Akteosiid Hiina looduslikus taimes-Cistanche'is neeruhaiguste leevendamiseks--I osa
Mar 03, 2022
Kontakt: emily.li@wecistanche.com
Akteosiidi looduslik toode leevendab neerukahjustusi diabeediga db/db hiirtel ja HK-2 rakkudel, reguleerides NADPH/oksüdaas-TGF-/Smad signaalirada
Qinwen Wang|Xinxin Dai jt
Selle uuringu eesmärk oli uurida selle kaitsvaid toimeid ja mehhanismeakteosiidDKD kohta diabeedi isastel db/db hiirtel ja kõrge glükoosisisaldusega indutseeritud HK-2 rakkudel. Diabeedi db/db hiired jagati juhuslikult mudelrühma, metformiini rühma, irbesartaani rühma jaakteosiidGrupp. Vaatlesime looduslikku toodetakteosiidavaldades olulist mõjuneerude kaitsebiokeemiliste näitajate ja endogeensete metaboliitide analüüsi, histopatoloogiliste vaatluste ja Western blot analüüsi kaudu. In vitro katsetes kasutati kõrge glükoosisisaldusega HK-2 rakke. Molekulaarseid mehhanisme uuriti RT-PCR ja Western blot abil.Akteosiidtakistab kõrge glükoosisisaldusega indutseeritud HK-2 rakke ja diabeedi db/db hiiri, pärssides NADPH/oksüdaas-TGF-/Smad signaalirada.Akteosiidreguleeris lipiidide metabolismi, glüoksülaadi ja dikarboksülaadi metabolismi ning arahhidoonhappe metabolismi häiritud metaboolset rada. Avastasime selle loodusliku tooteakteosiidavaldab olulist mõjuneerude kaitse.See uuring sillutas teed patogeneesi edasiseks uurimiseks, varajaseks diagnoosimiseks ja uue raviaine väljatöötamiseks DKD jaoks.
MÄRKSÕNAD akteosiid, diabeetikneeruhaigus, metaboolne profileerimine, NADPH/oksüdaas-TGF-/Smad signaalirada, ROS
I osa
1|SISSEJUHATUS
Akteosiidon fenüületanoidglükosiidide tüüpiline komponent, mis on laialt levinud 79 taimeperekonnas, nagu Rehmannia glutinosa,Cistanche deserticolaja muud ravimtaimed.Akteosiidiseloomustab kofeiinhape ja hüdroksütürosool, mis on seotud glükoosiosaga vastavalt estri- ja glükosiidsidemete kaudu, kusjuures ramnoosiüksus on seotud glükoosimolekuliga (Zhao et al., 2015). Teatatakse, etakteosiidomab laialdaselt farmakoloogilist toimet, naguneerudkaitse (Gan et al., 2018), antioksüdatsioon (He et al., 2011), neuroprotektsioon (Li, Zhou, Xu, Song ja Lu, 2018), maksa kaitse (Lee et al., 2004), vähivastane (Ohno) , Inoue, Ogihara ja Saracoglu, 2002) ja nii edasi. Kuid kaitsev toimeakteosiiddiabeedi korralneerukahjustuson ebaselged.
Diabeet on 21. sajandi üks kiiremini kasvavaid ülemaailmseid tervisehädasid. 2019. aastal põeb diabeeti hinnanguliselt 463 miljonit inimest ja prognooside kohaselt jõuab see arv 2030. aastaks 578 miljonini ja 2045. aastaks 700 miljonini. Diabeedi levimus maailmas kasvab kiiresti, eriti arengumaades, ja diabeetikute levimus.neeruhaigus(DKD) ja lõppstaadiumisneeruhaigus(ESRD) jätkab tõusu (Hu, 2011). DKD on üks kardetumaid diabeedi kroonilisi mikrovaskulaarseid tüsistusi ja ESRD peamine põhjus. Kõigist põhjustest tingitud suremus DKD-ga inimestel on ligikaudu 30 korda kõrgem kui nefropaatiata diabeetikutel. Hiljutised uuringud näitavad, etneeru-tubulaarne epiteeli-mesenhümaalne üleminek (EMT) ja ekstratsütoplasmaatiline maatriksi (ECM) akumulatsioonneeru-interstitium mängib DKD patogeneesis võtmetegureid (He et al., 2015; Yao et al., 2014). Üha rohkem uuringuid on teatanud, et progresseerumineneeru-Diabeetilise nefropaatia fibroosi vahendasid paljud signaalirajad. TGF-i on seostatud peamise patogeense tegurina enamikus fibroosiga seotud kroonilise neeruhaiguse tüüpides, sealhulgas DKD-s (Lv & Zhang, 2019). Heteromeerne signaalikompleks, mis tuleneb TGF- 1 seondumisest II tüüpi retseptoriga ja omakorda I tüüpi retseptoriga, edastab signaale retseptori poolt reguleeritud Smadide (Smad2/3) ja ühise partneri Smadi (Smad4) kaudu, mis viib sihtgeenide transkriptsiooniline regulatsioon (Sierra et al., 2015). ROS-i akumuleerumine võib põhjustada rakus oksüdatiivseid pingeid, mis põhjustab rakukomponentide, sealhulgas valgu ja DNA kahjustusi. Lõppkokkuvõttes põhjustab oksüdatiivne stressneeru-fibroos ja selle langusneerufunktsioon. NADPH oksüdaase (NOX) peetakse diabeetilise nefropaatia ja kroonilise ROS-i tekke peamiseks allikaks.neeruhaigus. NOX-i ülesreguleerimine ja hüperaktiveerimine aitavad tõenäoliselt kaasa oksüdatiivsele stressile patofüsioloogilistes etappides. Kõrgusneeru-ROS-i tase hüperglükeemia poolt vahendatud NOX-i aktiveerimise kaudu põhjustab oksüdatiivset stressi, mis põhjustab kahjustusineerukuded, mis põhjustab DKD-d (Lee, An, Kim ja Bae, 2020).
Metaboloomika on uus ja oluline oomikatehnoloogia kõigi elusrakkudes, kudedes ja kehavedelikes leiduvate väikeste molekulaarsete metaboliitide kvalitatiivseks ja kvantitatiivseks analüüsiks. Uue distsipliinina elusorganismide üldiste metaboolsete muutuste tuvastamiseks pakub metaboomika uusi teadmisi diabeedi ja diabeedi tüsistuste uurimisest (Lu, Xie, Jia ja Jia, 2013).
Selle uuringu eesmärk oli uurida loodusliku toote kaitsvat toimetakteosiiddiabeetiliste isaste db/db hiirte DKD ja kõrge glükoosisisaldusega in vitro indutseeritud HK-2 rakkude ja selle mehhanismi kohta. Seega kasutati selles uuringus db/db hiiri, et hinnataneeru-kaitsev toimeakteosiid, ja analüüsiti erinevate metaboliitide regulatsiooni seerumis, et valgustada selle mehhanismeakteosiid. Lisaks hindab kõrge glükoosisisaldusega indutseeritud HK-2 in vitro mudel ravimi efektiivsust.akteosiiddb/db hiirtel NADPH/oksüdaas-TGF-/Smad signaaliraja ekspressioonitasemete määramise teel.
2|MATERJALID JA MEETODID
2.1|Kemikaalid ja instrumendid
UPLC-klassi atsetonitriil osteti firmalt Merck (Darmstadt, Saksamaa); sipelghape osteti firmalt Sigma-Aldrich (Sigma, St. Louis, Missouri).Akteosiid(Puhtus on suurem kui 98 protsenti või sellega võrdne) osteti riiklikust toidu- ja ravimikontrolli instituutist (Peking, Hiina). Struktuurakteosiidon näidatud joonisel 1A. Seerumi uurea lämmastiku (BUN) reaktiivikomplekt, aspartaataminotransferaasi (GOT) reaktiivikomplekt, alaniinaminotransferaasi (GPT) reaktiivikomplekt, üldkolesterooli (TCHO) reaktiivikomplekt, triglütseriidide (TG) reaktiivikomplekt, seerumi kreatiniini (Scr) reaktiivikomplekt, uriini mikroalbumiin (mALB) reaktiivikomplekt ja insuliini (INS) reaktiivikomplekt osteti Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute'ist (Nanjing, Hiina). Metformiinvesinikkloriidi tabletid osteti firmalt Sino American Shanghai Squib Pharmaceutical Ltd; Irbesartaan osteti ettevõttelt Shenzhen Haibin Pharmaceutical Co., Ltd. DMEM ja F12 osteti ettevõttest GIBCO, Ameerika; NOX1 (katalooginumber: ab121009), NOX2 (katalooginumber: ab129068), NOX4 (katalooginumber: ab154244) ja Smad7 (katalooginumber: ab216428) esimene antikeha osteti ettevõttelt Abcam (Cambridge, Ühendkuningriik). -SMA (katalooginumber: 19245), E-kadheriin (katalooginumber: 3195), NF-κB p65 (katalooginumber: 8242), TGF- 1 (katalooginumber: 3711), Smad2 (katalooginumber: 5339) , Smad3 (katalooginumber: 9523), Smad4 (katalooginumber: 46535) ja PSmad2/3 (katalooginumber: 8828) esimene antikeha osteti ettevõttelt CST. Kõik muud selles uuringus kasutatud kemikaalid ja reaktiivid olid analüütilise kvaliteediga ja valmistatud Hiinas.
Waters Acquity™ Ultra Performance LC-süsteem (Waters), mis on varustatud spektromeetriga Quattro Micro MS ja Waters Xevo TM G2 QTof MS (Waters MS Technologies, Manchester, New Hampshire). Deioniseeritud vesi puhastati Milli-Q süsteemis (Millipore, Bedford, Massachusetts). Andmete analüüsimiseks võeti kasutusele Mass Lynx v4.1 tööjaam ning kasutati ülikiiret madalal temperatuuril tsentrifuugi (Thermo Scientific, Ühendkuningriik) ja DMI3000M mikroskoopi (Leica, Saksamaa).
2.2|Loomkatse tingimused
Kõik selles uuringus kasutatud eksperimentaalsed protseduurid ja protokollid vaatas läbi ja kiitis heaks Nanjingi Hiina Meditsiini Ülikooli (Nanjing, Hiina) institutsionaalse loomaeetika komitee. Käesolevas uuringus kirjeldatud protokollid olid kooskõlas laboriloomade hooldamise ja kasutamise institutsionaalsete juhistega. Hiired osteti Nanjingi ülikooli loomamudelite uurimiskeskusest (sertifikaadi nr Su 2015–0001). Kõik katsed viidi läbi 8-nädala vanuste isaste db/db hiirtega ja metsiktüüpi db/m pesakonnakaaslaste vanusega hiirtega, kelle esialgne kehakaal oli 30 40 g. db/db diabeetilise hiire mudel on rahvusvaheliselt tunnustatud diabeedi loommudel. Uuringud on näidanud, et DKD mehhanism db/db hiirtel on sarnane inimese omaga. Loomi hoiti konstantse niiskuse (ca 60% ± 2%) ja temperatuuriga (ca 23 ± 2 kraadi) puurides ning valguse/pimeduse tsükliga 12 tundi. Loomadel oli 3-nädalane kohanemisperiood, mille jooksul neil oli piiramatu juurdepääs toidule ja kraaniveele. Pärast kohanemisperioodi jagati db/db hiired juhuslikult nelja rühma, igas rühmas kuus: mudelrühm (tavaline soolalahus, M), metformiini rühm (250 mg kg-1 d-1, EJSG), irbesartaani rühm (50 mg kg-1 d-1, EBST),akteosiidrühm (70 mg kg-1 d-1, MRHTG), üks kord päevas (Gao, Peng, Huo, Liu ja Yan, 2015). Lisaks valiti selles uuringus positiivseks kontrolliks metformiin ja irbesartaan. On teatatud, et irbesartaan võib vähendada vererõhku, vere lipiide janeeru lipiid.See ei mõjuta vere glükoosisisaldust ega maksa lipiide. See võib parandada funktsiooni ja patoloogilisi muutusineeruddb/db hiirtest. Metformiini kaitsev toimeneerudkajastub proteinuuria vähenemises diabeetilistel rottidel ja II tüüpi diabeediga patsientidel. Loomade metformiini ja irbesartaani annus ekstrapoleeriti inimese ööpäevasest annusest, kasutades kehapinna normaliseerimise meetodit. Seejärel manustati hiirtele vastavat ravimit üks kord päevas maoloputus teel 6 nädala jooksul ja kontrollrühmana kasutati db/m hiiri, kellele manustati samal ajal sama kogus soolalahust.
2,3|Proovide kogumine
Katseperioodil registreeriti kehakaalud ja tühja kõhuga veresuhkru (FBG) taset iga nädal, FBG taset mõõdeti One Touch Ultra II veresuhkru jälgimissüsteemiga (Life Scan, Milpitas, California) igal esmaspäeval (kell 8 hommikul) sabaveenide kaudu. ). Pärast 6-nädalast manustamist paastus hiired metaboolsetes puurides, kus oli vaba juurdepääs veele, et koguda 24-tunnist uriini. Kõik uriiniproovid tsentrifuugiti kohe pärast kogumist kiirusel 3000 p/min 10 minutit ning supernatandid eraldati ja säilitati kuni analüüsimiseni temperatuuril -80. Uuringu lõpus surmati hiired anesteesia all 10-protsendilise kloraalhüdraadiga (3 mg/kg) ning biokeemiliste parameetrite kontsentratsiooni ja metaboomika uuringu jaoks koguti verd. Seejärel tsentrifuugiti vereproove kiirusel 3000 p/min 10 minutit ning seerumiproovid eraldati ja säilitati analüüsini -80 kraadi juures. Parem neer eemaldati histoloogiliseks uurimiseks ühe tükiga, mis oli fikseeritud 10% neutraalse puhverdatud formaliiniga. Theneeru-ajukoor eraldati teisest tükist ja külmutati vedelas lämmastikus Western blot analüüsiks.
Cistanche neerupuudulikkuse raviks
2.4|Rakukultuur ja ravi
Inimese RTEC liin HK{{0}} saadi ettevõttelt Nanjing Keygen Biotechnology Development Co., Ltd. Täielik sööde oli madala glükoosisisaldusega DMEM, mis sisaldas 10 protsenti FBS-i ja 1 protsenti penitsilliini-streptomütsiini lahust. HK-2 rakke kultiveeriti 37 kraadi juures, 5% CO2 ja küllastunud niiskuse juures. Rakke subkultuuriti 80-protsendilise konfluentsusega, mis eemaldati inkubaatorist ja algne sööde tassis visati ära. Rakke loputati 0,5 ml fosfaatpuhversoolalahusega (PBS) ja digereeriti 0,5 ml trüpsiiniga töötlemisel 1–2 minutit temperatuuril 37 °C. Seedimine lõpetati 2 ml DMEM söötmega ja seejärel tsentrifuugiti rakususpensiooni 450 g juures 5 minutit 4 °C juures. Supernatant visati ära ja rakud resuspendeeriti 2 ml vastavas DMEM söötmes, et saada üherakuline suspensioon. Rakud külvati erinevatele tassidele/mikroplaatidele erineva tihedusega järgnevaks katsetamiseks, nagu allpool kirjeldatud. HK-2 rakud kanti 96-süvendiga plaatidele ja taldrikutele, töödeldi eelnevalt madala glükoosisisaldusega (5 mmol/L) DMEM-iga, inkubeeriti 37 °C ja 5% CO2 juures.26 tundi ja seejärel sünkrooniti. Katserühmad jagunesid järgmiselt: kontrollrühm (C), ilma sekkumistegurita; mudelrühm (M), milles rakke kultiveeriti kõrge glükoosisisaldusega (30 mmol/L) DMEM lahuses; osmootse rõhu kontrollrühm (DMEM pluss 24,5 mmol/l mannitool, GLC); irbesartaani rühm (25 mmol/L) jaakteosiid(MRHTG) rühma viie annusega (vastavalt 5, 10, 25, 50 ja 100 μmol/L).
2,5|Raku morfoloogia
HK-2 rakke pesti kaks korda PBS-ga ja vaadeldi pöördmikroskoobi all (OLYMPUS IX51). Rakkude morfoloogiat täheldati 100 suurendusega.
2,6|Biokeemiliste näitajate mõõtmine
Terapeutiline efektiivsusakteosiiddb/db hiirtel hinnati mALB taset uriinis ja FBG, INS, T-CHO, TG, Scr, GOT, GPT ja BUN taset seerumis, mis tuvastati, millele järgnes komplekti tootja esitatud kirjeldus.
2,7|Patoloogiline analüüs
Osaneeru-ajukoores tehti hematoksüliin-eosiini (HE) ja perioodilise happe-Schiffi (PAS) värvimine, et jälgida patoloogilisi muutusineerukude, fibrooskoe hüperplaasia astmed, glomerulite ja tuubulite struktuurid läbi elektronmikroskoobi (400). Püüdke pildistades täita kogu vaatevälineerukudetagamaks, et iga foto taustavalgus on sama. Sama punakaslilla värvi valimiseks kasutati tarkvara Image-Pro Plus 6.{2}} kõigi fotode positiivse hindamise ühtseks kriteeriumiks. Basaalmembraani positiivse ekspressiooni akumuleeritud optiline tihedus (IOD) ja glomerulaarse vaskulaarse põimiku (AREA) pikslipind saadi iga foto analüüsimisel ja arvutati keskmine optiline tihedus (IOD / AREA).
2,8|Western blotting
Neerukudeja rakud ekstraheeriti lüüsipuhvriga; lüsaadid tsentrifuugiti. Pärast täielikku pürolüüsi tsentrifuugige 5 minutit kiirusel 12000 p / min ja võtke supernatant ja supernatandid koguti. Valgu kontsentratsiooni määramiseks kasutati bitsinhoniinhappe (BCA) valgu kontsentratsioonikomplekti. Pärast kvantifitseerimist eraldati valk 10% SDS-PAGE-ga, kanti üle PVDF membraanidele, seejärel blokeeriti 5% BSA-s TBST-s ja inkubeeriti primaarsete antikehadega, millele järgnesid vastavad sekundaarsed antikehad. Seejärel tuvastati antikeha reaktsioonivõime ECL-ga ja kvantifitseeriti ImageJ tarkvaraga.Neerukudedproove analüüsiti Western blot meetodil -SMA, TGF- 1 (1:1300), Smad2 (1:3000), Smad3 (1:1000), P-Smad2/3 (1:500) ekspressioonitasemete tuvastamiseks. ), Smad4 (1:1000) ja Smad7 (1:1000) valku.
2,9|ELISA analüüs
Monotsüütide kemoatraktandi valgu -1 (MCP-1), interleukiin-1 (IL-1), tuumori nekroosifaktori (TNF-) ja interleukiini-6 (IL) sekretsioon -6) iga raku supernatandis mõõdeti ELISA komplektiga.
2.10|Reaalajas PCR
Lisaks valmistati need rakud ette reaalajas PCR-i jaoks, et uurida NOX1, NOX2, NOX4, -SMA, E-kadheriini, NF-κB p65, TGF- 1, Smad2, Smad3, Smad4 ja Smad7 mRNA. Igas rühmas koguti rakud (umbes 1 107 rakku). Kogu RNA ekstraheeriti Trizoli üheetapilise meetodiga ning määrati selle puhtus ja kontsentratsioon. Kui sisemine võrdlus oli GAPDH, oli praimeri järjestus järgmine. TGF- 1, sensspraimer: 5-ACACATCAGAGCTCCGAGAA-3, antisenss-praimer: 5-GAGGTATC GCCAGGAATTGT-3;E-kadheriin, sensspraimer: 5- ACGCATTGCCA CATACACTC-3, antisenss-praimer: 5-GGTGAATTCGGGCTTGTTGT-3; NF-κB p65, senss-praimer: 5-CTTCCTGCCCTACAGAGGTC-3, antisenss-praimer: 5-AGAGCAAGGAAGTCCCAGAC-3;NOX1, sensspraimer: 5-CCTAGAAGGGCTCCAAACCA{{33} }, antisenss-praimer: 5-GGAAGGCATCCACAAACAGG-3; NOX2, senss-praimer: 5-ACCCTTCGCATCCATTCTCA-3, antisenss-praimer: 5-TCTGCAAACCACTCAAAGGC-3; NOX4, sensspraimer: 5-CAAGCAGGAGAACCAGGAGA-3, antisenss-praimer: 5-AGTTGAGGGCATTCACCAGA-3; Smad2, senss-praimer: 5-TGAGCACGTGAGGTGAGATT-3, antisenss-praimer: 5-CTCCATCACAGTGCACCAAG-3; Smad3, senss-praimer: 5-CAGCCGGTTTGGATTACAGG-3, antisenss-praimer: 5-GAGTCAAAGTCCCTGCTCCT-3; Smad4, senss-praimer: 5-CACTGCCAACTTTCCCAACA-3, antisenss-praimer: 5-ATCCATTCTGCTGCTGTCCT-3; Smad7, senss-praimer: 5-AAGAGTCAGCTGGTGCAGAA-3, antisenss-praimer: 5-GCGGACTTGATGAAGATGGG-3; -SMA, sensspraimer: 5-GGTGCTGTCTCTCTATGCCT-3, antisenss-praimer: 5-CAGATCCAGACGCATGATGG-3; GAPDH, senss-praimer: 5-TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3, antisenss-praimer: 5-CCAGTAGAGGCAGGGATGAT-3.
2.11|Statistiline analüüs
Andmed ja statistiline analüüs vastavad farmakoloogia eksperimentaalse kavandamise ja analüüsi soovitustele. Kõik katsed randomiseeriti ja pimestati. Tulemused on väljendatud sõltumatute katsete näidatud arvu (n) väärtusena M ± SD/SEM. Käesoleva uuringu andmed on esitatud kui M ± SD / SEM vähemalt kolmest sõltumatust katsest. Erinevuste olulisust analüüsiti ühesuunalise ANOVA abil, millele järgnes Tukey test (rohkem kui kaks rühma) või Studenti t-test (kaks rühma). Post hoc testid tehakse ainult siis, kui F saavutas p <.05 ja="" olulist="" dispersiooni="" ebahomogeensust="" ei="" esinenud.="" kõik="" testid="" olid="" kahepoolsed="" ja="" statistiliselt="" oluliseks="" peeti="" p="">< 0,05.="" statistiline="" analüüs="" viidi="" läbi="" graphpad="" prism="" 7.0="" tarkvara="">
Cistanche akteosiid neerude parandamiseks
2.12|UPLC-QTOF/MS tingimused ja andmete analüüs
Kõik seerumiproovid sulatati enne valmistamist toatemperatuuril. 300 ul atsetonitriili lisati 100 ul seerumiproovidele sadestunud valgule ja segati intensiivselt 60 sekundit. Kõiki proove tsentrifuugiti kiirusel 13000 p/min 10 minutit 4 kraadi juures. Lõpuks süstiti supernatant UPLC-QTOF/MS analüüsi. Metaboliitide eraldamine viidi läbi, kasutades Waters Acquity™ Ultra Performance LC süsteemi (Waters), mis oli varustatud Waters Xevo™ G2 Q/TOF-MS (Waters MS Technologies). 2 ul proovilahuse alikvoot süstiti Acquity UPLC BEH C18 (100 mm 2,1 mm, 1,7 μm, Waters Corporation, Milford, Connecticut) 35 kraadi juures ja voolukiirus oli 0,4 ml/min. Optimaalne liikuv faas koosnes veest (A) (sisaldas 0,1 protsenti sipelghapet) ja atsetonitriilist (B). Seerumi analüüsi optimeeritud UPLC elueerimistingimused olid 0 3 min, 95 protsenti 55 protsenti A; 4 13 min, 55 protsenti 5 protsenti A; 13 14 min, 5 protsenti A. Autosampler hoiti 4 kraadi juures.
Massispektromeetria viidi läbi, kasutades Xevo™ G2 QTof (Waters MS Technologies), kvadrupooli ja ortogonaalse kiirenduse lennuaja tandemmassitromeetrit. Leutsiini-enkefaliini kasutati luku massina, mis tekitas [M pluss H]plussioon (m/z 556,2771) ja [MH]-ioon (m/z 554,2615) vastavalt positiivses ja negatiivses režiimis. Leutsiin-enkefaliini kontsentratsioon oli 200 pg/ml ja infusiooni voolukiirus 100 ul/min, et tagada süstalpumba abil MS analüüsi täpsus. Andmeid koguti tsentroidirežiimis vahemikus 100 kuni 1,000 m/z. Nii positiivse kui ka negatiivse elektropihustusrežiimi puhul määrati kapillaar- ja koonuspinge vastavalt 3,0 kV ja 30 V. Desolvatatsioonigaas määrati 600 l/h temperatuuril 350 kraadi, koonusgaas määrati 50 l/h ja lähtetemperatuur 120 kraadi. Andmehõive kiiruseks määrati 30 ms ja skaneerimise vahelise viivitusega 0,02 s.
Lisaks valiti igast rühmast juhuslikult 10 seerumiproovi ja segati vastavalt kvaliteedikontrolli (QC) proovideks. QC proovi kasutati UPLCQTOF / MS seisundi optimeerimiseks, kuna see sisaldas enamikku teavet kogu proovi kohta. QC proove süstiti töö alguses kuus korda süsteemi konditsioneerimiseks või tasakaalustamiseks ja seejärel iga 10 proovi järel analüüsi stabiilsuse edasiseks jälgimiseks. Iga päev, pärast instrumendi kalibreerimist, analüüsiti esmalt QC proovi, et testida seadme stabiilsust, et tagada süsteemi ühtlane toimimine.
Kõiki andmete kogumist ja andmete analüüse kontrollis Waters MassLynx v4.1 tarkvara. Mitme muutujaga andmemaatriksit analüüsis tarkvara EZinfo 2.0 (Waters Corp.). Peamised parameetrid hõlmavad säilitusaja vahemikku 0 14 min; massisuhe m/z 100 1,000, massi tolerantsi vahemik 0.{{10}}1 Da, piigi intensiivsuse lävi 50, kvaliteediaken 0,05 Da, peetus ajaaknad 0,20 min ning 5 protsendi tipu kõrguse ja müra automaatne tuvastamine. Iga iooni intensiivsus normaliseeriti ioonide koguarvu suhtes, et luua andmemaatriks, mis koosnes retentsiooniajast, m/z väärtusest ja normaliseeritud piigi pindalast.
Saadud andmemaatriksid sisestati EZinfo 2.{1}} tarkvarasse põhikomponentide analüüsi, osalise vähimruutude diskriminantanalüüsi (PLS-DA) ja varjatud struktuuride ortogonaalprojektsiooni (OPLS-DA) analüüsi jaoks. OPLS-DA põhjal võis tuvastada erinevaid metaboliite, mis vastutavad kontrollrühma ja mudelrühma vahelise eraldamise eest ning seetõttu vaadeldi neid potentsiaalsete markeritena. Potentsiaalsed huvipakkuvad markerid ekstraheeriti S-diagrammidelt, mis konstrueeriti pärast analüüsi OPLS-DA-ga, ja muutujad, mis aitasid oluliselt kaasa rühmade diskrimineerimisele, viidi läbi molekulaarse valemi edasisel tuvastamisel.
Muutuja tähtsus (VIP) projektsiooniväärtuses on PLS-i kaalude kaalutud ruutude summa ja muutujaid, mille VIP > 1, peeti mõjutavateks proovide eraldamisel OPLS-DA analüüsi tulemusel loodud skoorigraafikutel. Kõigis katsetes määrati erinevuse olulisuse määramiseks usaldusnivoo 95 protsenti (p <.{10}}5). need="" muutujad="" valiti="" lõpuks="" potentsiaalseteks="" biomarkeriteks.="" pls-da="" skoori="" graafikuid="" kirjeldati="" ristvalideerimise="" parameetritega="" r2y="" ja="" q2,="" mis="" esindavad="" vastavalt="" x-maatriksi="" selgitatud="" variatsiooni="" ja="" mudeli="" prognoositavust.="" suurepärased="" mudelid="" saadakse="" siis,="" kui="" r2y="" ja="" q2="" kumulatiivsed="" väärtused="" on="" üle="" 0,8.="" manustamisrühmade="" ja="" kontrollrühma="" suhtelised="" kaugused="" pls-da="" skoori="" graafikust="" arvutati="" kontrollrühma="" kõigi="" proovide="" keskmise="" väärtuse="" (x-telg="" ja="" y-telg)="">
Valitud potentsiaalsed metaboliidid tuvastati vastavalt täpse m / z, retentsiooniaja ja tüüpilise MS / MS fragmendi ja ülaltoodud potentsiaalsete biomarkerite mustri määramisele, mis saadi positiivsete ja negatiivsete ioonide režiimides. Metaboolse raja konstrueerimine viidi läbi Metabo Analystiga, mis on veebipõhine metaboomika visualiseerimise tööriist (https://www.metaboanalyst.ca/), mis põhineb andmebaasiallikatel, sealhulgas KEGG-l (HTTP://www.genome). .jp/kegg/) ja HMDB (http://www.hmdb. ca/) andmebaasid otsimiseks. Retentsiooniaeg ning tüüpiline MS/MS fragment ja muster aitasid kitsendada võimalike molekulide valikut.
Cistanche'is sisalduv akteosiid võib parandada neerufunktsiooni
3|TULEMUSED
Selle artikli II osa (tulemuste) kohta teabe saamiseks klõpsake siin.
Väljavõte: " Looduslik toodeakteosiidparandamaneerukahjustusdiabeedi db/db hiirtel ja HK-2 rakkudel NADPH/oksüdaas-TGF-/Smad signaaliraja reguleerimise kaudu' -----Qinwen Wang|Xinxin Dai jt
----Fütoteraapia uuringud. 2021;35:5227–5240. wileyonlinelibrary.com/journal/ptr © 2021 John Wiley & Sons Ltd. DOI: 10.1002/ptr.7196
