Adenoviiruse vaktsiin, mis sisaldab kärbitud SARS-CoV-2 Spike Protein S1 subühikut, põhjustab hiirtel spetsiifilise immuunvastuse

Abstract:Tõhusa ja ohutu 2019. aasta koronaviirushaiguse (COVID-19) vaktsiini väljatöötamine on praeguste tingimuste valguses ülioluline lähenemisviis raske ägeda respiratoorse haiguse koroonaviirus 2 (SARS-CoV-2) pandeemia ohjamisel. Selles uuringus koostasime optimeeritud SARS-CoV-2 spike-geeni lühendatud segmendi (2043 bp, nimega S1), mis suutis kodeerida kärbitud S1 valku. Valku testiti, et teha kindlaks, kas see võib esile kutsuda hiirtel tõhusa immuniseerimise SARS-CoV vastu{11}}. S1 valgu olemasolu kinnitati immunofluorestsentsi ja Western blot analüüsiga. S1 geenifragmenti (Ad-S1) kandvat adenoviiruse vaktsiini manustati hiirtele intramuskulaarselt neli korda 4 nädala jooksul. SARS-CoV-2 S1 valgu humoraalne immuunsus ilmnes kõigil immuniseeritud hiirtel. Immuniseeritud hiirtelt saadud seerum näitas suurepärast infektsioonivastast toimet in vitro. Pärast Ad-S1-ga vaktsineerimist täheldati hiirtel tugevat humoraalset immuunvastust SARS-CoV-2 vastu, mis viitab sellele, et adenoviiruse vaktsiin võib aidata kaasa SARS-CoV-2 ja muude geneetiliselt eristatavate vaktsiinide väljatöötamisele. viirused.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Märksõnad: SARS-CoV-2; vaktsiinid; adenoviirusvektor; S1 geen; puutumatus

1. Sissejuhatus

2019. aasta koroonaviirushaigust (COVID-19) seostatakse sageli mitme organi puudulikkuse ja kõrge suremusega [1] ning see kujutab endast suurt ohtu avalikule turvalisusele kogu maailmas. 15. juuli 2022 seisuga on COVID{5}} pandeemia püsinud kogu maailmas – Maailma Terviseorganisatsioonile (WHO) teatati 557 917 904 kinnitatud juhtumist, sealhulgas 6 358 899 surmajuhtumist. Lisaks on 11. juuli 2022 seisuga manustatud kokku 12 130 881 147 vaktsiinidoosi. Seetõttu on uudsete koroonaviiruse (nCoV) vaktsiinide väljatöötamine ja väljatöötamine suure tähtsusega ning üks peamisi ülemaailmseid terviseprioriteete. S-valk on võtmetegur SARS-CoV-2 raske ägeda respiratoorse haiguse koronaviirus 2 (SARS-CoV-2) peremeesrakkudesse sisenemisel [2,3]. Valk seondub peremeesretseptoriga ja võimaldab viirusel sujuvalt peremeesrakku siseneda [4]. N-seotud glükaanid ulatuvad trimeeripinnalt välja ja kaunistavad S-valku ulatuslikult, mõjutades S-valgu voltimist, humoraalset immuunsust ja peremeesraku proteaasi töötlemist [5]. SARS-CoV-2 S-valgul on väiksem N-seotud glükaani tihedus kui teistel inimese patogeense koroonaviiruse poolt indutseeritud S-valkudel [6]. Seetõttu võib S-valk olla väga immunogeenne ja neutraliseerivate antikehade peamine sihtmärk. S-valgul on kolm struktuurset domeeni, mille hulgas S1 domeen on kõige olulisem S-valgu pinnaantigeen [4]. Seoses suurte rekombinantsete valkude tootmise raskustega (valgu S ekstratsellulaarne domeen on umbes 1300 aminohapet) ja infektsiooni, S1 (umbes 700 aminohappega) ja selle retseptorit siduva domeeni antikehast sõltuva võimenduse (ADE) riskiga (RBD, umbes 200 aminohapet) peetakse laialdaselt koronaviiruse vaktsiini kõige atraktiivsemaks potentsiaalseks sihtmärgiks [7, 8]. Inimese adenoviiruse serotüüpi 5 (HAdV-C5) kasutatakse laialdaselt põhiviroloogias geeniteraapia ja vaktsiini kohaletoimetamise vektorina [9]. HAdV-C5 on looduslikult mitmekesine ja võib parasiteerida enamikus peremeesorganismides, mis on loomkatsete arendamise aluseks. Vaktsiini kohaletoimetamisel ja geeniteraapias on laialdaselt kasutatud HAdV-C5-st konstrueeritud replitseeritavuse ja replikatsioonidefektidega rekombinantseid adenoviirusvektoreid [9,10]. Praegu on adenoviirused heaks kiidetud vaktsiinidena ägedate hingamisteede infektsioonide vastu ja selliseid vaktsiine, nagu malaaria ja HIV, on katsetatud palju{53}} [9]. Selles artiklis kirjeldame SARS-CoV{56}} inimese replikatsioonipuudulikku adenoviiruse vektorvaktsiini ning selle valmistamist ja rakendamist. Selles uuringus konstrueeriti adenoviiruse vaktsiin järgmiselt: vektoriks oli inimese replikatsioonipuudulik adenoviirus HAdV-C5 koos E1 ja E3 deletsiooniga, skeleti plasmiidiks oli rekombinantne adenoviirus pBHGlox∆E1,3Cre-ga, pakkiv rakuliin oli HEK293 rakud, ja sihtgeen oli SARS-CoV-2 kärbitud S1 valgu geen. S1 valgu ekspressioon vaktsiinis tuvastati Western blot ja immunofluorestsentsanalüüsidega. Spike-põhiste vaktsiinikandidaatide poolt esile kutsutud immuunvastuste kvaliteedi määramiseks uuriti üksikasjalikult vaktsineerimisjärgset antikehavastust. Vaktsiini immuunvastust hinnati seondumisantikehade testiga (ensüümseotud immunosorbentanalüüs [ELISA]) ja neutraliseerivate antikehade testiga. Meie tulemused on aluseks S1-valgul põhinevate COVID-19 vaktsiinide ja ravimeetodite väljatöötamisele ja hindamisele.

2. Materjalid ja meetod

2.1. Rakud ja loomad

Selles uuringus kasutati HEK293 ja Vero E6 ahvi neeru rakuliine. Mõlemat rakuliini kasvatati Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes (DMEM), millele oli lisatud 2% veise loote seerumit (FBS) ja 1% penitsilliini ja streptomütsiini, temperatuuril 37 °C 5% CO2 ja küllastunud niiskusega. Kakskümmend emast C57BL/6 hiirt (6–8 nädalat) osteti Zhejiangi provintsist Zhejiangi loomakatsekeskusest. Hiired jagati juhuslikult kahte rühma, igas rühmas oli 1 0 hiirt. Üks rühm immuniseeriti (100 µl intraperitoneaalne süstimine) Ad5 vektoriga, mis ekspresseeris SARS-CoV-2 piigivalku (Ad5-S), ja teist rühma PBS-iga (100 µL intraperitoneaalne süstimine) kontrollina. Viiruse koguhulk oli 5 × 109 VP. Kõik hiired immuniseeriti D0/D14 intramuskulaarse süstiga [11,12]. Päeval 14 võeti 100 ui perifeerset verd, seerum eraldati ja teine ​​süst tehti kaks tundi pärast vere kogumist. Päeval 28 koguti veri retroorbitaalse punktsiooniga ja seerum eraldati. Seonduvad antikehad tuvastati 3 päeva pärast iga verevõttu, neutraliseerivad antikehad tuvastati 7 päeva pärast iga verevõtmist ja tsütokiinid tuvastati 7 päeva pärast teist verevõtmist. Kõik hiired surmati; kõik testid viidi läbi rangelt kooskõlas Hiina Rahvavabariigi katseloomade hooldamise ja kasutamise juhistega ning Zhejiang Shureni ülikooli eetikanõukogu poolt heaks kiidetud.

2.2. Vaktsiinid

Kõik selles uuringus kasutatud SARS-CoV-2 tüved koguti COVID{2}} patsientidelt nõusoleku alusel. Nakkushaiguste diagnoosimise ja ravi riikliku võtmelaboratoorium töötas välja adenoviiruse vaktsiini (Vero rakk, WuHani tüvi, GISAID number: EPI_ISL_415711) SARS-CoV-2 vastu ja seejärel vaktsiin valmistati bioohutuse taseme (BSL) nõuetele vastavas keskkonnas. Vaktsiini spetsifikatsioon on 0,5 ml annuse kohta ja sisaldab Tris-i, NaCl-i, roosuhkrut, MgCl2.6H2O, C6H9N3O2, absoluutset etanooli ja SARS-CoV-2 S1 valku.

2.3. Rekombinantse adenoviiruse ehitus

SARS-CoV-2 S1 valgujärjestus (nr QRU91950.1) saadi ettevõttelt PubMed. Vastavalt geeni degeneratsioonile koostati imetajarakkude ekspressiooniks sobiv optimeeritud koodoni nukleotiidjärjestus, lähtudes eeldusest, et SARS-CoV-2 S1 valgu poolt kodeeritud produktivalgu aminohappejärjestus jäi muutumatuks. Kogupikkus oli 2043 bp. 50 prekursorjärjestus sünteesiti koeplasminogeeni aktivaatoriga (tPA) ning SARS-CoV-2 S1 aminohappeid 2–688 kodeeriv järjestus ja tPA prekursorjärjestus ligeeriti. Kozaki järjestus ja SpeI restriktsioonisait lisati stardikoodoni ette ja Xbal restriktsioonisait lisati pärast terminatsioonikoodonit. Ülaltoodud geenide nukleotiidjärjestused sünteesiti ja klooniti pUC18-sse Sangon Biotechi poolt, et saada sünteetilise geeni kloonitud plasmiid. Sünteesitud S1 geenijärjestus ja vektor pDC316 lõigati restriktsiooni endonukleaasidega SpeI ja Xbal. Sihtmärkfragment ja vektor võeti geelist välja ja ühendati, et moodustada süstikplasmiid. SARS-CoV-2 süstikplasmiid pakiti AdMax adenoviiruse süsteemi skeletiplasmiidiga pBHGloxd∆E1 ja 3Cre HEK293 rakkude kaastransfektsiooni teel. Viiruse esmane lahus saadi pärast korduvat külmutamist-sulatamist ja tsentrifuugimist ning viirust amplifitseeriti ja kultiveeriti pärast naastude puhastamist.

Tistanche kasulikud omadused meestele - tugevdavad immuunsüsteemi

Cistanche Enhance Immunity toodete vaatamiseks klõpsake siin

【Küsi lisa】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.4. Adenoviiruse tiitri määramine

Valiti hea tervisega HEK293 rakud ja resuspendeeriti, et valmistada 50 × 105 rakku/ml rakususpensiooni, mis külvati 24-süvendiga plaadile (1 ml süvendi kohta). ) ja kultiveeriti temperatuuril 37 ◦C 5% CO2 keskkonnas. Proov lahjendati seeriaviisiliselt kümnekordselt ja lahjendatud proov (0,1 ml) 10-5 kuni 10-8 rakuga inokuleeriti 24-süvendiga plaadile . Seejärel nakatati plaate 48 tunni jooksul temperatuuril 37 °C 5% CO2-ga. Seejärel eemaldati sööde, lisati eeljahutatud metanool (0,5 ml) ja proovid fikseeriti 20 minutiks temperatuuril –20 °C. Pärast fikseerimist pesti proove fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) ja blokeeriti 1% veise seerumi albumiiniga (BSA, 0,2 ml) temperatuuril 37 °C 1 tund. Järgmisena lisati primaarsed (Mouse Anti-Adenovirus Hexon, AbD Serotec 04000079, 1:2000) ja sekundaarsed (Kitse pAb kuni MS IgG2a (HRP), Abcam ab97245, 1:1000) antikehad ja inkubeeriti PBS-i 1 tund. kasutati pesemiseks. Pärast inkubeerimist lisati äsja valmistatud töölahus (0, 2 ml) ja inkubeeriti 5–10 minutit toatemperatuuril. Seejärel töölahus visati ära, proove pesti PBS-ga ja lisati uuesti PBS (1 ml). Arvutati keskmine positiivsete rakkude arv mikroskoopilises väljas (kat. CKX53, OLYMPUS Research Inverted System Microscope), kus valiti vaateväljas 5–50 positiivse rakuga gradient ja loendamiseks valiti juhuslikult vähemalt viis piirkonda. . Arvutati 24-kaevuplaadi igas süvendis olevate nägemisväljade arv. Seejärel arvutati viiruse tiiter järgmise valemi (1) järgi:

2.5. Reaalajas PCR

HEK293 raku mRNA ekspressiooni tuvastamiseks pärast viirusinfektsiooni ekstraheerisime vahe-RNA vastavalt TRIzoli kasutusjuhendile (Invitrogen, Waltham, MA, USA). Kogu RNA ekstraheeriti TRIzoliga ja töödeldi jääk-DNA eemaldamiseks RQ1 RNaasivaba DNaas I-ga (Promega, Madison, WI, USA). Komplementaarne DNA (cDNA) saadi ekstraheeritud RNA pöördtranskriptsiooniga, kasutades PrimerScript™ RT reaktiivikomplekti koos gDNA kustutuskomplektiga (Takara, Kusatsu, Jaapan). DNA fragmendid genereeriti sihtgeeni (S1) spetsiifiliste praimeritega P1 (50 -GGTGATTCTTCTTCAGGTTGGA-30) ja P2 (50 - GTTTCTGAGAGAGGGTCAAGTG-30 ). Geeni amplifitseeriti sisekontrollina (GAPHD) praimeritega P3 (50 -GTCTTCACCACCATGGAGAA-30 ) ja P4 (50 -TAAGCAGTTGGTGGTGCAG-30 ).

2.6. Western Blot

Rakulüsaat ja supernatant eraldati naatriumdodetsüülsulfaadi-polüakrüülamiidi geelelektroforeesiga (SDS-PAGE) ja kanti seejärel polüvinülideenfluoriidi (PVDF) membraanidele. Blotid visualiseeriti Western blot kujutise seadmega (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Lühidalt, membraanid kanti üle TBST-sse (50 ml Tris-HCl, pH 7,5, 8 g NaCl [0,5 ml], 0,2 g KCl, 0,5 ml Tween -20) 5% rasvavaba kuivpiimapulbriga ja loksutatakse värvieemaldusšeikeris toatemperatuuril 1 tund. Katse- ja kontrollrühmade membraanid eemaldati tihenduslahusest ja inkubeeriti primaarse antikehaga: [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:5000), kat #40591- T62, Sino Biological, Peking, Hiina)] toatemperatuuril. Primaarseid antikehi loksutati ja inkubeeriti üle öö värvitustaja loksutis temperatuuril 4 °C. Blotti loputati TBST lahusega ja inkubeeriti 2 tundi sekundaarse antikehaga [kitse küülikuvastane immunoglobuliin G (IgG) H&L (HRP) (1:10 000, kat. #ab6721, Abcam, Cambridge, UK)]. Pärast loputamist inkubeeriti blotte 1 minut LumiBest ECL Substrate'i lahuse komplektiga (kat. nr 4AW011-100, 4A Biotech) ja vaadeldi seejärel pildiseadmes.

2.7. Immunofluorestsentsanalüüs

HEK293 rakud (3 × 106 süvendi kohta) külvati 12-süvendiga plaatidele. 48 tunni pärast nakatati rakud S1 geeni sisaldava adenoviirusega (Ad-S1). 48 tunni pärast sööde aspireeriti ja rakke pesti üks kord 2% BSA-d sisaldava PBS-ga ja fikseeriti 15 minutiks metanooliga, mida oli eeljahutatud 15 minutit temperatuuril –20 °C. Pärast kolme pesemist 2% BSA-ga PBS-s permeabiliseeriti rakud 0,5% Triton X-100-ga 10 minutit. Seejärel blokeeriti rakud 1 tund 2 ml 2% BSA-ga, blokeeriv lahus visati ära ja rakke pesti kolm korda PBS-ga. Seejärel lisati igasse süvendisse 2 ml primaarset antikeha [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, kat. #40591-T62, Sino Biological)] ja inkubeeriti toatemperatuuril 1 tund või 4 ◦C üleöö. Seejärel loputati proovi kolm korda 2% BSA-ga 5 minutit ühe loputuse kohta. Järgmisena lisati igasse süvendisse 2 ml sekundaarset antikeha [kitse anti-küüliku IgG H&L (Alexa Fluor 488) (1:1000, kat. nr 550037, ZenBio)] ja inkubeeriti toatemperatuuril 1 tund. Seejärel loputati proove kolm korda 2% BSA-ga 5 minutit ühe loputuse kohta. Igasse süvendisse lisati 40 ui 6-diamidino-2-fenüülindooli (DAPI) lahust (2 ml, 1 mg/mL) (1:400, kat. nr S0001, Bioss, Woburn, MA, USA). ja reageeris 10 minutit pimedas. Analüüsi jälgiti EVOS™ M7000 pildisüsteemiga (kat. nr AMF7000, Invitrogen).

2.8. ELISA

SARS-CoV-2 S valk (1 µg/ml) kaeti öö läbi 96-süvendiga plaatidel (100 µL süvendi kohta) 0-ga. 05 M vesinikkarbonaatpuhver. Pärast pesemist PBST-ga (0,2 g KH2PO4, 2,9 g Na2HPO4·12H2O, 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 0,5 ml Tween-20) lisage vett 1000 ml-ni. korda, lisati blokeeriv lahus ja inkubeeriti 37 °C juures 1 tund. Seerumiproov lahjendati ja lisati igasse süvendisse (100 µl süvendi kohta). Pärast 1-tunnist inkubeerimist 37 °C juures pesti proove viis korda PBST-ga. Lisati primaarne antikeha [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, kat. #40591-T62, Sino Biological)] ja inkubeeriti 1 tund, seejärel proove pesti viis korda PBST-ga, millele järgnes 1-tunnine inkubeerimine 37 ◦C juures mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud sekundaarse antikehaga [kitse küülikuvastane IgG H&L (HRP) (1:10 000, kat. #ab6721, abcam)] ja viis korda peseb PBST-ga. Pärast 3, 30, 5 ja 50-tetrametüülbifenüülanhüdriidi lisamist 5 minutiks peatati reaktsioon 2 M väävelhappega. Optilist tihedust mõõdeti lainepikkustel 450 nm ja 630 nm ensüümi märgistusseadmega (Molecular Devices, SpectraMax 190) ja sobitati seejärel standardkõverale.

Cistanche tubulosa eelised- tugevdada immuunsüsteemi

2.9. Tsütokiinide määramine 

Plaati (kat. #T-k15048D-1, MSD) pesti kolm korda pesupuhvriga 150 µL süvendi kohta ja igasse süvendisse lisati 50 µl ettevalmistatud proovi. Seejärel suleti plaat kleepuva plaaditihendiga ja inkubeeriti toatemperatuuril loksutades 2 tundi. Järgmisena pesti plaati kolm korda 150 µl/süvendi pesupuhvriga ja igasse süvendisse lisati 25 µL tuvastamisantikeha lahust. Plaat suleti uuesti ja inkubeeriti toatemperatuuril loksutades 2 tundi. Järgmisena pesti plaati kolm korda vähemalt 150 ui/süvendi pesupuhvriga; Igasse süvendisse lisati 150 µl 2x lugemispuhvrit T (MSD) ja plaati analüüsiti MSD seadmega.

2.10. Neutraliseeriv antikeha

2.10.1. Pseudoviiruse neutraliseerimise test

Hiire seerumi neutraliseerimise aktiivsust testiti vesikulaarse stomatiidiviiruse pseudoviiruse süsteemi (VSV) abil. Seerum inaktiveeriti veevannis {{0}},5 tundi temperatuuril 56 ◦C ja seejärel seeriaviisiliselt lahjendati vajaliku vahemikuni. HEK293 rakud plaaditi 96-süvendiga plaadile. Lahjendatud seerum segati 200 CCID50 (viiruse annus, mis võib nakatada 50% rakukultuurist)/100 µL viirussuspensiooni vahekorras 1:1 ja pandi CO2 inkubaatorisse (37 ± 1 ◦C) 2 h. Järgmisena lisati igasse süvendisse 100 µL viiruse säilituslahust, mis sisaldas 0,5% penitsilliini-streptomütsiini topeltantikeha, ja neutraliseeritud segu inokuleeriti 96-süvendiga plaadile, mis sisaldas rakke koguses 100 µL süvendi kohta, kahe kordussüvendiga. iga lahjendus. Samal ajal määrati normaalne rakukontroll ja rakke inkubeeriti CO2 inkubaatoris (37 ± 1 °C) 96 tundi. Seejärel lahjendati 200 CCID50/100 µL viiruslahust väärtuseni 10-1~10-3. 96-Süvendplaadi rakukultuuri sööde visati ära, igasse süvendisse lisati 150 µL viiruse säilituslahust ja viiruselahuse lahjendus inokuleeriti kontsentratsiooniga 10-1~{{33}. } süvendi 96-plaadi süvenditesse (50 µL süvendi kohta). Iga lahjendust korrati 8 süvendis; samal ajal määrati normaalne rakukontroll, millele järgnes kultiveerimine 96 tundi. Muutusi raku CPE-s täheldati pööratud mikroskoobi all. Normaalsel rakukontrollil ei tohiks olla tsütopaatilisi muutusi ja positiivsel kontrollil peaks olema CPE muutusi. Neutraliseerimise lõpp-punktid (seerumi lahjendused teisendati logaritmideks) arvutati CPE jälgimise teel. Seronegatiivse/positiivse kriteeriumiks oli positiivse/negatiivse kriteeriumina 1:12,<1:12 was negative, and ≥1:12 was positive. 

2.10.2. Reaalajas neutraliseerimise test

Hiire seerumi neutraliseerimisaktiivsust hinnati elusa neutraliseerimise testiga. Lahjendatud seerum segati SARS-CoV-2-ga ja inkubeeriti 37 ◦C juures 1 tund. Segu lisati 96-süvendiga plaadile, et nakatada Vero E6 rakke. Pärast 72-h inkubeerimist 37 ◦C juures täheldati viiruse tsütopaatilist toimet (CPE) × 40 suurendusel ja arvutati neutraliseerimise tiiter (viirusnakkuse neutraliseerimiseks vajaliku 50% seerumi lahjenduse pöördväärtus). Kõik ülaltoodud protseduurid viidi läbi bioohutuse 3. taseme keskkonnas.

2.11. Statistiline analüüs

Statistilised analüüsid viidi läbi kahe valimiga t-testiga, kasutades SPSS 26. p-väärtused Oluliseks peeti vähem kui 0,05 või sellega võrdsed. Keskne tendents mõõdeti geomeetrilise keskmise tiitriga (GMT).

3. Tulemused

3.1. Rekombinantse adenoviiruse ehitus

Saadi õige insertsiooniga rekombinantne adenoviiruse süstikplasmiid pAdeno-CMV-S1; selle struktuuriskeem on näidatud joonisel 1. Rekombinantne adenoviirus sisaldas HAdV-C5 genoomi, millel puudus E1/E3 piirkond. Shuttle-plasmiidi ja tsütoskeleti plasmiidi transfektsiooniga HEK293 rakkudes saadud rekombinantse adenoviirusvektori skemaatiline diagramm on näidatud joonisel 1.

3.2. Rekombinantse adenoviiruse iseloomustus

Sihtgeeni sisaldav rekombinantne plasmiid identifitseeriti PCR abil (geelelektroforeesi tulemuste kohta vt joonis 2A). See oli korduv katse. Praimeri järjestused olid MCMV-F ggtataagaggcgcgaccag ja S1-R acaataagggactggggtc ning sekveneerimine kinnitas, et järjestus oli disainiga kooskõlas. SARS-CoV-2 S1 ekspressioon rakkudes tuvastati Western blot analüüsiga (joonis 2B) ja kaudse immunofluorestsentsiga (joonis 2C). Riba värvus (~ 75 kDa) tuvastati Western blot analüüsiga ja see oli kooskõlas eeldatava riba positsiooniga. Transkriptsiooni tasemel tuvastati S1 in vitro ekspressioon PT-PCR abil. Tulemused näitasid, et S1 mRNA ekspressioon HEK-293 rakkudes oli oluliselt kõrgem kui kontrollrühmas.

Joonis 1. Rekombinantse adenoviiruse vaktsiini konstrueerimine ja eksperimentaalne strateegia. (A) pAdeno-CMV-S1 on rekombinantne adenoviiruse süstikplasmiid, mis sisaldab sihtgeeni S1. pBHGlox∆E1,3Cre on adenoviiruse skeleti plasmiid. pBHGlox∆E1,3Cre ja pAdeno-CMV-S1 ekstraheeriti QIAGEN plasmiidi ekstraheerimise komplektiga (Beijing North Yitao Trading Co., LTD., Peking, Hiina). Üks päev enne transfektsiooni passeeriti HEK293 rakud 25 cm2 rakukultuuri kolbi. Kultuurisöötmeks oli DMEM, mis sisaldas 5% FBS-i ilma antibiootikumideta. Teisel päeval valiti 60–80% rakkudest ja rakkudele lisati transfektsioonilahus. Pärast 7-päevast transfektsiooni kaabiti rakud ära, tsentrifuugiti, supernatant visati ära ja rakud elustati PBS-ga. Rakke külmutati-sulatati korduvalt –80 ◦ ja 37 ◦ C juures. Pärast tsentrifuugimist sisaldas supernatant primaarset viiruse lahust. Rekombinantne adenoviiruse tüvi puhastati, amplifitseeriti ja saadi pärast edasist töötlemist ning tähistati kui Ad-S1. Vaktsiini süstiti hiirtele intramuskulaarselt järeluuringuteks. (B) Immuniseerimise ja vere eemaldamise kujutatud ajakava.

3.3. Adenoviiruse tiiter

Selles katses arvutati viies mikroskoopilises väljas keskmiselt kuus positiivset rakku ja süvendis olevat viirust lahjendati 108 korda. Materjalide ja meetodi jaotises kirjeldatud valemi põhjal oli adenoviiruse tiiter 4,74 × 1011 naastu moodustavat ühikut (pfu)/ml (joonis 2D).

3.4. Vaktsineerimisjärgne rakuline immuunsus

Katseperioodi jooksul esines statistiliselt olulisi muutusi seerumi tsütokiinides (p Väiksem või võrdne 0,05), mis näitas peamiselt seda, et Keratinocyte kemoatraktandi/inimese kasvu reguleeritud onkogeeni (KC/GRO) kontsentratsioon oli vähenenud ning IFN-, IL-10, IL-12p70, IL-1, IL-2, IL-4, IL{{10} } ja TNF- suurenesid, samas kui IL-6 kontsentratsioon oluliselt ei muutunud (joonis 3).

Joonis 2. Rekombinantse HAdV-C5–SARS-CoV-2 S1 valgu tuvastamine ja adenoviiruse tiitri määramine. (A) Rekombinantse plasmiidi PCR tuvastamine sihtgeeniga S1. (B) SARS-CoV-2 Western blot tuvastamine. Eksponentsiaalse kasvuga HEK293 rakke nakatati SARS-CoV-2-ga 48 tundi, seejärel ekstraheeriti raku valk ja eraldati SDS-PAGE abil. SARS-CoV-2 ekspressiooni kinnitati Western blot analüüsiga kitse küülikuvastase IgG-ga. (C) Ad-S1-ga nakatunud HEK{18}} rakkude immunofluorestsentsmikroskoopia (roheline). Rakud värviti tuumade värvimiseks 40 6-diamidino- 2-fenüülindooliga (DAPI). Skaalariba 1000 µm. (D) Mõõtmiseks kasutati naastude analüüsi. Mikrograafid, mis kujutavad 10-5, 10-6, 10-7 ja 10-8 lahjendust (vasakult paremale).

Joonis 3. Ad-S1 indutseeris 1/2 tüüpi tsütokiinide, 1. tüüpi interferoonide ja teiste tsütokiinide muutunud plasmatasemeid. Tulemused tuvastati hiirtelt vere võtmisega 7 päeva pärast esimest immuniseerimist. Andmed on esitatud kastide ja vurrude hajuvusdiagrammidena. Iga ring tähistab ühte isikut. p-väärtused arvutati kahe valimiga t-testi abil.

3.5. SARS-CoV-2 S1-vastaste antikehade tuvastamine pärast immuniseerimist

ELISA näitas, et SARS-CoV-2-spetsiifilised antikehad esinesid hiirtel, kellele süstiti esimene ja teine ​​Ad-S1, kuid mitte hiirtel, kellele süstiti kontroll-adenoviiruse kapsiidi või PBS-i lahust (Ad/PBS) (joonis 4A). Ad-S{10}}vaktsineeritud hiirtel tuvastati IgG tiitrid 1:210 ja 1:212 vastavalt kaks nädalat pärast esimest ja teist immuniseerimist. Lahjendustiiter 28 päeva pärast vaktsineerimist (D28, GMT 2297,4) oli 61- korda kõrgem kui 14. päeval (GMT 378,9).

Joonis 4. Ad-S1 indutseeris hiirtel kõrged antikehade tiitrid (A) ja neutraliseerimisaktiivsuse (B, C). (A) Ad-S1-immuniseeritud hiirte SARS-CoV-2-spetsiifilise seerumi IgG ELISA. (B) Ad-S1-immuniseeritud hiirte seerumi pseudoviiruse aktiivsuse analüüs. (C) Ad-S{10}}immuniseeritud hiirte seerumi neutraliseeriva toime analüüs

3.6. Neutraliseerivate antikehade test

SARS-CoV-2 nakatamine Vero E6 rakkudega võimaldas tuvastada neutraliseerivat aktiivsust immuniseeritud hiire seerumis (joonis 4B, C). Ad-S1-immuniseeritud Vero E6 rakkude D14 ja D28 neutralisatsioonitiitrid SARS-CoV{{10}} elusviirusega nakatumise vastu in vitro olid vastavalt 1:24,3 ja 1:26,3. Pseudoviiruse test andis sarnaseid tulemusi elusviiruse testiga, neutraliseerimistiitritega vastavalt kuni 1:28,1 ja 1:29,6 14. ja 28. päeval. D28 pseudoviirust neutraliseeriv tiiter (GMT 769.0) oli 27- korda kõrgem kui D14 (GMT 283.7).

4. Arutelu

We have been working to develop vaccines to stop the COVID-19 pandemic and its rapid spread. The hunt for an effective vaccination against SARS-CoV-2 continues and existing vaccine development strategies include whole virus particle vaccines, live attenuated virus vaccines, purified virus subunit vaccines, and genetic vaccines [13–17]. The epitopes on spike proteins detected in infected serum are highly antigenic, with the ability to induce a strong humoral immune response and neutralize antibodies in individuals infected with SARS-CoV-2 and recovered from COVID-19 [18,19]. The S protein appears to be an ideal target for vaccination against SARS-CoV-2 infection [20]. The S protein S1 subunit induced effective immunity against SARS-CoV-2 and protected against SARS-CoV-2 in animal models [21,22]. The SARS-CoV-2 truncated N protein has a better expression effect than the N protein [23]. Based on this, we selected the truncated S1 protein in this experiment. In other studies, more than 90% of the neutralization activity of the Moderna mRNA vaccine was caused by the RBD antibody, and the neutralization titer directly decreased from >1000 kuni<25 after the RBD antibody had been eliminated [24]. Higher levels of RBD-specific IgG were associated with increased serum neutralization [25]. Evidently, the S protein demonstrates a greater immune response to the RBD region, and the S1 protein containing RBD can induce neutralizing antibodies with a higher titer than the S protein [26]. Antigens delivered by adenovirus vectors induce strong cellular and humoral immunity after a single immunization, making them useful as an emergency prevention tool in a pandemic [27]. Adenovirus-based vaccine strategies are therefore an important part of the fight against SARS-CoV-2 infection.

Selles uuringus konstrueerisime rekombinantse adenoviiruse SARS-CoV-2 vaktsiini, mis sisaldas SARS-CoV-2 S1 subühikut ja nimetasime selle Ad-S1. Sarnaselt CanSinoBIO-ga, mis on turustamiseks heaks kiidetud [28], kasutasime selles vaktsiinis HAdV-C5. Adenoviirust kasutatakse laialdaselt rekombinantses geeniteraapias ja vaktsiinivektorina. HAdV-C5 seropositiivsuse määr on tavapopulatsioonis aga koguni 75–80% [29]. See tähendab, et säilitamiseelne immuunsus HAdV-C5 vektorite vastu vähendab oluliselt vaktsiinist põhjustatud immuunsust. Ühendkuningriigis Oxfordi ülikoolis välja töötatud ChAdOx1 nCoV-19 kasutab šimpansi adenoviiruse vektorit, millel seevastu on inimestel madalam seropositiivsuse määr ja positiivse tulemuse korral tavaliselt madalam seerumi antikehade tiiter [30] . Seetõttu saab adenoviiruse vaktsiini kaitsva efektiivsuse suurendamiseks uurida adenoviiruse vektoreid, mis suudavad vältida olemasolevat immuunsust. Käesolevas uuringus määrati hiirte seerumi staatus enne ja pärast immuniseerimist ELISA ja neutraliseerimistestidega ning see andis tõendeid vaktsiinikandidaatide humoraalse immuunsuse kohta. Pärast vaktsiini intramuskulaarset süstimist hiirtele toodetud seerum kaitses tõhusalt Vero E6 rakke SARS-CoV-2 nakkuse eest in vitro (joonis 4). Samuti tuvastasime pärast teist immuniseerimist hiirtel tugevama immuunvastuse ja parema kaitse (joonis 4). Meie katsetulemused on sarnased tavapäraste katsetulemustega.

Kuna SARS-CoV-2 uuringud jätkuvad, on mitmed uuringud näidanud, et SARS-CoV-2 nakkuse sekundaarne tsütokiinitorm võib mõjutada T-rakkude tootmist, mistõttu on patsientidel raske säilitada pikaajalist immuunsust. SARS-CoV-2 [31]. Seetõttu on vaja kindlaks teha, kas Ad-S1 võib indutseerida hiirtel T-rakkude poolt vahendatud immuunsust. Meie tulemused näitasid, et Ad-S1 rühmas IFN- ja IL-12 kontsentratsioonid suurenesid ja IL-4 kontsentratsioonid vähenesid, mis näitab, et vaktsiinist põhjustatud Th1-rakkude ellujäämine ja kasv hiirtel. IL-12, IL-10 ja TNF-sekretsioon Th1-rakkude poolt suurenes katserühmas veidi. Need tulemused näitasid, et Ad-S1 kutsus hiirtel tõhusalt esile Th{26}}kallutatud T-raku vastuse [32]. Suurenenud IL-5 näitas, et Th2 rakud osalevad ka immuunvastuses ja tekitavad teatud mõjusid. KC/GRO kontsentratsioon katserühmas oli oluliselt vähenenud võrreldes PBS-i kontrollrühma omaga, mis võis olla tingitud vähenenud neutrofiilide kemotaksist, mis pärssis põletikulist vastust ja võimaldas vaktsiini kõrvaltoimeid veidi kontrollida. See oleks kasulikum immuunpuudulikkusega inimestele, näiteks eakatele või keemiaravi saavatele patsientidele. Li M. et al. [29] töötasid välja adenoviiruse vaktsiini, kasutades vektorina Ad68. Tulemused näitasid, et SARS-CoV-2 in vivo neutraliseerivat aktiivsust suudeti tuvastada kahe nädala jooksul pärast BALB/c hiirte intramuskulaarset immuniseerimist ja seejärel suurenemine jätkus ning neutraliseerivate antikehade tiiter (PRNT ID50) jõudis kell kaheksa 957,3-ni. nädalaid. Samal ajal uurisid Liu J. et al. [33], töötati välja vaktsiinid, kasutades vektoritena AdC6 ja AdC68; 14 päeva pärast manustamist tekitati nii seondumis- kui ka neutraliseerivate antikehade vastused pärast immuniseerimist IgG tiitriga 7108 (geomeetriline keskmine tiiter, GMT; AdC6) ja 5489 (GMT, AdC68). Pseudoviiruse neutraliseerimise testi neutraliseerimistiiter 50 (NT50) oli 125 (GMT, AdC6) ja 67 (GMT, AdC68).

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Käesolevas uuringus tuvastati Ad-S1-ga vaktsineeritud hiirtel ELISA abil IgG tiitrid 1:1010 ja 1:122 vastavalt kaks nädalat pärast esimest ja teist immuniseerimist. Ad-s1 lahjendustiiter oli 378,9 (GMT) 14 päeva pärast nakatamist ja 2297,4 (GMT) 28 päeva pärast inokuleerimist. Neutraliseerimisantikehade testis näitasid Ad-S1-ga immuniseeritud Vero E6 rakud 1:24,3 ja 1:26,3 D14 ja D28 neutralisatsiooni elusa SARS-CoV-2 viiruse in vitro nakatamise vastu. Pseudoviiruse neutralisatsioonitiitrid D14 ja D28 olid vastavalt 283,7 (GMT) ja 769,0 (GMT). Seega oli selles uuringus kasutatud vaktsiin hiiremudeli immuunvastuse osas tõhusam.

Katsetingimuste piiratuse tõttu ei teinud me katsehiirte põrna immuunrakkude ensüümiga seotud immunosorbentpunkti (ELISpot) analüüsi. Lisaks ei saanud SARS-CoV-2 rünnakukaitsekatseid hiirtel läbi viia füüsilise kaitse labori piirangute tõttu. Siiski leidsime, et vaktsiinil oli hiiremudelites kõrge efektiivsus ja seda saab kasutada ideaalse reservvaktsiini tüvena. Lisaks tuleks potentsiaalsete SARS-CoV-2 vaktsiinikandidaatide immunogeensust, ohutust ja efektiivsust uurida täiendavate loommudelitega (nt küülikud, primaadid, kährikud, koerad), kuna hiiremudelid ei pruugi täielikult inimese immunoloogilisi katseid dubleerida. Funktsioonid.

cistanche taime suurendav immuunsüsteem

5. Kokkuvõtted

Meie adenoviiruse vaktsiini prekliinilistest uuringutest saadud andmed näitasid, et vaktsiinil on piisav ohutus ja tõhusus. Seetõttu võib see olla paljutõotav ja teostatav profülaktiline vaktsiin SARS-CoV-2 nakkuse vastu.

Viited

1. Trougakos, IP; Stamatelopoulos, K.; Terpos, E.; Tsitsilonis, OE; Aivalioti, E.; Paraskevis, D.; Kastritis, E.; Pavlakis, GN; Dimopoulos, MA Uurib SARS-CoV-2 elutsüklit, patofüsioloogiat ja ratsionaliseeritud ravi, mis on suunatud COVID-19 kliinilistele tüsistustele. J. Biomed. Sci. 2021, 28, 9. [CrossRef]

2. Pillay, TS kuu geen: 2019-nCoV/SARS-CoV-2 uus koroonaviiruse spike-valk. J. Clin. Pathol. 2020, 73, 366–369. [CrossRef]

3. Šeinin, M.; Jeong, B.; Paidi, RK; Pahan, K. Kopsuvähi regressioon hiirtel SARS-CoV-2 Spike S1 intranasaalsel manustamisel. Cancers 2022, 14, 5648. [CrossRef]

4. Kadam, SB; Sukhramani, GS; Bishnoi, P.; Pable, AA; Barvkar, VT SARS-CoV-2, pandeemiline koroonaviirus: Molekulaarne ja struktuurne ülevaade. J. Basic Microbiol. 2021, 61, 180–202. [CrossRef]

5. Sternberg, A.; Naujokat, C. Koronaviiruse SARS-CoV-2 spike protein struktuursed omadused: vaktsineerimise eesmärgid. Life Sci. 2020, 257, 118056. [CrossRef] [PubMed]

6. Seinad, AC; Tortorici, MA; Frenz, B.; Snijder, J.; Li, W.; Rey, FA; DiMaio, F.; Bosch, BJ; Veesler, D. Krüoelektronmikroskoopia abil täheldatud koronaviiruse piigivalgu glükaanikilp ja epitoobi maskeerimine. Nat. Struktuur. Mol. Biol. 2016, 23, 899–905. [CrossRef] [PubMed]

7. Wang, Y.; Wang, L.; Cao, H.; Liu, C. SARS-CoV-2 S1 on COVID-19 subühiku vaktsiini antigeenina parem kui RBD. J. Med. Virol. 2021, 93, 892–898. [CrossRef]

8. Theoharides, TC; Conti, P. Olge teadlik SARS-CoV-2 spike-valgust: seal on rohkem, kui esmapilgul paistab. J. Biol. Regul. Homeost. Agendid 2021, 35, 833–838. [CrossRef] [PubMed]

9. Guo, X.; Deng, Y.; Chen, H.; Lan, J.; Wang, W.; Zou, X.; Hung, T.; Lu, Z.; Tan, W. Süsteemne ja limaskestade immuunsus hiirtel, mis on esile kutsutud ühekordse immuniseerimisega inimese adenoviiruse tüüp 5 või 41 vektoripõhiste vaktsiinidega, mis kannavad Lähis-Ida respiratoorse sündroomi koronaviiruse spike-valku. Immunology 2015, 145, 476–484. [CrossRef] [PubMed]

10. Gao, J.; Mese, K.; Bunz, O.; Ehrhardt, A. Kaasaegne inimese adenoviiruse vektoroloogia terapeutiliste lähenemisviiside jaoks. FEBS Lett. 2019, 593, 3609–3622. [CrossRef]

11. Xing, K.; Tu, XY; Liu, M.; Liang, ZW; Chen, JN; Li, JJ; Jiang, LG; Xing, FQ; Jiang, Y. COVID-19 vaktsiinide tõhusus ja ohutus: süstemaatiline ülevaade. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi 2021, 23, 221–228. [CrossRef]

12. Voysey, M.; Clemens, SAC; Madhi, SA; Weckx, LY; Folegatti, PM; Aley, PK; Angus, B.; Baillie, VL; Barnabas, SL; Bhorat, QE; et al. ChAdOx1 nCoV-19 vaktsiini (AZD1222) ohutus ja efektiivsus SARS-CoV-2 vastu: nelja randomiseeritud kontrollitud uuringu vaheanalüüs Brasiilias, Lõuna-Aafrikas ja Ühendkuningriigis. Lancet 2021, 397, 99–111. [CrossRef] [PubMed]

13. Li, C.; Guo, Y.; Fang, Z.; Zhang, H.; Zhang, Y.; Chen, K. Heakskiidetud COVID{1}} vaktsiinide kaitsetõhususe analüüs erinevate mutantide vastu. Esiosa. Immunol. 2022, 13, 804945. [CrossRef] [PubMed]

14. Tanriover, MD; Kas ˘ganay, HL; Akova, M.; Güner, HR; Azap, A.; Akhan, S.; Köse, ¸S.; Erdinç, F.; Akalın, EH; Tabak, Ö.F.; et al. Inaktiveeritud täisviiruse SARS-CoV-2 vaktsiini (CoronaVac) efektiivsus ja ohutus: Türgis läbiviidud topeltpimeda randomiseeritud platseebokontrollitud 3. faasi uuringu vahetulemused. Lancet 2021, 398, 213–222. [CrossRef]

15. Xia, S.; Zhang, Y.; Wang, Y.; Wang, H.; Yang, Y.; Gao, GF; Tan, W.; Wu, G.; Xu, M.; Lou, Z. Inaktiveeritud SARS-CoV-2 vaktsiini ohutus ja immunogeensus, BBIBP-CorV: randomiseeritud topeltpime platseebokontrollitud 1. faasi uuring. Lancet Infect. Dis. 2021, 21, 39–51. [CrossRef] [PubMed]

16. Yang, S.; Li, Y.; Dai, L.; Wang, J.; Tema, P.; Li, C.; Fang, X.; Wang, C.; Zhao, X.; Huang, E.; et al. Rekombinantse tandem-korduva dimeerse RBD-põhise valgu subühiku vaktsiini (ZF2001) ohutus ja immunogeensus COVID-19 vastu täiskasvanutel: kaks randomiseeritud topeltpimedat platseebokontrolliga 1. ja 2. faasi uuringut. Lancet Infect. Dis. 2021, 21, 1107–1119. [CrossRef]

17. Mallapaty, S. India DNA COVID vaktsiin on maailmas esimene, neid on tulemas. Loodus 2021, 597, 161–162. [CrossRef]

18. Grifoni, A.; Weiskopf, D.; Ramirez, SI; Mateus, J.; Dan, JM; Moderbacher, CR; Rawlings, SA; Sutherland, A.; Premkumar, L.; Jadi, RS; et al. SARS-CoV-2 koroonaviiruse T-rakkude reaktsioonide sihtmärgid COVID-19 haigust põdevatel inimestel ja puutumata isikutel. Cell 2020, 181, 1489–1501.e1415. [CrossRef]

19. Cao, Y.; Su, B.; Guo, X.; Sun, W.; Deng, Y.; Bao, L.; Zhu, Q.; Zhang, X.; Zheng, Y.; Geng, C.; et al. Tugevad SARS-CoV-vastased neutraliseerivad antikehad-2, mis on tuvastatud taastuvate patsientide B-rakkude suure läbilaskevõimega üherakulise sekveneerimisega. Cell 2020, 182, 73–84.e16. [CrossRef]

20. Amanat, F.; Krammer, F. SARS-CoV-2 Vaktsiinid: olekuaruanne. Immunity 2020, 52, 583–589. [CrossRef]

21. Li, Y.; Bi, Y.; Xiao, H.; Yao, Y.; Liu, X.; Hu, Z.; Duan, J.; Yang, Y.; Li, Z.; Li, Y.; et al. Uudne DNA ja valgu kombinatsiooni COVID{1}} vaktsiinipreparaat pakub täielikku kaitset SARS-CoV-2 vastu reesusmakaakidel. Tekkima. Mikroobid nakatavad. 2021, 10, 342–355. [CrossRef]

22. Du, L.; Tema, Y.; Zhou, Y.; Liu, S.; Zheng, BJ; Jiang, S. SARS-CoV spike protein – sihtmärk vaktsiini ja terapeutilise väljatöötamise jaoks. Nat. Rev. Microbiol. 2009, 7, 226–236. [CrossRef] [PubMed]

23. Yue, L.; Cao, H.; Xie, T.; Long, R.; Li, H.; Yang, T.; Yan, M.; Xie, Z. SARS-CoV-2 N-terminaalselt kärbitud nukleokapsiidi valk kui parem seroloogiline marker kui terve nukleokapsiidi valk inaktiveeritud SARS-CoV-2 immunogeensuse hindamisel. J. Med. Virol. 2021, 93, 1732–1738. [CrossRef] [PubMed]

24. Greaney, AJ; Loes, AN; Gentles, LE; Crawford, KHD; Starr, TN; Malone, KD; Chu, HY; Bloom, JD SARS-CoV-2 mRNA-1273 vaktsiin kutsub esile rohkem RBD-le keskendunud neutraliseerimise, kuid laiema antikehade seondumise RBD-s. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Mantus, G.; Nyhoff, LE; Kauffman, RC; Edara, VV; Lai, L.; Floyd, K.; Shi, PY; Ähvardused, VD; Edupuganti, S.; Scherer, EM; et al. Ägeda SARS-CoV-2 infektsiooni rakuliste ja seroloogiliste reaktsioonide hindamine näitab retseptoriga seonduva domeeni funktsionaalset tähtsust. J. Immunol. 2021, 206, 2605–2613. [CrossRef]

26. Tema, Y.; Zhou, Y.; Liu, S.; Kou, Z.; Li, W.; Farzan, M.; Jiang, S. SARS-CoV spike-valgu retseptoriga seonduv domeen indutseerib väga tugevatoimelisi neutraliseerivaid antikehi: mõju allüksuse vaktsiini väljatöötamisele. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004, 324, 773–781. [CrossRef]

27. Deng, S.; Liang, H.; Chen, P.; Li, Y.; Li, Z.; Fännid.; Wu, K.; Li, X.; Chen, W.; Qin, Y.; et al. Viiruse vektorvaktsiini väljatöötamine ja rakendamine COVID{1}} pandeemia ajal. Mikroorganismid 2022, 10, 1450. [CrossRef]

28. Zhu, FC; Guan, XH; Li, YH; Huang, JY; Jiang, T.; Hou, LH; Li, JX; Yang, BF; Wang, L.; Wang, WJ; et al. Rekombinantse adenoviiruse tüüpi -5-vektoriga COVID-19 vaktsiini immunogeensus ja ohutus 18-aastastel ja vanematel tervetel täiskasvanutel: randomiseeritud topeltpime platseebokontrolliga 2. faasi uuring. Lancet 2020, 396, 479–488. [CrossRef]

29. Li, M.; Guo, J.; Lu, S.; Zhou, R.; Shi, H.; Shi, X.; Cheng, L.; Liang, Q.; Liu, H.; Wang, P.; et al. Üheannuseline immuniseerimine šimpansi adenoviirusel põhineva vaktsiiniga kutsub esile püsiva ja kaitsva immuunsuse SARS-CoV-2 nakkuse vastu. Esiosa. Immunol. 2021, 12, 697074. [CrossRef]

30. Guo, J.; Mondal, M.; Zhou, D. Uute vaktsiinivektorite väljatöötamine: šimpansi adenoviirusvektorid. Humm. Vaktsiinid Immunother. 2018, 14, 1679–1685. [CrossRef]

31. Kaneko, N.; Kuo, HH; Boucau, J.; talunik, JR; Allard-Chamard, H.; Mahajan, VS; Piechocka-Trocha, A.; Lefteri, K.; Osborn, M.; Bals, J.; et al. Bcl-6-ekspresseerivate T-folliikulite abirakkude ja idukeskuste kaotus COVID-i korral-19. Cell 2020, 183, 143–157.e113. [CrossRef] [PubMed]

32. Lexberg, MH; Taubner, A.; Albrecht, I.; Lepenies, I.; Richter, A.; Kamradt, T.; Radbruch, A.; Chang, HD IFN- ja IL-12 sünergiseerivad, et muuta in vivo genereeritud Th17 Th1/Th17 rakkudeks. Eur. J. Immunol. 2010, 40, 3017–3027. [CrossRef] [PubMed]

33. Liu, J.; Xu, K.; Xing, M.; Zhuo, Y.; Guo, J.; Du, M.; Wang, Q.; An, Y.; Li, J.; Gao, P.; et al. Heteroloogne esmane immuniseerimine šimpansi adenoviirusvektoritega kutsub esile tugeva ja kaitsva immuunsuse SARS-CoV-2 nakkuse vastu. Cell Discov. 2021, 7, 123. [CrossRef] [PubMed]