Cistanche'ist saadud akteosiid parandab glükokortikoidide põhjustatud osteoporoosi, aktiveerides PI3K/AKT/mTOR raja

Abstraktne

Eesmärk

Kliinilises praktikas kasutatakse laialdaselt glükokortikoide; samas võivad need põhjustada kõrvalmõjusid, ntosteoporoos. Akteosiid(ACT) Cistanche'ist on kasutatud mitmesuguste haiguste vastu võitlemiseks. Uuring viidi läbi selleks, et hinnata ACT efektiivsust glükokortikoidide indutseeritud ravisosteoporoos(GIOP) ja selle potentsiaalne mehhanism.

meetodid
Indutseerimiseks süstiti intramuskulaarselt deksametasooni (Dex).osteoporoosrotimudelis ja ACT manustati suuliselt. ACT-d täiendati in vivo Dex-stimuleeritudosteoblastilineMC3T3-E1 lahtrid. mRNA taseme hindamiseks viidi läbi RT-qPCRluu moodustumine(Runx2, CoL1A1) ja luu resorptsioon (OPG ja RANKL). Seerumi OC ja CTX taseme hindamiseks kasutati kaubanduslikku ELISA komplekti. Valkude taseme hindamiseks PI3K / AKT / mTOR signaalirajas viidi läbi Western blot. Osteoblastide elujõulisuse ja apoptoosi hindamiseks viidi läbi CCK-8 test ja voolutsütomeetria.

Klõpsake siin, et hankida Cistanche Acteoside For Treat Dex-stimuleeritud osteoblastilist

Tulemused
ACT vähendas Dex-indutseeritud luu mikrostruktuuri halvenemist, suurendas seerumi OC taset ja alandas CTX taset (P< 0.05). In the MC3T3-E1 cells, Dex inhibited cell viability and soodustas apoptoosi; seda efekti aga nõrgendas oluliselt ACT (P< 0.05). Concurrently, ACT reversed the reduction in Runx2, osterix, CoL1A1, and OPG mRNA levels, ALP activity, and the promotion of RANKL by Dex. Additionally, ACT attenuated Dex-induced inhibition of p-AKT/AKT, p-mTOR/mTOR, and p-PI3K/PI3K protein levels by Dex (P < 0.05), while the PI3K/AKT/mTOR pathway inhibitor LY294002 diminished the potential effect of ACT (P < 0.05).

Järeldus
ACT alatesCistanchevõib avaldada osteoprotektiivset toimet, aktiveerides PI3K / AKT / mTOR signaaliraja, et leevendada Dexi põhjustatud osteoporoosi.

Märksõnad:Akteosiid Cistancheglükokortikoididest põhjustatudosteoporoos

Sissejuhatus
Osteoporoos (OP) on üldine skeletihaigus, mida iseloomustab madal luumass, luukoe mikrostruktuuri hävimine ja luu homöostaasi tasakaalustamatus [1]. OP põhjustab üle 8,9 miljoni luumurru aastas ja osteoporoosilisi luumurde esineb peaaegu iga 3 sekundi järel ning see põhjustab eluaegse puude või surma [2]. Glükokortikoide (GC) manustatakse tavaliselt mittenakkuslike põletikuliste haiguste (nagu astma ja põletikuline soolehaigus) ja autoimmuunhaiguste raviks [3]. Pikaajaline GC kasutamine soodustab aga enam kui 30 protsendil OP juhtudest ja enam kui 10 protsendil osteonekroosi juhtudest [4]. GC-d inhibeerivad otseselt osteoblastide proliferatsiooni ja diferentseerumist [5], vähendavad küpsemist ja aktiivsust ning indutseerivad osteoblastide apoptoosi, mis omakorda põhjustab glükokortikoididest põhjustatud osteoporoosi (GIOP) väljakujunemist [6]. Veelgi enam, üha rohkem tõendeid viitab sellele, et osteoblastide düsfunktsioon on luuhõrenemise peamine põhjus. Seetõttu näib osteoblastide arvu ja funktsiooni suurenemine olevat OP, eriti GIOP-i ennetamise peamine strateegia.

Taimseid, eriti looduslikel ühenditel põhinevaid ravimeid on erinevate haiguste raviks kasutatud tuhandeid aastaid [7]. Cistanche on Hiina farmakopöas registreeritud hinnaline ravimtaim, mis kasvab Xinjiangi Uiguuri autonoomse piirkonna lõunaosas ja mida tuntakse kõrbe ženšenna [8]. Cistanche'il on tõestatud mitmesuguseid toimeid, nagu immuunsüsteemi tugevdamine, neerude kaitse, vananemisvastane, antioksüdantne, põletikuvastane ja neuroprotektiivne toime [9].Akteosiid(ACT) on Cistanche fenüületanoolglükosiid, millel on bioloogiline toime, nagu neuronaalse apoptoosi pärssimine [10], maksakahjustuste leevendamine [11], põletikuvastane [12], antioksüdatsioon [13]. , diabeedi [14] ja rasvumise [15] ennetamine, samuti liigesekõhre degeneratsioon [16]. Lisaks on mitmed uuringud teatanud ACT farmakokineetikast ja kinnitanud, et terapeutiline toime on olemas isegi siis, kui suukaudne kasutamine on ainult 0,12 protsenti. ACT-d peetakse in vivo aktiivsete metaboliitidega eelravimiks [17].

Zhang et al. näitasid ACT potentsiaalset kaitsvat toimet ovariektoomiast põhjustatud luuhõrenemisele rottidel [18]. ACT moduleerib IGF-1/PI3K/mTOR signaalirada, et vältida diabeetiliste rottide luuhõrenemist [19]. On teatatud, et PI3K/AKT/mTOR rajal on kriitiline reguleeriv roll mitmesuguste haiguste, sealhulgas GIOP puhul [20]. Naringin leevendab GIOP-i, reguleerides PI3K/AKT/mTOR signaalirada [21]. Lisaks reguleerib see signaalirada osteoblastide diferentseerumist [22], luu moodustumist [23] ja luumurdude paranemist [24]. Siiski pole teada ACT potentsiaalne roll GIOP-is ja see, kas seda reguleerib PI3K / AKT / mTOR signaaliraja modulatsioon.

Käesoleva uuringu eesmärk oli mõista ACT kaitsvat toimet GIOP roti mudelis ja osteoblastides in vitro ning selgitada nende aluseks olevaid molekulaarseid mehhanisme.

materjalid ja meetodid
Katseloomad
Nelikümmend 8-nädalast isast Sprague-Dawley (SD) rotti kaaluga 280–340 g saadi Shanghai Laboratory Animal Centerist (CAS, Shanghai, Hiina). Katseloomade hooldusprotseduurid viidi läbi Qiqihari meditsiiniülikooli loomade eetikakomitee kolmanda sidushaigla poolt heaks kiidetud protokolli järgi. Ja uuring viidi läbi kooskõlas ARRIVE juhistega. Loomi hoiti patogeenidest vabades loomakeskustes, 24 ± 2 kraadi, 12 h valguse ja pimeduse tsüklit, 50 ± 5 protsenti niiskust ning vaba juurdepääsu toidule ja veele.

GIOP mudeli ehitus
Pärast 7-päevast adaptiivset toitmist jagati rotid juhuslikult kontroll- ja mudelrühmadesse, kasutades juhuslike arvude tabeli meetodit, deksametasooni (Dex, Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA) süstiti 5 mg/kg kaks korda nädalas 6 nädala jooksul. intramuskulaarselt, et kutsuda esile OP mudelrühma rottidel [25]. Kontrollrühma rottidele (n = 10) süstiti võrdne kogus soolalahust. 6 nädala jooksul ei täheldatud mõlema rühma rottidel olulisi kehakaalu muutusi. Seejärel jaotati mudelrühma rotid mudelirühma, ACT väikese annuse rühma (mudel pluss ACT-L) ja ACT suure annuse rühma (mudel pluss ACT-H) rühma. ACT (HPLC 98 protsenti) saadi ettevõttest Baoji Herbest Bio-tech., Ltd. (Baoji, Hiina) ja seda töödeldi lahusti vesisuspensiooniga. Rottidele manustati suukaudselt 50 mg/kg/päevas ja 100 mg/kg/päevas ACT-d väikese ja suure annuse rühmas (8 rotti rühma kohta) ja jätkati 8 nädalat. Nende hulgas arvutati valimi suurus eelmise uuringu põhjal [26]. Arvestades kahepoolset olulisuse taset 0,05 [95-protsendiline usaldusvahemik (= 0.05)], 80-protsendilist võimsust ja efekti suurust 0,5, hindas võimsusanalüüs vajalikuks valimi suuruseks 6 looma rühma kohta, eeldades, et 30-protsendilise osteoporoosi mõju. Lisaks peeti 20-protsendilise väljalangevuse määraga ideaalseks 8 looma rühma kohta (kokku 32 rotti).

Roti seerumi proovid
8 nädala pärast anesteseeriti rotid 10-protsendilise kloraalhüdraadiga (400 mg/kg, intraperitoneaalselt, Solarbio, Peking, Hiina), kõhuaordist koguti veri, hüübiti toatemperatuuril ja tsentrifuugiti kiirusel 3500 p/min 10 minutit. Seerumit hoiti kuni edasise kasutamiseni 1,5 ml tsentrifuugituubides.

Luu mineraalse tiheduse hindamine
Luu mineraalset tihedust (BMD) kasutati DAX väikese looma luu densitomeetriga (Ranzhe Instrument Equipment Co., Shanghai, Hiina). Lühidalt, rotid asetati lamavasse asendisse ja tagajäsemed asetati väljapoole. Rottide paremat reieluu skaneeriti vastavalt tootja juhistele ja registreeriti BMD väärtused [27].

Luu morfoloogiline analüüs
Katse lõpus eutaniseeriti rotid liigse kloraalhüdraadi intraperitoneaalse süstimisega ja reieluud fikseeriti 70-protsendilises etanoolis. Seejärel skaneeriti VivaCT 40 μCT süsteemiga, nagu on kirjeldatud eelmises uuringus ja luu maht/kogumaht (BV/TV), luu trabekulaararv (Tb.N), luu trabekulaarne paksus (Tb.Tn) ja luu trabekulaarne eraldumine. (Tb.Sp) hinnati [28]. Eutanaasia jaoks anesteseeriti SD-rotid pärast luu morfoloogia analüüsi intraperitoneaalse 10-protsendilise kloraalhüdraadi (350 mg/kg) süstimisega.

Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs (ELISA)
Osteokaltsiini (OC, E-EL-R0243c, Elabscience) ja C-terminaalse telopeptiidi (CTX, E-EL-R1405c, Elabscience) taseme tuvastamiseks rottide seerumis kasutati kaubanduslikke ELISA komplekte. Lühidalt, reaktiivid eemaldati 18-25 kraadi juures, et tasakaalustada ja valmistada lahus pesemiseks ja standardseks tööks. Ensüümplaadid Plaadid paigaldati standard-, tühi- ja proovisüvenditega. Süvenditesse lisati umbes 100 µl proovilahjendi lahust, inkubeeriti 90 minutit 37 kraadi juures ja asendati biotinüülitud antikehaga 60 minutit 37 kraadi juures. Pärast pesemist lisati ensüümi siduv töölahus ja inkubeeriti 30 minutit. Lisati substraadi lahus (90 μL) ja inkubeeriti 15 minutit valguse eest kaitstult. Kui standardsetesse süvenditesse ilmus sinine gradient, lisati 50 µl lõpplahust ja analüüsiti OD450 muutust.

Pöördtranskriptsiooni-kvantitatiivne reaalajas PCR (RT-qPCR)
Rottide ja ACT-ga töödeldud MC3T3-E1 rakkude seerumile lisati TRlzol LS reagent ning kogu RNA ekstraheeriti inkubeerimisega toatemperatuuril, millele järgnes kloroformi lisamine. RNA kontsentratsiooni ja puhtust kinnitati A260/280 neeldumise mõõtmisega Nanodrop ND-1000 spektrofotomeetris. RNA pöördtranskriptsiooniks cDNA-ks kasutati SuperScript II pöördtranskriptaasi komplekti. Seejärel rakendati matriitsina cDNA-d, lisati praimer ja SYBR-Green PCR põhisegu komplekt segati ja täiendati ddH2O-ga 20 μL-ni ning PCR amplifikatsioonireaktsioon viidi läbi, kasutades Applied biosystems AMI7500 Fast Real-time PCR. süsteem (ABI, CA, USA). GAPDH-d kasutati normaliseerimise sisemise võrdlusalusena ja suhtelised ekspressioonitasemed arvutati 2-ΔΔCt meetodil ja viidi läbi kolmes eksemplaris. Runtiga seotud transkriptsioonifaktori 2 (Runx2), I 1. tüüpi kollageeni (CoL1A1), tuumafaktori κB ligandi (RANKL), osterixi ja osteoprotegeriini (OPG) retseptori aktivaatori praimerjärjestus on esitatud tabelis 1.

Western blot analüüs
Rakkudele lisati 1% proteaasi inhibiitorit sisaldav RIPA lüsaat ja pärast rakkude lüüsimist koguti igast rühmast kogu valk, loksutades 5 minutit 4 kraadi juures. Valkude kontsentratsiooni kvantifitseerimiseks igas rühmas kasutati BCA analüüsikomplekti. Seejärel segati valguproovid võrdses mahus 10% naatriumdodetsüülsulfaadi (SDS) puhvriga ja keedeti valgu denatureerimiseks 95-kraadises veevannis 5 minutit. Valmistati 12% SDS-polüakrüülamiidi vertikaalne geel ja pärast geeli tahkumist võeti 120 mA 90-minutise geelelektroforeesi eraldamiseks 30 ug valku. Seejärel kanti valk 120 minutiks 90 V juures PVDF membraanile. Pärast 5-protsendilise veise seerumi albumiiniga sulgemist lõigati PVDF membraan markeri ja sihtvalgu riba molekulmassi alusel ning inkubeeriti koos vastava primaarse antikehaga üleöö temperatuuril 4 °C. Küüliku polüklonaalsed antikehad p-AKT, p-mTOR ja p-PI3K vastu lahjendati suhtega 1:1000 (Proteintech, Wuhan, Hiina). TBST pesti 30 minutit ja inkubeeriti vastava mädarõika peroksidaasiga märgistatud sekundaarse antikehaga toatemperatuuril 1 tund. Blot visualiseeriti täiustatud kemoluminestsentsreaktiivide abil. Valguribade tihedus kvantifitseeriti, kasutades Image J. Suhtelise valgutaseme arvutamiseks kasutati kontrollina GAPDH-d.

Rakukultuur ja rühmitamine
Hiire pre-osteoblastid MC3T3-E1 osteti Hiina koekultuuride kollektsioonist (CTCC, Hiina) ja kultiveeriti -MEM-is, mis sisaldas 10 protsenti veise loote seerumit ja 100 U/ml penitsilliini ning 100 mg/ml streptomütsiini. niisutatud inkubaatoris 37 kraadi ja 5 protsenti CO2. Luu diferentseerumise kultiveerimiseks valmistati osteogeenne induktsioonisööde, segades 10 mM- -glütserofosfaati ja 50 mg/ml askorbiinhapet (Sigma-Aldrich) koos -MEM-iga ning lisati MC3T3-E1 rakkudele indutseerimiseks. nende eristamine. Söödet vahetati 3 päeva pärast. Alkalise fosfataasi (ALP) elujõulisuse määramiseks kasutati 14 päeva kultuure. Lisaks töödeldi rakke 30 minutit PI3K inhibiitoriga LY294002 (10 μM), millele järgnes töötlemine Dexi ja ACT-ga.

Rakkude elujõulisuse test
ACT-ga töödeldud osteoblastide elujõulisuse hindamiseks viidi läbi rakuloenduse komplekti-8 (CCK-8) test. MC3T3-E1 rakud inokuleeriti 96 süvendiga plaatidele tihedusega 5 × 103 rakku süvendi kohta. Varasemate uuringute [29] põhjal arvestati 1 μM Dexi kogust ja inkubeeriti koos ACT gradientkontsentratsioonidega (10–8, 10–7, 10–6 ja 10–5 M). Sööde 96-süvendplaatidel asendati pärast segamissöötme ja CCK-8 reaktiivi lisamist vahekorras 10:1. Pärast inkubeerimist 1 h 37 kraadi juures hinnati OD450 muutust.

Osteoblastide apoptoosi arvu tuvastamine
Erinevalt töödeldud MC3T3-E1 rakud seediti EDTA-vaba trüpsiiniga ja koguti tsentrifuugimisega. Pärast pesemist 1 × sidumispuhvriga lisati 5 μL anneksiin V-FITC ja inkubeeriti toatemperatuuril 5 minutit, lisati 5 μL PI-d ja lasti läbi 200- võrgusilma nailonvõrgu. Proove analüüsiti FACScan voolutsütomeetria süsteemiga.

ALP aktiivsuse test
MC3T3-E1 rakud inokuleeriti 24-süvendiplaatidele ning pärast krohvimist lisati ACT ja Dex. Rakukultuuri sööde asendati kultiveerimiseks osteogeense diferentseerumissöötmega. Pärast rakkude lüüsimist rakulüüsilahusega (P0012J, Beyotime Biotechnology) koguti supernatant tsentrifuugimisega ja joonistati standardkõver. ALP aktiivsuse hindamiseks kasutati ALP komplekti (P0132S, Beyotime Biotechnology) ja arvutati OD450.

Statistiline analüüs
Pärast kolme sõltumatu katse sooritamist kolmes korduses analüüsiti andmeid GraphPad Prism 6.0 tarkvara abil ja väljendati keskmisena ± standardhälbe. Mitme rühma statistiliste erinevuste võrdlemiseks kasutati ANOVA-d. P-väärtust < 0,05 peeti statistiliselt erinevaks.