Kliiniliselt olulisest mõttetust mutatsioonist põhjustatud ataksia telangiektaasia uudne ataksia hiiremudel (2. osa)

Lisateabe saamiseks võtke palun ühendustdavid.wan@wecistanche.com

3.{1}} Arutelu

Suurendades genotoksilist stressi DDR-i rajale sekundaarse tabamuse lisamise kaudu, lõime uudse hiiremudeli, mis kuvab seni kõigist mudelitest kõige põhjalikuma AT-sümptomite komplekti. See hõlmab tõsist ja progresseeruvat ataksiat, mis on seotud väikeaju atroofia ja PN-i omaduste häiretega, samuti vähktõve kõrge esinemissageduse ja immuunrakkude arengu defektidega. Üheskoos hõlmavad need kaasuvad haigused kolme peamist enneaegse surma põhjustAT – kõik panustavadligikaudu kolmandikule surmajuhtumitest. Nendest on ataksia töövõimetust põhjustav toime kõige tungivam ning patsientide ja hooldajate sõnul avaldab see nende elukvaliteeti kõige rohkem. Sel põhjusel on ataksia ja väikeaju atroofia esinemine selles uues hiiremudelis väga oluline, kuna see pakub esimest korda ressurssi mitte ainult neuroloogilise düsfunktsiooni mehhanismide selgitamiseks, vaid ka kriitiliselt vajaliku in vivo mudeli. testida väga vajalikke AT-ravimeid, nagu siin kirjeldatud läbilugemisühendid. Leidsime Atm3535 ataksia üldise progresseerumise vahel mitmeid sarnasusi; Aptx hiired jaAT patsiendid. Kliinilises AT-s on motoorne defitsiit täheldatav ligikaudu 2-aastaselt, kui vanemad ja arstid avastavad vähenenud võime üleminekul väikelapselt sujuvale, refleksiivselt koordineeritud väravale – kahjuks on haigustest tingitud motoorsete defektide kohta varasemates staadiumides vähe teada. madal levimus ja praegune varajase diagnostilise testimise puudumine (Rothblum-Oviatt et al. 2016). Patsiendid õpivad tavaliselt kõndima ilma abita ja neuroloogilised sümptomid kipuvad püsima stabiilsena esimese 4–5 eluaasta jooksul (Rothblum-Oviatt et al. 2016). Me leidsime sarnase motoorse puudujäägi varase progresseerumise Atm735 × R3x puhul; Aptx^' hiired, kes tuvastasid varakult kerged motoorsed häired P8 juures (parandusrefleksi defitsiit), millele järgnes suhtelise stabiilsuse periood, enne progresseeruva ja raske ataksia algust, mis arenes pärast p210, mis hõlmas muutusi kõnnakus, ehmatusrefleksi, treemorit ja liikumist. tegevust. Nendest leidudest kerkivad esile mitmed olulised küsimused, sealhulgas see, kas ATM-il ja/või APTX-il on närvisüsteemi arengus roll.

väikeaju. Tulevased uuringud, mis keskenduvad häire varasele faasile, on kriitilise tähtsusega, et mõista, kas väikeaju areneb normaalselt enne düsfunktsiooni või kas algpõhjuseks on arengudefektid. Samuti avastasime sarnaselt AT-patsientidega, et hilja areneva ataksia raskusaste oli erinev, mõned hiired liikusid kohmaka kõrge astmega tagumise väravaga (video 3) ja teised liikusid peaaegu täielikult tagumise pagasiruumi väänamise tõttu ( Joonis 1E ja video 4) (Rothblum-Oviatt jt 2016; Levy ja Lang 2018; Boder ja Sedgwick 1958). Üldiselt leidsime, et Atm?35 × R35 ×; Aptx hiirtel tekkis visuaalselt sügav ja mõõdetav progresseeruv motoorse koordinatsiooni kaotus, mis sarnanes AT-patsientidel täheldatule, mis päästeti vähemalt ühe Atm või Aptx get he koopia ekspressiooniga. Motoorse koordinatsiooni kaotus AT-s on tingitud väikeaju degeneratsioonist, mis on tingitud selle suhteliselt selektiivsest neuropatoloogiast kogu ajus ja selle põhjuslikust rollist mitmes erinevas ataksia vormis (Hoche et al.2012). KooskõlasAT patsientneuroimaging uuringud (Wallis jt 2007; Sahama jt 2015; Sahama jt 2014; Dineen jt 2020; Tavani jt 2003; Quarantelli jt 2013), leiame, et väikeaju suurus on Atm735 × R3 × ; Aptx hiired on algselt normaalsed, kuid atroofeeruvad järk-järgult samaaegselt neuroloogilise funktsiooni muutustega. Kuigi inimestel on ataksia peamiseks põhjuseks peetud väikeaju koe kadu, on kliiniliste andmete põhjal ebaselge, kas ataksia raskus ennustab hästi surmajärgset väikeaju degeneratsiooni ulatust (Aguilar et al. 1968b: Crawford et al, 2006). : Dineen et al.2020). ATM35×R35×; Aptx^ hiirtel leiame selge atroofia, mis on seotud Purkinje neuroni dendriidikihi hõrenemisega, mis eelneb hilisele, tõsisele käitumishäirele. Meie histoloogilised vaatlused Atm?35xR35×; Aptx'hiired viitavad sellele, et ataktilise fenotüübi tekitamiseks piisab muutustest väikeaju funktsioonis endas, selle asemel, et väikeajurakkude sügav kadu. See on kooskõlas käitumisdefektide jälgimisega enne olulist PN-i kadu mitmes SCA-s (Shakkottai et al. 2011: Lorenzetti jt 2000; Clark jt 1997; Jayabal jt 2016). Põhjus, miks hiirtel ataksia tekitamiseks on vaja ATM-i ja APTX-i puudulikkust, kui kummagi kadumisest piisab inimestel ataksia tekitamiseks, jääb ebaselgeks. Üks võimalus on see, et näriliste aju võib paindlikumalt kasutada kompenseerivaid teid või üleliigseid valke, reageerides samal ajal 10-20k DNA kahjustustele, mis mõjutavad rakke iga päev (Lindahl ja Barnes 2000). Selle väljakutsega toimetulemiseks on olemas mitmeid DNA parandamise vorme, sealhulgas aluse ekstsisiooni parandamine (BER), nukleotiidide ekstsisiooni parandamine (NER),

Cistanche kohta lisateabe saamiseks klõpsake siin

samuti homoloogne ja mittehomoloogne otste ühendamine (HEJ ja NHEJvastavalt), millega on seotud ATM ja APTX (Chou et al. 2015; Caglayan jt 2017; Wakasugi jt 2014; Tumbale jt 2018; Chatterjee ja Walker 2017). Alternatiivina võib see olla juhul, kui ATM-i või APTX-i puudus üksi ei mõjuta piisavalt rakkude tervist hiire suhteliselt lühikese eluea jooksul ja seega on vajalik mõlema valgu kõrvaldamine, et saavutada selle aja jooksul avalduvate DNA kahjustuste piisav kogunemine. Seda võimalust tugevdab tõsiasi, et ATM-il ja APTX-l on DNA kahjustuse vastuses erinevad biokeemilised omadused ja funktsionaalsed rollid ning seetõttu võib eeldada, et mõlema puudus põhjustab genoomi stabiilsuse laiemat mõju (st suurenenud genotoksiline stress). Meie järeldus, et hiirte neuroloogiliste defektide esilekutsumiseks on vaja kahte genoomi stabiilsusraja valku, viitab tugevalt sellele, et väikeaju defekte põhjustavad pigem ATM-i oriole kadumine DNA parandamisel, mitte oksüdatiivse stressi signaaliülekande, mitofagia või mitokondriaalse funktsiooni potentsiaalsed funktsioonid. Shiloh 2020). Alternatiive ei saa aga täielikult välistada, sest APTX-i on sarnaselt ATM-iga täheldatud ajurakkude mitokondrites, kus arvatakse, et see toetab mitokondriaalse DNA töötlemist (Meagher ja Lightowlers 2014; Sykora et al. 2011). See uus hiiremudel pakub uut tööriista nende võimaluste uurimiseks ja mehhaaniliseks määratlemiseks, kuidas ATM-i ja APTX-i kadumine põhjustab lõpuks väikeaju düsfunktsiooni. PN-ides täheldatud biofüüsikalised häired, mis on registreeritud AtmR35XR35X-st; Aptx hiiri leidub sarnaselt ka mitmetes teistes ataksia hiiremudelites. See hõlmab muutusi, mida täheldasime PN-sisendtakistuse, membraani mahtuvuse ning AP läve ja laiuse osas, mida on kirjeldatud ka SCA hiiremudelites nagu 1, 3 ja 7 (Stoyas et al.2020; Shakkottai et al.2011; Dell). Orco jt 2015). Veelgi enam, meie teatatud PN aktsioonipotentsiaali tulistamissageduse järkjärguline vähenemine korreleerub positiivselt ataksia tekkega AtrnR35XR35X; Aptx'hiirtest on teatatud paljudes ataksiliste hiiremudelites, sealhulgas SCA-des 1, 2, 3, 5, 6 ja 13, aga ka mõnes episoodilises vormis (vt ülevaadet (Cook, Fields ja Watt 2021)). Arvestades PN-i häirete olulist kattumist, mida täheldati paljude erinevate ataksiate puhul, mis on põhjustatud erinevatest raku defektidest, on PN AP süütesageduste taastamist peetud laiapõhjaliseks terapeutiliseks lähenemisviisiks. Siiski jääb ebaselgeks, kas vähenenud PN-i tulistamine on ataksia põhjuslik tegur. Lisaks näitavad eksperimentaalsed tõendid, et muutused PN-i aktiivsuses võivad tegelikult olla üldine reaktsioon homöostaasi säilitamisele PN-i füsioloogia pideva haigusega seotud kahjustuse ajal (Dell'Orco et al. 2015). Seega on vaja jätkuvaid jõupingutusi kõigi väikeaju ataksiate osas, et seostada haigusest põhjustatud geneetilisi, molekulaarseid ja rakulisi häireid väikeaju närvisignaalide spetsiifiliste muutustega, mis lõpuks tekitavad ataksia. Selles jõupingutuses on olulise tähtsusega kindlaks teha, kas haigusi põhjustavad väikeaju defektid põhjustavad tavaliselt või erinevalt ataksiat väikeaju funktsiooni kaotuse (nt koordineerivate signaalide kadu liikumise ajal) või domineeriva-negatiivse mõju tõttu (nt allavoolu närvisüsteemi häirimine). ebanormaalsete närviväljundmustritega ahelad). Lõppkokkuvõttes, kuigi ühisel terapeutilisel strateegial väikeaju ataksia vastu võitlemiseks oleks suurim mõju, võib tõhusa ravimeetodi edukaks väljatöötamiseks osutuda vajalikuks suunatud lähenemine, mis käsitleb raku düsfunktsiooni erinevaid geneetilisi ja molekulaarseid põhjuseid. Mehaaniline seos DNA puudulikkuse vahel stabiilsusvalkude nagu ATM ja APTX ning PN-i düsfunktsioon pole kaugeltki selge. Meie tulemused näitavad, et ATM-i ja APTX-i kadude mõju PN-idele on olemuslik, kuna me ei leia muutusi graanulirakkude presünaptilistes omadustes ega tõendeid nende raku kadumise kohta (GCL-i paksus ei muutu). Veelgi enam, kuigi me täheldasime erinevusi ATM- ja APTX-puudulike PN-de ja metsiktüüpi olivari sisendite lühiajalises plastilisuses, viitavad need tulemused tõenäoliselt Ca2* homöostaasi häirele, mis võib olla tingitud inositooli 1,4 vähenemisest,5- trifosfaadi retseptori 1 (ltpr1) ekspressioon, mis on sarnane SCA-de 1, 2 ja 3 hiiremudelites ning ATM-puudulike hiirte puhul täheldatuga (Kim jt 2020; Chen jt 2008; Demirci jt 2009; Shakkottai et al. al.2011). Kuigi see on paljulubav võimalus edaspidiseks uurimiseks ja võrdlemiseks, on isegi SCA-de puhul veel ebaselge, kas Ca2* homöostaasi muutused on põhjuslik tegur või lihtsalt järjekordne sümptom või isegi kompenseeriv reaktsioon haigetele või häiritud PN-idele (Dell). Orco jt 2015). Immuunsüsteemis on ATM seotud DNA katkemiste parandamisega, mis looduslikult tekivad antigeeniretseptori geenide geenide ümberkorraldamisel B- ja T-rakkude prekursorites, mis on nende rakkude antigeeniretseptori (LG ja TCR) mitmekesisuse jaoks kriitiline nähtus. selle leidmineT-rakkproportsioonid veres on oluliselt vähenenud, mis on kooskõlas varasemate uuringutega inimestel ja AT knockout hiirtel (Schubert, Reichenbach ja Zielen 2002; Hathcock jt 2013; Chao, Yang ja Xu 2000; Barlow et al. 1996). See T-rakkude vähenemine perifeerias on tõenäoliselt korrelatsioonis nii rakulise kui ka humoraalse immuunsuse defektiga. Oluline on see, et leidsime, et ATM-i geeni ühe koopia ekspressioonist piisab CD4 pluss puudujäägi taastamiseks veres, mis näitab, et ravimeetoditel, mis suudavad taastada osalise ATM-i ekspressiooni, on terapeutiline efektiivsus. Kuigi me ei ole selles artiklis B-rakkude arengut hinnanud, on tõenäoline, et nende mehaaniliste sarnasuste tõttu kehtivad selle protsessi kohta sarnased järeldused (Marshall et al. 2018). Nagu oodatud, on T-rakkude vähenemine perifeerses veres korrelatsioonis tümotsüütide defektse arenguga. Harknääres leidsime kaks peamist defekti. Üks, mis on põhjustatud peamiselt APTX-i puudulikkusest, ilmneb DN3-DN4-i ülemineku defektina, mis langeb kokku TCR-lookuse varajase ümberkorraldamisega. Teine defekt, mis on peamiselt põhjustatud ATM-i puudulikkusest, korreleerub topeltpositiivse CD4 * CD8 vähenenud progresseerumisega üksikuteks positiivseteks rakkudeks, peamiselt CD4' tümotsüütideks. Kuigi APTX-i leid oli üllatav, kuna selle puudulikkust (AOA 1) ei seostata immuunpuudulikkusega, interakteerub APTX teadaolevalt TCR-i geeni ümberkorraldusvalkudega, sealhulgas XRCC4-ga (Clements et al. 2004). Tulevased uuringud, mille eesmärk on määratleda APTX roll lõppliitmismehhanismides TCR geeni ümberkorraldamise ajal, on

Lisaks vajab täiendavat uurimist võimalus, et alternatiivsed lõppliitmismehhanismid, nagu mikrohomoloogiate kasutamine, põhjustavad selle puudumisel immuunpuudulikkuse puudumist (Bogue et al. 1997). Atm?35×/R35× vastupidavus; Aptx'hiired on tunduvalt pikemad kui varasemad AT hiiremudelid. Võrdluseks, esimeneAT KOhiiremudel, mille on kirjeldanud Barlow et al. suri tümoomidesse tavaliselt 2-4 kuu jooksul pärast sündi (Barlow et al. 1996). Selle ja paljude teiste knockout AT hiiremudelite vähktõve elulemuse vähenemine on tõenäoliselt geneetiline, kuna on näidatud, et mutatsiooni sisaldaval tausttüvel on A/J ja C57BL/6 puhul oluline mõju vähi levimusele ja ellujäämisele.

taustaga, mille elulemus on oluliselt suurenenud võrreldes BALBC ja 129S tüvedega (Genik et al. 2014). Tõenäoliselt on selle põhjuseks asjaolu, et meie ATM-defitsiitsed hiired loodi C57BL/6 taustal; et Aptx*t hiirtel ei arene ataksia, on see nende suhteliselt pikk eluiga. Arvestades, et Atm35xR35×; ebatõenäoline, et AT KO hiirte varajane surm takistab ataktilise fenotüübi jälgimist, mis muidu nendel hiirtel areneks. Siiski pole teada, kas C57BL/6 taust annab vastupidavuse ataksia tekkele, nagu see on vähi puhul. Haiguse raskust mõjutavate geneetiliste või võimalike epigeneetiliste tegurite määratlemine võib anda võimalusi edaspidiseks terapeutiliseks arenguks. Arvestades meie hiiremudeli ATM-i ja APTX-i nullmutatsiooni globaalset olemust, ei saa me täielikult välistada, et väikeajuvälised defektid võivad samuti kaasa aidata raskele ataksiale fenotüübile ja seega tulevasele uurimisele väljaspool väikeaju eesajus, ajutüves ja seljaajus. , ja isegi lihaseid tuleb läbi viia. Kuigi leidsime väikeaju erinevates piirkondades PN-i põlemisomadustes mõningaid anatoomilisi erinevusi, ei tuvastanud me piirkondlikke erinevusi ML laiuses ega PN tiheduses. Piirkondliku anatoomia kasutamisel väikeaju rühmitamise tegurina on siiski probleeme, kuna koe füüsilised voldid ei pruugi olla korrelatsioonis kirjeldatud funktsionaalsete, molekulaarsete ekspressioonide või füsioloogiliste omaduste domeenide piiridega (Apps ja Hawkes 2009). Tsutsumi jt 2015; Gao, van Beugen ja De Zeeuw 2012; Zhou jt 2014). Eksperimendid, mis keskenduvad väikeaju defektide ulatuse uurimisele nendes valdkondades, on olulised tulevastes uuringutes ja võrreldes anekdootlike aruannetega AT-patsientide anatoomiliste erinevuste kohta (Verhagen jt 2012; De Leon, Grover ja Huff 1976; Amromin, Boder, ja Teplitz 1979; Monaco jt 1988; Terplan ja Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare ja Lopez 1967; Aguilar jt 1968a; Paula-Barbosa jt 1983). Kuigi me tuvastame Atm735wR35x-s ataksia progresseerumise kaks potentsiaalset etappi; Aptx hiirtel areneb raske ataksia hilisem staadium hiirtel täiskasvanueas, võrreldes lapsepõlves algusega inimestel. See võib piirata selle kasutamist mõnes neuroarengu uuringutes. Samuti tuleb tulevaste katsete tõlgendamisel hoolikalt arvesse võtta asjaolu, et see uus mudel ekspresseerib samaaegselt nullmutatsioone kahes genoomi stabiilsuse geenis – olukorda, mida ei ole tuvastatud ei AT ega AOA1-ga inimpatsientidel. Lõpuks on väljakutseks olnud täpselt kindlaks teha, kus, millal ja kuidas ATM-i puudulikkus põhjustab väikeaju patoloogiat ja ataksiat, kuna varasematel ATM-puudulikel hiirtel puuduvad üldiselt iseloomulikud tunnused, mis on vajalikud raku- ja molekulaardefitsiidi põhjuslikuks seostamiseks ataksia fenotüübiga. Määratletud on mitu paljutõotavat uurimisviisi, sealhulgas need, mis keskenduvad neuronite tasemele, kus ATM on seotud oksüdatiivse stressi signaaliülekandega (Chen et al. 2003) ja sünaptilise funktsiooniga (Li jt 2009; Vail jt 2016). samuti gliia funktsioon, kus hiljutised tõendid näitavad, et gliia patoloogia võib olla väikeaju patoloogia juhtiv tegur (Kaminsky jt 2016; Campbell jt 2016; Petersen, Rimkus ja Wassarman 2012; Weyemi jt 2015). See uudne loomamudel pakub uut vahendit mehhaaniliste hüpoteeside testimiseks selle kohta, kuidas ATM-i puudulikkus põhjustab väikeaju patoloogiat ja ataksiat. Lisaks võib see mudel olla kõige olulisem kriitilise prekliinilise vahendina varem pakutud ravikandidaatide (Browne jt 2004; Chen et al. 2003) ja meie enda SMRT ühendite (Du et al. 2013) testimiseks. Ei saa ülehinnata tõsiseid piiranguid, mis tulenevad terapeutiliseks testimiseks sobiva prekliinilise mudeli puudumisest, eriti selliste haruldaste häirete puhul nagu AT ja AOA1.

4.{1}} Materjalid ja meetodid

4.1 Eetikaavaldus

See uuring viidi läbi rangelt kooskõlas riiklike tervishoiuinstituutide laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhendis esitatud soovitustega. Kõiki loomi käideldi vastavalt Lundquisti Instituudi (31374-03,31773-02) ja UCLA (ARC-2007-082, ARC{{3}) kinnitatud institutsionaalse loomade hooldamise ja kasutamise komitee (IACUC) protokollidele. }). Protokolli kiitis heaks Lundquisti Instituudi loomkatsete eetika komitee (kindlusnumber: D16-00213). Tehti kõik endast oleneva, et vähendada valu ja kannatusi, pakkudes vajadusel tuge ja valides eetilised näitajad.

4.2 Hiired

All mice were group-housed and kept under a 12-h day/night cycle with food and water available ad libitum. Animals were housed within the general mouse house population, and not in specialized pathogen-free rooms. Older animals were made available wetted food or food gel packs on the ground of the cages as ataxia developed. Atm35 and Atm935×mice were created and provided by Dr. Hicks and colleagues at the University of Manitoba. These mice were created to contain the c.103C>Põhja-Aafrika suurel populatsioonil leitud T-mutatsioonATpatsiendid using recombineering Gateway technology and site-directed mutagenesis. A C>T mutation at this position in the mouse Atm gene creates a TAG G stop codon. The same mutation in the human ATM gene produces a TGA G stop codon. In consideration of the use of these models for therapeutic interventions, we chose to create a mouse model for each of the two PTC codons(Fig.1A). A modified Gateway R3-R4-destination vector was used to pull out the desired region of the mouse Atm gene from a Bacterial Artificial Chromosome (BAC) and subsequently mutated to create either a TAG G stop codon at codon 35(M00001, position 103(C>T))or a TGA G stop codon (M00002, position 103 (CAG>TGA), mis kopeerib inimese AT PTC). Seejärel klooniti genoomsed alleelid imetajate sihtimisvektori NorCOMM modifitseeritud versiooni, kasutades 3-way Gateway Reaction'i (Bradley et al. 2012). Saadud sihtvektorid elektroporeeriti C2 ES rakkudesse (C57BI/6N, saadud A. Nagy laboris, Torontos, Kanadas) ja edukalt sihitud kloonid tuvastati selektsiooniga G418 abil (Gertsenstein et al. 2010). Muteeritud sihtimiskasseti integreerimine Atm geeni lookusesse kinnitati Southern blot'iga ja PCR produktide sekveneerimisega, et kinnitada Atm PTC mutatsiooni olemasolu, veatu sihtimine Atm lookusesse ja veavabad funktsionaalsed komponendid.

vektor (andmeid pole näidatud). Transgeensete liinide saamiseks kasutati blastotsüsti süstimiseks positiivseid ES kloone. Transgeenne alleel sisaldas inimese beeta-aktiini promootor-deltatTK1-Neo cassette in the intron upstream of the region containing the mutated exon. This floxed cassette was subsequently excised by crossing with a Cre driver mouse(B6.C-Tg(CMV-are)1Cgn/J) to generate Atm3x+ and AtmM1(103CTMFcc, respectively) mouse lines Atm35×+ (MGI nomenclature: AtmTM1(103CAG>TGA)MFGCc;(joonis 1A). Kahe Atm liini genotüpiseerimiseks kasutati järgmisi praimereid Tm 62 kraadi juures: Atm geeni edasisuunaline (F) praimer: 5'-CCTTTGAGGCATAAGTTGCAACTTG-3'; ja Atm geeni pöörd(R)praimer: 5'-GTACAGTGTATCAGGTTAGGCATGC-3', luues metsiktüüpi alleelprodukti pikkusega 151 aluspaari või sihitud alleeli produkti pikkusega 241 aluspaari (joonised 1A, 1B). Atmn35~ ja Atm035×v olid ristati tagasi C57Bl/6J hiirtega 9 põlvkonda (99,2 protsenti isogeensed) enne külmsäilitamist ja sellele järgnevat rederiveerimist, kasutades C57BI/6J surrogaatemasid. Atm735× ja Atm35x ja Atm 35×/Q35× olid aretajad, mis saadi F1 õdedelt Atm35 ja Atm835X pluss hiirtelt. AtmR35 × k35 ×: leiti, et mõlemad olid viljakad. Aptx knockout (Aptx) hiired loodi ja anti dr. Mathewsile embrüoteena dr McKinnonilt (Ahel et al. 2006) ning seejärel saadi need uuesti C57Bl/6J surrogaatemade kaudu. Aptx' hiired on C57Bl/6 ja 129 segataustal. atm35k35; Atm35X-st loodi mitmesuguste metsiktüüpi, heterosügootsete ja homosügootsete kombinatsioonidega Aptx hiired; Aptxt aretajad loodi AtmA35×R35 ja Aptx^ hiirte ristamise teel. Pikisuunalises käitumise uuringus kasutati kõnnianalüüsideks ja SHERPA testimiseks ühte topeltmutandi ja vastavate kontrollhiirte rühma (joonised 2, 3). Elektrofüsioloogilistes, immunohistoloogilistes ja vertikaalse pooluse katsekatsetes kasutati mitut täiendavat vanusega sobitatud topeltmutant- ja kontrollhiirte rühma (joonised 4, 7). Immunoloogilised ja valgu ekspressioonikatsed viidi läbi hiirtega, kes olid aretatud algsetest AtmR35× ja Atm35× taastuletatud hiirtest (joonised 5, 6 ja 8). Genotüpiseerimine viidi läbi P8-11 hiirte kõrvakoe proovidest. Iga looma genotüübi määramiseks kasutati Transnetyx Inc. läbi viidud reaalajas PCR meetodeid. Loomad tehti tuvastatavaks varvaste tätoveeringutega, mis tehti samaaegselt kõrva biopsiaga. Atm35 × ja Atm35 × ainulaadsed praimerid kvantifitseeriti ja neid kasutati metsiktüüpi, heterosügootsete ja homosügootsete hiirte tuvastamiseks (loetletud ülal). Nende genotüüpide hindamiseks kasutati Aptx'ja Aptx*" praimereid.

4.3 Loomade tervishoid

Loomi kaaluti digitaalse kaaluga P8, 45, 120 210 400. Loomade surm registreeriti surnuna leidmise päeval või eutaniseerimise päeval, mil loomad jõudsid humaanse lõpp-punktini (loom ei saanud end 60ndates eluaastates korda teha, karvade märkimisväärne mattumus viitab enesehoolduse puudumisele või liigsele stressile, nagu märkis veterinaararst personal). Loomade korjused külmutati kohe pärast surma ja surmajärgsed lahkamised viidi läbi partiidena. Tõenäoline surmapõhjus selgitati välja meie parimate võimaluste kohaselt koostöös personali veterinaararstiga (dr. Catalina Guerra) siseorganite visuaalse kontrolli teel. Vivaariumi töötajad tegid mõned hiired kannibaliseerituks või hävitasid nad kogemata

Seetõttu märgiti need kui "kadunud".Hiired, kellel ei olnud nähtavat visuaalset surmapõhjust, märgiti "määramatuks".Hiired, kellel leiti rindkere massiga noortel hiirtel harknääre normaalse asukoha lähedal, loeti "tüümuse vähiks". tõenäolised surmapõhjused (nt maksa suurenemine, kuseteede ummistus) märgiti "muu".

4.4 Käitumine

Enne mis tahes käitumistesti läbiviimist aklimatiseeriti hiiri käitumiskomplektiga ~ 20 minutit. Hiiri testiti erinevatel kellaaegadel vastavalt nende igapäevasele tsüklile. Näidatud genotüüpidega naiivsete topeltmutantsete hiirtega viidi läbi hulk käitumisteste erinevatel ajahetkedel, sõltuvalt käitumisest, kuid samas hiirte rühmas. Testide komplekt hõlmas Catwalk Gait'i hindamist (P45, 120 210, 400) ja SmithKline-Beecham Harwell Imperial-College'i ja Royal-London-Hospital Fenotüübi hindamise (SHERPA) testide (P30 ja 400) alamhulka. Need testid viis läbi UCLA Behavioral Core. Topeltmutantseid ja kontrollhiiri uuriti lisaks vertikaalse pooluse testiga. Kõik käitumisaparaadid pühiti iga katsealuse vahel etanooliga (70 protsenti).

Kõnnaku analüüs

Kasutasime Noldus Catwalk Gait analüüsisüsteemi, mis on loodud hiirte kõnnaku poolautomaatseks mõõtmiseks ja analüüsimiseks tavalisel kõndimisel. Lühidalt, hiirte liikumine klaaspõhjaga koridoris on kesksest positsioonist salvestatud video. Käpajäljed on videol esile tõstetud klaasist jalutusplatvormi valguse tõttu. Seejärel tuvastatakse iga hiiresamm videos Catwalk XT (Noldus) abil poolautomaatselt. Iga hiire käitamine koosneb kolmest järjepideva liikumise katsest jälgitaval platvormil. Aktsepteeritakse ainult järjepidevaid katseid ja hiirtel võib kuluda kuni 10 katset, et sooritada 3 nõuetele vastavat katset mõlemas suunas üle koridori. Nõuetele vastavad katsed määratleti katsetena, mille käigus liikumine üle platvormi oli alla 5 s ja kiiruse kõikumine ei ületanud 60 protsenti. Kui hiired olid platvormile asetatud, jooksid nad üldiselt edasi-tagasi, ilma et oleks vaja eksperimenteerija õhutust.

Vertikaalne poolus

Hiired asetatakse 80 cm kõrguse poldi ülaossa nii, et nende nina on allapoole ja tagakäpad võimalikult tipu lähedale. Hiired vabastatakse kohe ja aeg algas kohe pärast paigutamist.

Aeg peatub, kui esimene esikäpp puudutab pooluse all olevat pinda. Hiire loomuomane eelistus on kohe teivast alla ronida ja masti läbimiseks antakse aega kuni 60 sekundit, vastasel juhul aidatakse nad varda küljest lahti. Lõpetamata katsele antakse automaatselt aeg 30 sekundit, kuna 95 protsenti hiirtest, kes 30 sekundi jooksul ei laskunud, olid 60ndate märgi juures ikka poolusel. SHIRPA käitumistestid viis läbi California ülikooli Los Angelese käitumistuum P30 juures

ja P400. Kõik parameetrid hinnatakse kvantitatiivse hinnangu andmiseks. mis võimaldab võrrelda tulemusi nii ajas kui ka erinevate laborite vahel. Enne järgmise hiire juurde liikumist testiti iga hiirt järjestikku kõigi käitumiste osas ~20-minuti jooksul. Eksperimenteerija jäi looma genotüübi suhtes pimedaks. Sõelumine viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud (Rogers et al. 1997).

Käitumisvaatlus

Esmane ekraan annab käitumise vaatlusprofiili ja iga looma hindamine algab häirimatu käitumise jälgimisega vaatepurgis (läbimõõt 10 cm) 5 minuti jooksul. Lisaks kehaasendi, spontaanse aktiivsuse, hingamissageduse ja värina käitumisele registreerib vaatleja kõik veidra või stereotüüpse käitumise ja krampide, kompulsiivse lakkumise, ennasthävitava hammustamise ja retropulssiooni (tagasi kõndimise) juhtumid ning ruumilise liikumise tunnused. desorientatsioon.

Käitumine areenil

Seejärel viiakse hiir areenile (30 cm x 50 cm), et testida ülekande erutust ja jälgida normaalset käitumist. Areen on tähistatud 10 x 10 cm² ruutudeks, et mõõta liikumisaktiivsust 30 s-perioodi jooksul. Kui hiir on areenil aktiivne, registreeritakse jahmatusreaktsiooni, kõnnaku, vaagna kõrguse ja saba kõrguse mõõdud.

Lamamiskindlus

Loom on kinnitatud lamavasse asendisse, et registreerida autonoomne käitumine. Selle hindamise käigus hinnati haardetugevust, keha toonust, pinnarefleksi, sarvkesta refleksi, varba pigistust, traadi manöövrit ja südame löögisagedust.

Tasakaal ja orientatsioon

Lõpuks viidi läbi mitu vestibulaarsüsteemi funktsiooni mõõtmist. Viidi läbi püstuvusrefleksi, kontaktpüstuvusrefleksi ja negatiivse geotaksise testid. Kogu selle protseduuri jooksul registreeriti häälitsus, urineerimine ja üldine hirm, ärrituvus või agressiivsus.

Kasutatud seadmed

1.Pleksiklaasist areen (ligikaudsed sisemõõdud 55x33 x18 cm). Areeni põrandal on pleksiklaasist leht, millele on märgitud 15 ruutu (11 cm). Üle tagumise parema nurga on kinnitatud jäik horisontaaltraat (läbimõõt 3 mm), et loomad ei saaks traadi manöövri ajal külgi puudutada. Kogu kasti laiuse ulatuses on kinnitatud ruudustik (40x 20 cm) 12 mm võrgusilmaga (ligikaudne), et mõõta saba vedrustust ja haardetugevust. 2. Vaatepurgina kasutati läbipaistvat pleksiklaasist silindrit (15 x ll cm). 3. Üks võrepõrand (40x 20 cm) 12 mm silmadega, millel seisavad vaatepurgid.4. Neli silindrilist roostevabast terasest tuge (3 cm pikkus x 2,5 cm läbimõõt), et tõsta pingilt võre. 5. Üks kandiline (13 cm) roostevabast terasest plaat loomade areenile viimiseks. 6. Lõigatud pikkused 3/0 Mersilk, mida hoiti tangides sarvkesta ja pinnarefleksi testide jaoks 7. Plastikust tüüblivarras teritati pliiatsi otsani, et testida süljeeritust ja hammustamist.8. Peente otstega kumerad lahklihatangid (125 mm tangid, Philip Harris Scientific, kat. nr D46-174) varvaste pigistamiseks. 9.Stopper.10. Ehmatusreaktsioonide testimiseks kasutatakse IHR-i klikikasti. Click Box genereerib lühikese 20 kHz helina 90 dB helitugevusega, kui seda hoitakse 30 cm hiire kohal. Võtke ühendust prof. KP Steeliga, MRC kuulmisuuringute instituut, University Park, Nottingham NG7 2RD. Joonlaud. järgides avaldatud meetodeid (Hansen et al., 2013). Lühidalt, väikeaju eemaldati kiiresti ja sukeldati jääkülma rakuvälisesse lahusesse, mille koostis oli (mM): 119 NaCl, 26 NaHCOg, 11 glükoosi, 2,5 KCl, 2,5 CaCla, 1,3 MgCla ja 1 NaHzPOa, pH 7,4, kui gaasistatud 5% CO-/95% O2-ga. Väikeaju lõigati parasagitaalselt vibratoomi abil (Leica VT-100, Leica Biosystems, Nussloch, Saksamaa) ja inkubeeriti algul 35 kraadi juures -30 min, seejärel tasakaalustati ja säilitati kasutamiseni toatemperatuuril. Rakuväline elektrofüsioloogia Rakuvälised ja rakusisesed salvestused saadi Purkinje neuronitest (PN) viiludena, mida perfuseeriti pidevalt karbogeeniga mullitud rakuvälise lahusega ja mida hoiti kas 37 kraadi C (rakuväline) või 32 kraadi (rakuväline) ± 1 kraadi juures (vt ülal). Rakud visualiseeriti DIC-optika ja 40-kordse veekümblusobjektiiviga (NA 0,75), kasutades Zeiss Examineri mikroskoopi. Klaaspipetid takistusega ~3 MQ (mudel P-1000, Sutter Instruments, Novato, CA) täideti ekstratsellulaarse lahusega ja paigutati PN aksoni küngaste lähedusse, et mõõta aktsioonipotentsiaaliga seotud mahtuvusliku voolu transiente pingeklambri režiimis. pipeti potentsiaali hoitakse 0 mV juures. Terve raku patch-clamp salvestamiseks täideti pipetid intratsellulaarse lahusega (mM): 140 kuud (CH3KO3S), 10 NaCl, 2 MgCl2, 0,2 CaClz, 10 HEPES, 14 fosfokreatiini (trissoola), 1 EGTA, 4 Mg Inhibeerivate GABAegeriliste sünaptiliste sisendite blokeerimiseks lisati -ATP,0,4 Na-GTP.100 µM pikrotoksiini (Sigma). Andmed saadi kasutades

MultiClamp 700B võimendi sagedusel 20 või 100 kHz pinge- või vooluklambrirežiimis, Digidata 1440 koos pClamp10-ga (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) ja filtreeritud sagedusel 2–4 kHz. Seeriatakistus oli tavaliselt vahemikus 10–15 MQ. Seeriatakistus kompenseeriti 80 protsendiga ainult lühiajaliste plastilisuse katsete puhul. Ekstratsellulaarsete salvestuste jaoks registreeriti iga looma kohta kokku 20–45 PN-i kõigis genotüüpides, soodes ja vanuserühmades. Salvestised jaotati nii väikeaju mediaalse-lateraalse kui ka rostrokaudaalse telje vahel. Uuriti ainult rakke, millel oli "tervislik" välimus (rakupiiride madal kontrastsus) ja regulaarne, katkematu põlemiskiirus. Analüüsi käigus leiti, et mõne raku tulistamises oli lünki, mis olid pikemad kui 2 sekundit ja need rakud jäeti analüüsist välja, kuna seda tüüpi tulistamist seostatakse "ebatervislikkusega". Topeltmutantsed koed ei erinenud kvalitatiivselt DIC-mikroskoopia all enne registreerimist, samuti ei olnud "ebatervislike" rakkude arv suurem kui teiste genotüüpide puhul (7% vs 4-11% kõigist rakkudest kontrollgenotüüpide P400 juures). Neuraalse aktiivsuse ruumiline võrdlus saadi flokuluse, külgmiste (2"d või 3'), vahepealsete (6" või 7.) ja mediaalsete (11" või 12t) lõikude jadalõikudest salvestamise teel. nooremad vanuserühmad (P45 ja 110), et need vastaksid ligikaudu salvestuste suhtelisele paigutusele vanuserühmade lõikes. 0-3 salvestused tehti iga lõigu igast sagarast sõltuvalt koe kvaliteedist ja tervisest. Iga salvestus kestis {{29} Igas vanuserühmas kasutati 3 kuni 5 hiirt ja katsetaja pimestati genotüübi, vanuse ja soo suhtes.

Intratsellulaarsed salvestused saadi PN-idest kas mediaalse väikeaju (st vermis) lobule IIl või VIl; sagarate vahel ei täheldatud statistilisi erinevusi omadustes.

Analüüsid

Spontaansed aktsioonipotentsiaali interstiimulite intervallid tuvastati ja analüüsiti ClampFiti (Molecular Device), GoPro (Wavemetrics) ja Exceli (Microsoft) standardsete ja kohandatud rutiinide abil. Täpsemalt tuvastati tegevuspotentsiaalide lävi ning hüppestatistika (st sagedus ja intervalli pikkus) määrati kindlaks kohandatud lgorProroutines (TaroTools;https://sites.google.com/site/tarotoolsregister/) abil. Keskmise piikidevahelise intervalli (CV) variatsioonikordaja (CV2=2 ISIn pluss 1-ISInl/(ISIn pluss 1 plus ISIn)) arvutati Excelis kasutades kohandatud makrod. Standardseid membraani omadusi analüüsiti lgorPro abil. RM määrati 3 pingejälje vastuse keskmistamisega -5 mV sammimpulssile -80 mV hoidmispotentsiaalist ja sellest tuleneva voolu kõrvalekalde mõõtmisega 900 ja 1000 ms vahel pärast algust. Membraani ajakonstanti mõõdeti ühe eksponentsiaali sobitamisega algse lagunemisfaasi 90 protsendilt 10 protsendini piigist. CM arvutati, jagades membraani ajakonstandi RM.sEPSC sündmustega, mis registreeriti 1-minutise perioodi jooksul ning tuvastati ja mõõdeti Neuroexpressi (v21.1.13) abil. Paralleelseid ja ronivaid kiudude aksoneid stimuleeriti teeta-klaasist elektroodide (WPI) ja TTL-juhitava stiimuliisolaatori (ISO-Flex, AMPI) abil. Tekitatud EPSC amplituude ja vaibumisaja konstante (1 eksp. paralleelsete ja 2 eksp. ronivate kiudude puhul) analüüsiti lgorPro kohandatud rutiinide abil. Aktsioonipotentsiaale uuriti 1-sekundiliste voolusüstide komplekti osana vahemikus -500 kuni 2250 pA (250 pA sammud), mille hoidevool oli reguleeritud nii, et säiliks ~70 mV potentsiaal. Aktsioonipotentsiaali lainekujusid mõõdeti kohandatud abil

rutiinid lgorPro-s. Aktsioonipotentsiaali lävi defineeriti kui esimene membraani pinge, mille puhul esimene derivaat ületas 30 mV/ms (Zhu et al.2006).

4.6 Väikeaju atroofia uurimine

Väikeaju suurus Vahetult pärast aju eemaldamist koljust saadi dorsaalne, tervelt kinnitatud kujutis. Seejärel töödeldi pilte Fidži (NIH) abil. Eesaju ja väikeaju suurust hinnati, visandades nende 2-mõõtmelise ruumi ja arvutades seejärel pindala. Normaliseerisime aju üldise suuruse võimalike erinevuste suhtes, jagades väikeaju tulemused eesaju suurusega, et saada suhteline väikeaju ja eesaju suhe. Katsetajad olid looma genotüübi suhtes pimedad. Immunohistokeemia Vastavates uuringu lõpp-punktides (P45, 120,210,4{{7{{104}}}}0) kõikide genotüüpidega isased ja emased hiired Selles uuringus esindatud isikud anesteseeriti isofluraaniga ja läbisid transkardiaalse perfusiooni fosfaatpuhverdatud soolalahusega, millele järgnes 4% (mass/maht) puhverdatud paraformaldehüüd (PFA) ja seejärel aju eraldamiseks tükeldati. Kogu ajust tehti pildid kohe pärast aju eemaldamist koljust ja seejärel sukeldati ajud 24 tunniks 4-protsendilisesse PFA-sse ning seejärel kaitsti 72 tundi Tris-puhverdatud soolalahuses (TBS) koos 0,05-protsendilise asiidi ja 30-protsendilise sahharoosiga. tundi ja hoida kuni edasise kasutamiseni 4 kraadi juures. Väikeaju eraldati eesajust ja lõigati parasagitaalne libiseva mikrotoomi (Microm HM 430, Thermo Scientific) abil, mille paksus oli 40 μm. Väikeaju lõigud koguti kuue seeriana ja säilitati TBS-AF-is (30% sahharoosi, 0,05% naatriumasiidi ja 30% etüleenglükooliga TBS) temperatuuril 4 kraadi või -20 kraadi kuni edasise kasutamiseni. Purkinje neuronite, mõlema Atm* väikeaju lõikude immunofluorestsents visualiseerimiseks; Aptx*t ja Atm35×R35×; Aptx^(n=5 genotüübi kohta) pesti kolm korda 5 minutit TBS-is ja blokeeriti seejärel 15-protsendilises normaalses kitse seerumis toatemperatuuril 30 minutit, millele järgnes vabalt hõljuv inkubeerimine küüliku või hiire antikalbindiin D-s. -28k (1:1000) 1 tund toatemperatuuril orbitaalloksutil. Seejärel pesti sektsioone kolm korda 5 minutit TBS-ga, millele järgnes vabalt hõljuv inkubeerimine kitse küüliku- või hiirevastases Alexa Fluor 488-s (1:1000) 1 tund pimedas toatemperatuuril orbitaalloksutil. Pärast sekundaarset antikehade inkubeerimist pesti sektsioone kolm korda 5 minutit TBS-is, seejärel paigaldati ja kaeti Fluoromount-G-ga koos DAPI-ga. Mõne lõigu puhul sondeeriti täiendavalt lõhustatud kaspaas-3(1:200) ja anti-CD68(1:400) antikehi paralleelselt Calbindiniga, kasutades Alexa Fluor 647 (1:500) sekundaarset antikeha. Slaidid skaneeriti Stereo Investigatori (MBF Bioscience, versioon 2020) abil Zeissi mikroskoobiga, mis oli varustatud seadmega ApoTome 2 (Carl Zeiss Microscopy, Axio Imager.M2), kasutades kas 2,5, 10, 20, 40 või 63x objektiivi ja pilte jäädvustatud Hamamatsu CMOS-kaameraga (Hamamatsu Photonics, ORCA Flash 4.0 LT plus ). Kalbindiiniga reageerivate rakkude arvu määramiseks igas lobules saadud piltidel kasutasime Stereo Investigatorit, et joonistada juhuslikult kaks 300–500 μm pikkust joont. iga lobule ja loendati käsitsi PN-de koguarv piki koeliilu 40 um paksuses 40-kordse suurendusega. Seejärel määrati kahe proovi 2D-tihedus (PN-de arv/(lineaarpikkus*40 um paksus)). keskmistatud sagarate ja loomade edasiseks võrdlemiseks. Calbindin-positiivse PN-dendriidi laiused mõõdeti iga looma eelnevalt määratletud kohas sagaris VI 25 või 40 um paksustes koelõikudes 20-kordse suurendusega. Primaarsete ja sekundaarsete harude dendriitide laiused mõõdeti PN-rakukehade ja molekulaarkihi serva vahelisel keskjoonel. Sektsiooni kohta mõõdeti 7 kuni 13 dendriiti, üks sektsioon looma kohta. PN somaatiliste mõõtmiste jaoks kasutati Stereo Investigatorit, et juhuslikult valida PN-d, mis jaotati kogu mediaalses osas 20-kordse suurendusega. Keskmine PN laius looma kohta määrati tulemuste keskmistamisega kolme järjestikuse sektsiooni kohta (16 kuni 37 PN-i sektsiooni kohta). PN laiused mõõdeti risti PN-kihiga või väljuva dendriidiga, kui see kaldus rohkem kui mõne kraadi võrra. Molekulaarse kihi ja graanulite rakukihi (visualiseeriti vastavalt Calbindini ja DAPI plekkidega) laiust hinnati rakenduses Stereo Investigator, arvutades iga sagara jaoks etteantud kohtades kaks laiuse mõõtmist, ligikaudu poolel teel koos iga sagara pika ulatusega 2,5-kordse suurendusega. CD68 positiivsus väikeaju sektsioonides kvantifitseeriti, mõõtes CD68 kogupindala protsenti pluss positiivset värvumist kogu mediaalses väikeaju sektsioonis. 10x õmmeldud kujutised viidi negatiivse kontrollini ja kvantifitseeriti ImageJ abil, üks sektsioon looma kohta. Et kvantifitseerida lõhustatud kaspaasi -3 suhtes positiivsete Calbindin-positiivsete PN-de protsenti, loendasime Stereo Investigatori abil PN-id kogu väikeajus. Iga looma kohta uuriti kolme 20-kordse suurendusega õmmeldud pilti ja tulemused keskmistati. Kaspaas{96}}-positiivsuse lävi määrati kontrollsektsioonide põhjal, mis olid värvitud ainult sekundaarsete antikehadega. Mittefluorestseeruva histoloogilise analüüsi jaoks asetage 25-um paksused vabalt ujuvad koelõigud positiivselt laetud objektiklaasidele ja kuivatage õhu käes üleöö. Kude pesti fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS) kaks korda 5 minutit, seejärel värviti umbes 25 sekundit järjestikku 0,1% hematoksüliiniga 95% etanoolis ja 0,5% eosiiniga 95% etanoolis umbes 3 sekundit ning pärast seda pesti topeltdestilleeritud veega. iga plekk. Seejärel dehüdreeriti kudet 1 minut 95-protsendilise etanooli, 100-protsendilise etanooli ja 100-protsendilise ksüleeniga pesuvees, seejärel kaeti katteklaas Permountiga. Slaidid pildistati värvikaameraga (Q Imaging, MBF Biosciences) sama Zeissi mikroskoobi ja MBF-i hankimise tarkvaraga. Eksperimenteerijad pimestati hiire genotüübi suhtes, milles sektsioone uuriti, ja kõigi histoloogiliste mõõtmiste jaoks jäeti uurimise järjekord vahele.

4.7 Voolutsütomeetria mõõtmised

Vere ja harknääre rakkude voolutsütomeetria analüüs viidi läbi spetsiifiliste hiirevastaste antikehadega CD4, CD8, CD3, CD44 ja CD25 värvimisega. Lühidalt, täisvereproovid (50 μ) värviti fluorestsentsmärgistatud antikehadega, seejärel lüüsiti punased verelibled BD lüüsimislahusega, elusad valged verelibled värviti elujõulisuse värviga. Tüümi eraldati mehaaniliselt. 1 kuni 2 miljonit harknääre rakku värviti sarnaselt, kasutades CD4, CD8, CD44 ja CD25 spetsiifilisi antikehi. Immuunvärviga valgete vereliblede või harknääre proovide analüüs viidi läbi FACS ARIA l abil ja andmeid analüüsiti FlowJo tarkvara abil, nagu varem teatatud (Sanghez et al. 2017).

4.8 Lääne BIots

Valguekstraktid (rakud/koed) homogeniseeriti radioimmunosadestamise testi (RIPA) lüüsipuhvris (150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40 [NP-40],0 0,5 protsenti deoksükolaati, 0,1 protsenti SDS, 50 mM Tris, pH 8,0) koos proteaasi inhibiitoritega (10 ug/ml AEBSF, 10 ug/ml leupeptiin, 5 ug/ml pepstatiin, 5 ug/ml kümotrüpsiin, 10 ug/ml aprotiniini). Valguekstrakte töödeldi ultraheliga ja seejärel granuleeriti tsentrifuugimisega 13, 000 pööret minutis 15 minutit temperatuuril 4 °C. Valgu kontsentratsioonide kvantifitseerimiseks kasutati BCA valgu testi. Proovid, mis sisaldasid võrdsetes kogustes valku 50 kuni 100 ug raja kohta, eraldati, kasutades 4 kuni 12% gradiendiga TGX eelvalmistatud geele BioRad, seejärel kanti TransBlot Semi-Dry BioRad süsteemiga, kasutades nitrotselluloosi ülekandepakki. Ülekantud blotid värviti Ponceau S peitsiga, et tagada valgu võrdne laadimine, seejärel pesti ja blokeeriti 5% rasvavaba kuiva piimaga TBST-s 60 minutit toatemperatuuril. Primaarseid antikehi inkubeeriti loksutades öö läbi 4 kraadi juures. Blotte analüüsiti järgmiste antikehade suhtes: ATM (D2E2) küüliku mAb rakkude signaalimine, lahjenduses 1:1000, -aktiini (D6A8) küüliku mAb raku signaalimine, GAPDH (D16H11) küüliku mAb raku signaalimine, millele järgneb sobiv hoburadiseeritud peroksidaas HRP) sekundaarne küülikuvastane, hiirevastane 2 tundi toatemperatuuril. Pärast mitut pesemist TBST-ga tuvastati valgu ekspressioon Radiance Plusi kemoluminestsentssubstraadiga, kasutades Azure c400 ja BioRad ChemiDoc pildisüsteeme. ATM-i densitomeetriline analüüs viidi läbi ImageJ abil. Katsed viidi läbi kahe tehnilise ja 2-3 bioloogilise kordusega, nagu näidatud.

4.9 Statistiline hinnang

Iga rühma jaoks valitud loomade arv põhines a priori võimsusanalüüsidel, kasutades GPower v3.1 suurust 0,5, võimsust 0,8 ja esialgsete andmete põhjal hinnatud efektide suurust. või eelnevad õpingud. Kasutasime nii parameetrilisi (1-ja 2-viisi ANOVA) normaaljaotusega kui ka mitteparameetriliste (Kruskal Wallace) statistiliste meetodite jaoks intervallandmete jaoks, et testida rühmadevahelisi erinevusi, millele järgnesid paarikaupa mitme võrdluse testid, nagu näidatud teksti. Immuunandmete kõrvalekalded joonistel fig. 6 ja 7 jäeti välja ROUT-meetodi abil (Q=2 protsenti). Iga andmestiku jaoks kasutatud spetsiifilised analüüsid on märgitud iga joonise legendis. Kõikide arvude puhul: ns ei ole oluline,*p Väiksem või võrdne 0,05,** p<0.01,***><0.001,****><0.0001. data="" are="" reported="" as="" mean="" ±="" sem="" and="" box="" and="" whisker="" plots="" indicate="" the="" minimum,="" first="" quartile,="" median,="" third="" quartile,="" and="" maximum="" data="" values.="" all="" figures="" and="" statistical="" analyses="" were="" completed="" using="" excel="" (microsoft="" 360)="" or="" prism="" v8="" and="" 9="">