Uudne Cistanche Tubulosa aktiivsete komponentide skriinimise strateegia, mis põhineb spektri-efekti seoste analüüsil ja võrgufarmakoloogial Ⅱ

3. Tulemused ja arutelu

3.1. HPLC sõrmejäljed

3.1.1. Meetodi valideerimine

HPLC meetodi valideerimine näitas, et meetodi täpsuse, reprodutseeritavuse ja stabiilsuse suhteline standardhälve (RSD) oli suhtelise piigi pindala (n = 11) puhul alla 2,85 protsendi ja 0,77 protsendi. suhtelise retentsiooniaja jaoks (n = 11). Sama proovilahuse täpsus jäi vahemikku 0.05–{{10}},77 protsenti suhtelise aja kohta ja 0,28– 2,70 protsenti ühiste piikide suhtelise pindala jaoks. Katse reprodutseeritavus jäi vahemikku 0.03–0,20 protsenti suhtelise aja ja 0,23–2,59 protsenti tavaliste piikide suhtelise pindala puhul. Proovi stabiilsus oli suhtelise retentsiooniaja puhul 0,09–0,24 protsenti ja tavaliste piikide suhtelise pindala puhul 0,75–2,85 protsenti. Need tulemused näitasid, et tuvastatud sõrmejälg oli täidetud. Geniposidhappe lineaarsed seosed,ehhinakosiid, akteosiid, tubulosiid Ajaisoakteosiidon näidatud tabelis S4. Ruudu R väärtus oli 1.0000, mis näitab head lineaarsust. Proovide kogumise tulemused näitasid, et geniposidhappe, ehhinakosiidi,akteosiid, tubulosiid Ajaisoakteosiidolid 100,37 protsenti , 103,59 protsenti , 98,46 protsenti , 100,81 protsenti ja 101,19 protsenti ning proovide taaskasutamise RSD oli alla 2,68 protsendi .

Cistanche'i aktiivkomponentide kohta lisateabe saamiseks klõpsake siin

3.1.2. Peak Area (PA) ja suhteline retentsiooniaeg (RRT)

11 C. tubulosa partii HM-ide, WE-de ja HR-ide võrdlussõrmejäljed ja sõrmejäljed on toodud joonisel 2. Üksteist piiki, millel oli hea eraldumine ja eraldusvõime, tuvastati HM-ide, WE-de ja HR-ide seas ühiste piikidena. Viis standardühendit identifitseeriti kui geniposidhape (A2),ehhinakosiid(A8),akteosiid (A9), tubulosiidA (A10) jaisoakteosiid(A11). Standardne ühend,ehhinakosiid, mis esines kõikidel sobiva piigi pindala ja hea stabiilsusega kromatogrammidel (keskmine retentsiooniaeg 12.86 min), valiti võrdluspiigiks ja seda kasutati ülejäänud kümne suhtelise retentsiooniaja (RRT) arvutamiseks. ühised tipud. Nende erinevate vormide RRT-d on vahemikus 0.16–1.51. Nende tavaliste piikide PA ja dispersioonikoefitsient (CV protsenti) on loetletud tabelites S5–S7. Andmete põhjal on PA erinevate vormide CV-protsendi väärtused vastavalt 25,78 protsenti –142,02 protsenti, 23,36 protsenti –150,38 protsenti ja 28,91 protsenti –112,78 protsenti HM-ide, WE-de ja HR-ide puhul. Need tulemused näitavad olulisi erinevusi igaühe kontsentratsioonisCistanche tubulosaühend erinevate vormide vahel. HM-ide, WE-de ja HR-ide sõrmejäljed on näidatud joonisel 3.

Joonis 2 Standardproovide HPLC sõrmejäljed

3.1.3. HM-ide, WE-de ja HR-ide sisu

Viis standardset koostisosaC. tubulosamõõdeti. Põhikomponentide sisu on näidatud tabelis 1. HM-ide, WE-de ja HR-ide võrdlus on näidatud tabelis 2 ja joonisel 4. C. tubulosa PhG-d on bioloogiliselt aktiivsed, kuid termotundlikud. Vees lahustuvad kuumustundlikud komponendid saab tõhusalt ekstraheerida mõistliku meetodi abil. Tavaliselt ekstraheeritakse Cistanche herba veega ja aurustatakse seejärel kontsentreeritud lahuseks järgmise keemilise analüüsi jaoks [26, 27, 30]. Pärast ekstraheerimist ja kontsentreerimist kasutati pihustuskuivatustehnoloogiat ja protseduuri muudeti eelmisest artiklist. Vedelast aurust eemaldati kiiresti vesi ja seejärel saadi taimede tooraine kuivekstraktid. Selles etapis peetakse maltodekstriini lisamist tavaliseks kandjaks, mis suurendab dispersiooni ja pikendab säilitusaega. Seejärel pressiti taimsed taimed mitme tootmisprotsessi käigus lisanditega valemigraanuliteks. Seda abiainete lisamise etappi katsesse ei kaasatud. Üldiselt hõlmab meie tootmisprotsess ekstraheerimist, kontsentreerimist ja pihustuskuivatamist, nagu on kirjeldatud jaotises 2.2, paralleelselt valemigraanulite tootmisprotsessiga. Nende pooltoodete valmistamiseks tuleb järgida ülaltoodud kolme sammu. WE-de moodustamise protseduur hõlmab kontsentreerimist ja pihustuskuivatamist, mis põhjustavad kergesti termotundlike komponentide kadu, kuid HR-id saadakse pärast HM-ide ekstraheerimist ja kuivatamist. Me ei tea, kas on võimalik, et aktiivsed komponendid jäävad HR-idesse. Meie tulemuste kohaselt vähenes verbaskosiidi sisaldus märkimisväärselt HM-idest WE-dele ja HR-idele (vastavalt). Verbaskosiidi termilist stabiilsust uuritakse piigi pindala muutuste jälgimisega kuumutamisprotsessi ajal HPLC abil. Pärast 4-tunnist kuumutamist jääb verbaskosiidist alles 41,6 protsenti. See näitab, et verbaskosiid on termotundlik [31]. Isoakteosiid, tubulosiid A ja ehhinakosiid WE-des jäid pärast keerulisi töötlemisprotseduure stabiilseks. Pikaajalise kuivatusprotsessi ajal näitas PhG-de kogunemine märkimisväärselt vähenemist, mis võib olla tingitud nende termotundlike komponentide termilisest lagunemisest [32]. Teiste sihtkomponentide osas ei erinenud HR-id ja WE-d oluliselt, välja arvatud verbaskosiid. Meie arusaam sellest erinevusest võimaldab meil tulevikus välja töötada paremad kvaliteedistandardid taimsete jääkide jaoks ja muuta need toodeteks.

Tabel 1 C. tubulosa 11 partii sisu

Tabel 2 Põhikomponentide sisu võrdlus (n = 11).

,

Joonis 4 Viie komponendi sisalduse määramine erinevatest vormidest (n = 11). , ns: ei ole oluline.

3.1.4. Sõrmejälgede sarnasuse analüüs

Hinnati kolme C. tubulosa rühma sarnasusi. Taimse materjali-vee ekstrakti, taimse materjali-ürdi jäägi ja vee ekstrakti-ürdi jääkide sarnasuse väärtused olid vahemikus 0,943–0,994, 0,847–{ {9}}.995 ja 0.938–1.000 vastavalt (tabel 3).

Tabel 3 HM-WE, HM-HR ja WE-HR sarnasused 11 C. tubulosa partii puhul.

3.2. Antioksüdantide aktiivsuse testi tulemused

C. tubulosa erinevate vormide antioksüdantsed aktiivsused määrati DPPH, , ja eemaldamisvõime analüüside abil ning asjakohased tulemused on esitatud joonisel 5. Tabelis S8 olid DPPH ja eemaldamisvõime analüüsi tulemuste vahemikud { {2}}.04–37,80, 0,98–843,90 ja 0,32–27,65 mg/mL kolme erineva vormi puhul 11 ​​C. tubulosa partii hulgas. Kolmes antioksüdandi aktiivsuse testis näitasid HM-id ja WE-d tihedat inhibeerivat aktiivsust, samas kui HR-id näitasid kõige nõrgemat inhibeerimist.

Leiti, et pihustuskuivatatud WE-del on märkimisväärne aktiivsus isegi madalate kontsentratsioonide korral. Eelmine aruanne näitas, et pihustuskuivatatud Vernonia amygdalina WE saavutas 0,17 mg/ml juures 50 protsendilise puhastamise inhibeerimise [33]. Pika ekstraheerimisaja ja kõrgete temperatuuride rakendamine on kahe teraga mõõk. Ühest küljest parandab ekstraheerimisaja ja pihustuskuivatuse sisselasketemperatuuri suurendamine saagist ja efektiivsust. Lisaks saavutavad ekstraktid tugeva antioksüdantse aktiivsuse ja kõrgemad bioloogiliste komponentide kontsentratsioonid kui need taimed [34]. Teisest küljest lagundab liiga kuum sissepuhkeõhk bioaktiivseid ühendeid. Sellised kõrgendatud õhu sisselasketemperatuurid põhjustasid antioksüdandi Bidens pilosa ekstrakti aktiivsuse kadu ja seda seostati fenoolsete ühendite vähenemisega [35]. Praegused tulemused on kooskõlas ülalmainitud aruandega. Näiteks näitas S6 WE nõrgemat radikaali inhibeerivat võimet kui nii HM kui ka HR. Lisaks näitas S5 HR tugevamat DPPH ja superoksiidi anioonide eemaldamise võimet kui HM ja WE. PhG-de struktuur koosneb glükosiidsidemetest ja atsetüülrühmadest, mis ensümaatilisel toimel kergesti hüdrolüüsitakse või lagunevad kõrgel temperatuuril. Need reaktsioonid võivad põhjustada suuremahulise tootmise käigus mõnede põhikomponentide vähenemist. Teatud komponentide hüdrolüüs või isomerisatsioon võib aga kiirendada teiste komponentide sünteesi. Sellised muutused on Cistanchesi ürtide töötlemisel tavalised [36–38]. PhG-de vees lahustuvus tähendab, et enamikku bioloogilisi komponente saab kasutada vee ekstraheerimise teel. Väide, et suurem osa aktiivsetest komponentidest jääb WE-desse, on püsinud aastakümneid, seega tundub mõistlik eeldada, et märjad jääkmaterjalid saab pärast ekstraheerimist ära visata. Siiski on vale pidada C. tubulosa HR-e jäätmeteks. Teadlased märgivad, et PhG-d on ebastabiilsed ja nad on vastuvõtlikud ensümaatilisele või hüdrolüütilisele lagunemisele [39]. Hüdrolüüsi- või isomeerimisreaktsioonid, mis aitavad kaasa bioloogiliste koostisosade vähenemisele fütomeditsiinis töötlemise ajal, võivad samal ajal pakkuda uusi võimalusi HR-de kasutamiseks. Traditsioonilisi ekstraheerimismeetodeid teisendades saab ravimite jääke välja töötada ja tõhusamalt kasutada. Panaxi ženšenni jäägi muutmiseks monosuhkruteks viidi läbi ensümaatiline hüdrolüüs. Suurenes polüsahhariidide ja ginsenosiidide, näiteks suhkru, merevaikhappe, ženšenni polüsahhariidide ja ginsenosiidide saagikus [40]. Sophora flavescensi jäägid ekstraheeritakse ultrahelilainete abil uuesti etüülatsetaadiga [41]. Taimsete jääkide kasutamise uuendatud tehnoloogiad on kokku võtnud Huang et al. [42].

PLSR-i ja BCA tulemuste põhjal sõeluti erinevate vormide viis tippu, kasutades DPPH, superoksiidi aniooni ja hüdroksüülradikaalide eemaldamise teste, et tuvastada kõige olulisemad piigid. Tulemusi illustreerib Venni diagramm (joonis 7). A2, A6, A8 ja A10 on ühised piigid, mida jagavad HM, WE ja HR (joonised 7(a) ja 7(c)) superoksiidi anioonide ja hüdroksüülradikaalide püüdmise testides, samas kui HM, WE ja HR HR ei jaga DPPH testi piike. Samal ajal näitavad BCA mudelid, et A1, A2, A3 ja A6 on ühised piigid, mida jagavad HM, WE ja HR (joonised 7(d)–7(f)). Eelkõige näitavad Venni diagrammi kattumised, et BCA mudel näib sobivam kui PLSR-mudel, millest esimene on rohkem korduv. BCA mudeli koefitsiente ja antioksüdantide võime IC50 väärtusi analüüsiti RDA kaudu. Nagu joonisel 8 näidatud RDA, on HM ja HR A1, A3 ja A6 positiivselt seotud antioksüdantide indeksitega, välja arvatud see, et A3 on negatiivselt seotud hüdroksüülradikaalide eemaldamise võimega. WE-l A1 ja A6 on tugev korrelatsioon DPPH ja superoksiidi aniooniga. Erinevatest vormidest märgitud A6 piigid näitavad tugevaimat seost DPPH, superoksiidi aniooni ja hüdroksüülradikaalidega. A1 ja A3 omavad samuti sarnast seost.

Joonis 7

PLSR ja BCA mudeli Venni diagrammid: (a) DPPH test. (b) eemaldamise test. (c) eemaldamisanalüüsi analüüsiti PLSR mudeliga. (d) DPPH analüüs. (e) eemaldamise test. (f) eemaldamise testi analüüsiti BCA mudeliga. Kattuv osa oli HM, WE ja HR ühised piigid.

3.4. Võrgufarmakoloogiapõhine analüüs

3.4.1. CT võrgu ehitamine

GeneCardsi andmebaasist ja OMIM-i andmebaasist saadi kokku 4359 antioksüdantse toimega seotud sihtmärki. Samal ajal sõeluti aktiivsed komponendid TCMSP andmebaasist ja SwissTargetPrediction andmebaasist. Seejärel koguti 198 sihtmärki ja standarditi need UniPorti andmebaasi kaudu. Aktiivsete komponentide ja antioksüdantidega seotud haiguste vahel oli 159 sihtgeeni (vt joonis S1). CT-võrk konstrueeriti, et illustreerida korrelatsiooni ühendite ja peamiste geenisihtmärkide vahel (joonis 9).

Joonis 9 CT-võrk. Võrk näitas korrelatsiooni aktiivsete komponentide ja peamiste geenisihtmärkide vahel.

3.4.2. PPI võrgustiku loomine ja peamiste sihtmärkide sõelumine

PPI visualiseeriti andmebaasi STRING abil (joonis 10). Võrgustik hõlmas 159 sõlme ja 2528 serva. Kogu interaktsioonivõrgustikus võivad ühenduskomponendid või rohkemate sihtpunktidega sõlmed olla võtmekomponendiks või sihtgeeniks, mis mängib C. tubulosa antioksüdantset rolli. Tulemused laaditi alla ja sisestati visualiseerimiseks Cytoscape'i. Mida suurem on alalisvoolu väärtus, seda tumedam on värv ja mida suurem on kombineeritud skoori väärtus, seda paksem on serv. Leidsime, et RAC-alfa seriini/treoniini valgu kinaas (AKT1), interlukiin-6 (IL6), tuumori nekroosifaktor (TNF) ja veresoonte endoteeli kasvufaktor A (VEGFA) paiknesid tsentraalselt (joonis 11), mis näitab, et need olid peamised sihtmärgid, kui aktiivsed komponendid avaldasid antioksüdantset toimet. On teatatud, et ehhinakosiid vähendab mitokondriaalset düsfunktsiooni mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaaside (MAPK) ja AKT ning nende fosforüülitud vormide reguleerimise kaudu [43]. Teadlased oletasid, et C. tubulosa glükosiidide diabeedivastane toime võib olla tingitud PhG-de antioksüdantsest aktiivsusest, vähendades põletikueelseid tsütokiine, nagu IL-6 ja TNF- [44]. Lisaks võib ehhinakosiid kahjustada munasarjavähi rakkude kasvu, vähendades VEGFA ekspressiooni, et pärssida angiogeneesi [45], mis on tihedalt seotud ROS-süsteemiga, kuna ROS kutsub esile VEGF-i signaaliülekande ekspressiooni [46].

Joonis 10 PPI võrk.

3.4.3. Rikastamise analüüs ja CTP võrgu loomine

Potentsiaalsed antioksüdantsed ühendid mõjutasid paljusid bioloogilisi funktsioone, sealhulgas BP, CC ja MF. Joonisel 12(a) on näidatud 10 parimat rada. PPI-võrgu prognoositud sihtmärgid reageerisid peamiselt paljudele bioloogilistele protsessidele, nagu orgaanilised tsüklilised ühendid, ksenobiootilised stiimulid, anorgaanilised ained, hapniku tase ja rakukomponendi liikumise positiivne reguleerimine. Rakukomponentide analüüs näitas, et geenid olid peamiselt seotud membraani parve, rakuvälise maatriksi, sekretoorse graanuli valendiku, transkriptsiooniregulaatori kompleksi ja raku apikaalse osaga. Need sihtmärgid osalevad ka paljudes molekulaarsetes funktsioonides, sealhulgas DNA-d siduva transkriptsioonifaktori sidumises, valkude homodimerisatsiooni aktiivsuses, valgu domeenispetsiifilises seondumises ja tsütokiini retseptoriga seondumises.

Joonis 12 Rikastamise analüüs: (a) GO rikastamise analüüs. b) KEGG rikastamise analüüs.

Nende peamiste sõlmpunktide bioloogiliste funktsioonide uurimiseks viidi läbi raja rikastamise analüüs. KEGG rikastamise tulemuste põhjal koostati mulldiagramm, mis näitab 20 parimat rada. Mida suurem koht oli, seda rohkem geene kaasati rajale. Nagu on näidatud joonisel fig 12(b), olid C. tubulosa peamised rajad seotud vähi, lipiidide ja ateroskleroosi radadega, AGE-RAGE signaaliülekande rajaga diabeedi tüsistuste korral, keemilise kantserogeneesiga – retseptori aktiveerimine ja MAPK signaaliülekande rajaga. Uuriti C. tubulosa mõju apoptoosile ja raku redoks-homöostaasile. Andmed viitavad sellele, et C. tubulosa võib olla paljulubav kandidaat käärsoolevähivastases ravis [47]. C. deserticola ekstrakti leidub eakatel inimestel [48].

Joonis 13 illustreerib seost radade ja nendega seotud sihtmärkide vahel ning seost kattuvate sihtmärkgeenide ja C. tubulosa bioloogiliselt aktiivsete komponentide vahel. Loodi globaalne vaade CTP võrgust, mis koosnes 12 koostisosast, 159 sihtmärgist ja 20 rajast. Enamikku sihtmärke jagasid kandidaataktiivsed ühendid. Need kõrge ühenduvusastmega kandidaataktiivsed koostisosad vastutasid CTP-võrgu, eriti kvertsetiini (kraad = 131) ​​suure vastastikuse seotuse eest. Enamik sihtmärke, nagu AKT1, IL6, TNF ja VEGFA, kaardistati vähi radadega seotud KEGG radadega.

Joonis 13 CTP-võrk.

4. Järeldused

Selles uuringus uurisime peamiselt keerulisi olukordi, võttes arvesse spektri-efekti seoseid HM, WE ja HR vahel.C. tubulosa. HPLC sõrmejäljed jaantioksüdantide testidkasutati erinevuste tuvastamiseks H-de, WE-de ja HR-ide vahelC. tubulosa. HPLC sõrmejälgede järgi oli 11 H-de, WE-de ja HR-ide partii hulgas 11 piiki. Geniposidhape,ehhinakosiid, verbascoside, tubulosiid Ajaisoakteosiidtuvastati nende piikide hulgas. Määrati nende viie komponendi sisaldus. Lisaks antioksüdantne toimeC. tubulosaHs, WE ja HR varieerusid keerukate tootmistingimuste põhjustatud keemilise koostise muutuste tõttu. Mitmekesiste statistiliste mudelite põhjal näitas spektri-efekti seose uuring, et tipp A6 võib olla kolmest vormist kõige otsustavam komponent.C. tubulosa. Uuring põhines võrgufarmakoloogial, et uurida selle võimalikke mehhanismeC. tubulosapealantioksüdatsioonühendite sõelumise, peamiste sihtmärkide ennustamise, võrkude ehitamise ja rikastamisanalüüsi läbiviimise kaudu. Meie tulemused annavad teoreetilise aluse taimsete jääkide ja nende potentsiaali taaskasutamiseksC. tubulosaravimiselantioksüdantidega seotud haigused.