise laskuva (LAD) ligeerimisega. Süda paljastati vasaku rindkere sisselõike kaudu ja asetati 4-0 siidõmblusele, et teostada piirkondlik isheemia 30-minutilise isheemiaga, millele järgnes 2-tunnine reperfusioon. Müokardi isheemia tunnuseid kinnitas ST-segmendi elevatsioon ja QRS-i amplituudi suurenemine. Katse ajal hoiti rotte ventilaatoril DW3000 (Beijing Zhishu Duobao Biological Technology Co. Ltd, Peking, Hiina). Südame löögisagedust ja EKG-sid jälgiti bioloogilise signaali kogumissüsteemi MD3000 (Beijing Zhishu Duobao Biological Technology Co. Ltd, Peking, Hiina) kaudu. Pärast isheemia/reperfusiooniprotsessi jälgimist rotid surmati ning müokardi kahjustuse tuvastamiseks kasutati vereproove ja südamehomogenaate, kasutades kaubanduslikke detektiivikomplekte.

4.5.3. TTC värvimine ja HE värvimine

Isheemilise piirkonna ulatus kvantifitseeriti trifenüültetrasooliumkloriidi (TTC) värvimisega. Südameproovid külmutati kohe {{0}} kraadi juures 10 minutiks ja tehti viis õhukest 1–2 mm viilu. Seejärel asetati viilud 1% TTC-fosfaatpuhvrisse (pH{5}},0) ja värviti 37 kraadi juures 20 minutit ning fikseeriti formaliinis. Pildid saadi digitaalkaameraga ning infarktipiirkonna (TTC-negatiivne) ja riskipiirkonna (TTC-positiivne) protsenti mõõdeti ImageJ tarkvara abil [25]. HE värvimiseks lõigati infarktiga piirkond välja ja fikseeriti 10-protsendilises formaldehüüdis ning sisestati seejärel parafiini. Pärast seda värviti kuded HE-ga (hematoksüliin-eosiin) ja uuriti valgusmikroskoobi all. Veetustatud manustatud sektsioonid ja tihendussektsioonid tellis Tianjin YiSheng Yuan Biotechnology Company (Tianjin, Hiina).

4.6. Spektrofotomeetrilised kaubanduslikud komplektid

Selles uuringus kasutatud kaubanduslikud komplektid osteti firmalt Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd. (Peking, Hiina) ja Nanjing Jiancheng Bioengineering Companylt (Nanjing, Hiina). Roti seerumis ja raku supernatandis müokardi vigastuse marker, laktaatdehüdrogenaas (LDH) ), hinnati kreatiinkinaasi (CK), glutatiooni (GSH) ja superoksiiddismutaasi (SOD) aktiivsust. Malondialdehüüdi (MDA) aktiivsust mõõdeti roti südame homogenaadiga. Kõik kaubanduslikud komplektid viidi läbi vastavalt tootja juhistele.

4.7.Statistika protsess

Kõiki katseid korrati vähemalt kolm korda. Katseandmeid töödeldi GraphPad Prism7 tarkvaraga ja iga rühma katsetulemus väljendati keskmisena ± standardhälbe (x± s). Rühmadevahelise statistilise olulisuse võrdlemiseks kasutati t-testi. P<0.05 was="" recorded="" as="" statistically="">

Viited

1. Uzdensky, AB; Demjanenko, S. Histooni atsetüülimine ja deatsetüülimine isheemilise insuldi korral. Neuraalne Regen. Res. 2021, 16, 1529–1530. [CrossRef] [PubMed]

2. Li, H.; Yin, A.; Cheng, Z.; Feng, M.; Zhang, H.; Xu, J.; Wang, F.; Qian, L. Na/K-ATPaasi/Src/ROS võimendussignaali raja nõrgenemine pNaktide'iga parandab müokardi isheemia-reperfusioonikahjustust. Int. J. Biol. Macromol. 2018, 118, 1142–1148. [CrossRef] [PubMed]

3. Levin, RM; Xia, L.; Wei, W.; Schuler, C.; Leggett, RE; Lin, ADY Ganoderma Lucidum'i kestaga purustatud eoste mõju küüliku kusepõie oksüdatiivsele stressile, kasutades isheemia/reperfusiooni in vivo mudelit. Mol. Kamber. Biochem. 2017, 435, 25–35. [CrossRef] [PubMed]

4. Tan, Z.; Liu, H.; Laul, X.; Ling, Y.; Tema, S.; Yan, Y.; Yan, J.; Wang, S.; Wang, X.; Chen, A. Honokioli järelravi parandab müokardi isheemiat/reperfusioonikahjustust, suurendades autofagilist väljavoolu ja vähendades rakusisest ROS-i tootmist. Chem. Biol. Suhelda. 2019, 307, 82–90. [CrossRef] [PubMed]

5. Hausenloy, DJ; Yellon, DM Müokardi isheemia-reperfusiooni kahjustus: tähelepanuta jäetud terapeutiline sihtmärk. J. Clin. Uurige. 2013, 123, 92–100. [CrossRef]

6. Yu, C.; Li, D.; Li, Z.; Yu, D.; Zhai, G. Sakubitriili/valsartaani mõju põletikule ja oksüdatiivsele stressile doksorubitsiinist põhjustatud südamepuudulikkuse mudelis küülikutel. Acta Pharmaceut. 2021, 71, 473–484. [CrossRef]

7. Wang, Y.; Che, J.; Zhao, H.; Tang, J.; Shi, G. Platycodin D inhibeerib oksüdatiivset stressi ja apoptoosi H9c2 kardiomüotsüütides pärast hüpoksia/reoksügeenimise kahjustust. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2018, 503, 3219–3224. [CrossRef]

8. Pavlovic, M.; BNáfrádi Rouster, P. Väga stabiilne ensüümi imiteeriv antioksüdantse toimega nanokomposiit. J. Colloid Interface Sci. 2019, 543, 174–182. [CrossRef]

9. Qi, HZ; Wangi, WZ; Tema, JY Deinococcus radioduransi antioksüdatiivne süsteem. Res. Microbiol. 2019, 171, 822–831. [CrossRef]

10. Shao, L.; Shao, Y.; Yuan, Y. Pinotsembriinflavanoon inhibeerib rakkude elujõulisust PC-3 inimese eesnäärmevähi korral, kutsudes esile raku apoptoosi, ROS-i tootmist ja rakutsükli peatamist. Acta Pharmaceut. 2021, 71, 669–678. [CrossRef]