Neerule suunatud nanoosakesed neerude lümfisüsteemi tiheduse suurendamiseks alandab hüpertensiivsetel hiirtel vererõhku
Nov 10, 2023
Abstraktne:Krooniline interstitsiaalne põletikja aktiveeritud immuunrakkude infiltratsioon neerudes mängib hüpertensioonis lahutamatut rolli. Lümfisüsteemid reguleerivad põletikku läbiimmuunrakkude puhastamineja liigne interstitsiaalne vedelik. Varem demonstreerisimesuurendades neerude lümfangiogeneesihoiab ära hüpertensiooni hiirtel. Me oletasime, et vaskulaarse endoteeli kasvufaktori C (VEGF-C) sihipärane nanoosakeste kohaletoimetamine neeru indutseerib neerude lümfangiogeneesi, alandades hüpertensiivsetel hiirtel vererõhku. Neerule suunatud nanoosakesse laaditi VEGF-i retseptori -3-spetsiifiline VEGF-C vorm ja süstiti iga 3 päeva järel hiirtele, kellel oli angiotensiin II-indutseeritud hüpertensioon või LNAME-indutseeritud hüpertensioon. Nanoosakestega töödeldud hiirtel oli suurenenud neerude lümfisoonte tihedus ja laius võrreldes hüpertensiivsete hiirtega, kellele süstiti ainult VEGF-C. Nanoosakestega töödeldud hiirtel vähenes süstoolne vererõhk, langespõletikuvastased neeru immuunrakudja naatriumi suurenenud fraktsionaalne eritumine uriiniga. Meie leiud näitavad, et farmakoloogiliselt laienevad neerude lümfisüsteemid alandavad vererõhku ja on seotud soodsate muutusteganeeru immuunrakudjasuurenenud naatriumi eritumine.
Märksõnad:neerud; lümfisüsteemid;põletik; puutumatus; hüpertensioon
HANKIGE TAIMSETE VALMISTID CISTANŠI NEERUDELE
1. Sissejuhatus
Peaaegu 1 kahest USA täiskasvanust põeb hüpertensiooni ja paljudel patsientidel on see kontrollimatu [1]. Vaatamata paranenud haridusele, rahvatervise jõupingutustele ja ettenähtud ravimitele ei suuda umbes 30–60% hüpertensiivsetest patsientidest saavutada ideaalset vererõhku. See on kahetsusväärne, kuna süstoolse vererõhu langus isegi 10 mmHg võrra vähendab oluliselt terviseriske ja parandab tulemusi [2]. Vaja on täiendavaid ravivõimalusi, et aidata sellel hüpertensiivsel populatsioonil vererõhku alandada, ideaaljuhul normotensiivsesse vahemikku.
Neerude immuunrakkude infiltratsioon, põletik ja naatriumipeetus on tugevalt seotud hüpertensiooniga [3–5]. Lümfisooned transpordivad vedelikku, elektrolüüte, rakke ja valke interstitsiaalsest ruumist dreneerivasse lümfisõlme ja seejärel tagasi vereringesse [6, 7]. Põletikuga seotud lümfangiogeneesi täheldatakse ägeda neerukahjustuse korral jakroonilised põletikulised haigusednagu näiteksdiabeetiline nefropaatiajaneerukartsinoom[8]. Aastal anpõletikuline seisund, lümfiringe suurenemine aitab kaasa immuunrakkude, valkude ja vedeliku eemaldamisele elundist. Oleme varem teatanud, et lümfangiogenees esineb ka neerudes kompenseeriva vastusena erinevates hüpertensioonimudelites [9–11]. See kompenseeriv neerude lümfiringe suurenemine ei olnud aga piisav põletiku ja hüpertensiooni lahendamiseks. Geneetiliselt indutseeriv neeruspetsiifiline lümfangiogenees hiirtel hoidis ära soolatundliku hüpertensiooni, lämmastikoksiidi inhibeerimise (L-NAME) indutseeritud hüpertensiooni (LHTN) ja angiotensiin II indutseeritud hüpertensiooni (A2HTN) teket ning see oli seotud immuunrakkude akumuleerumine neerudes ja suurenenud naatriumi eritumine [9,11,12]. Lisaks nõrgendas neeruspetsiifilise lümfangiogeneesi geneetiline indutseerimine hiirtel olemasolevat LHTN-i ja sellega kaasnes naatriumi eritumise suurenemine [12].
Siin soovisime välja töötada potentsiaalse translatsiooniravi, mis oleks suunatud konkreetselt neerudele ja soodustaks lümfangiogeneesi, et vähendada vererõhku hüpertensiivsetes tingimustes. Kasutasime nanoosakeste tehnoloogiat lümfispetsiifilise kasvufaktori kohaletoimetamiseks, tuginedes varasematele aruannetele neeru sihtivate nanoosakeste kohta [13–15]. Olemas on ka teisi nanoosakesi kasutavaid ravimite kohaletoimetamissüsteeme ja need kõik on mõeldud tõhususe, spetsiifilisuse ja biosaadavuse parandamiseks. Nanoosakesi saab kujundada nii, et neil on ainulaadsed füüsikalis-keemilised omadused, nagu suurus (50–200 nm), kuju ja pinnakeemia, ning neid saab varustada kandma ühte või mitut diagnostilist ja/või raviainet, vabastades need väliste päästikute, näiteks temperatuuri kaudu. , pH ja ensüümid. Samuti võimaldab nende terapeutiliste või diagnostiliste ainete kapseldamine nanoosakestesse suurendada nende süsteemset poolestusaega ja seega saab neid sihtpiirkonda oluliselt lokaliseerida. Praegu on nende morfoloogia põhjal mitmesuguseid nanoosakesi, sealhulgas mitsellid, liposoomid, nanosfäärid, nanotorud, nanokapslid, kubosoomid ja hüdrogeelid. Siin testisime nii mitselle kui ka liposoomi nanoosakesi, et teha kindlaks, milline neist oli tõhusam.
Meie hüpotees oli, et neerudele suunatud nanoosake, mis edastab pro-lümfangiogeenset kasvufaktorit, vaskulaarse endoteeli kasvufaktori retseptori-3 (VEGFR-3) spetsiifilist isovorm vaskulaarse endoteeli kasvufaktori C (VEGF-C) , suurendaks neerude lümfisüsteemi tihedust ja alandaks vererõhku A2HTN-i või LHTN-iga isastel ja emastel hiirtel. Samuti oletasime, et vererõhu langust seostatakse põletikueelsete neerude immuunrakkude arvu vähenemise, põletikuvastaste neerude immuunrakkude arvu suurenemise ja naatriumi eritumise suurenemisega. Kuna soolatundliku hüpertensiooni esilekutsumiseks kulus pikk aeg ja sabaveeni süstide arv hiirtel oli piiratud, ei kasutatud seda mudelit käesolevas uuringus.
2. Materjalid ja meetodid
2.1. Nanoosakeste arendamine ja iseloomustamine
PLGA-PEG-folaadi plokk-kopolümeer osteti ettevõttest PolySciTech (West Lafayette, IN, USA) ja analüüsisertifikaati, mis näitab NMR-i, FTIR-analüüsi ja GPC-d, on näha joonisel S1. Kasutades 50 mg PLGA-PEG-folaadi plokk-kopolümeeri, 10 mg värvainet Coumarin 6, 10 mg FITC-ovalbumiini või 1 mg VEGF-C kapseldati nanoosakestesse, kasutades mitselli valmistamiseks dialüüsimeetodit. nanoosake 1 (NP1). Täpsemalt lahustati ravim ja polümeer dimetüülsulfoksiidis (DMSO) ja lahus kanti dialüüsimembraanile (MWCO 100, 000). Dialüüsi viidi läbi 24 tundi DI vee vastu. Seejärel tsentrifuugiti osakeste vesilahust ja töödeldi osakeste kontsentreerimiseks ultraheliga. Liposomaalse nanoosakese valmistamiseks kasutasime mitmeid lipiidkomponente, sealhulgas DSPC (120 mg), kolesterool (16 mg), DSPE-PEG-folaat (24 mg) ja värvaine Coumarin 6 (10 mg) või FITC-ovalbumiin (10 mg) . Esiteks lahustati kõik ülaltoodud komponendid DCM-is (10 ml) ja seejärel eemaldati DCM läbi õhuvoolu, et moodustada klaasviaalide pinnale õhuke kile. Järgmisena lisati õhukesele kilele 10 ml PBS-i, et saada liposomaalne nanoosake 2 (NP2). Nanoosakeste suurus määrati dünaamilise valguse hajumise (DLS) abil, kasutades Zetasizerit (Malvern Panalytical, Malvern, UK). Proovi kontsentratsiooni hoiti 0,5 mg/ml. Kumariin 6 värvi kapseldatud kogus saadi selle neeldumise mõõtmisest, lahustades 100 µL nanoosakesi 900 µL DMSO-s, mis vabastas kumariin 6 DMSO lahusesse.
Seejärel mõõdeti neeldumine 444 nm juures. Kasutades kumariin 6 neeldumise eelnevalt mõõdetud kalibreerimiskõverat vastavalt selle tiitritud kontsentratsioonile, arvutati kapseldatud kumariin 6 kontsentratsioon (NP1: 5 ± 0,35 mg ja NP2: 4 ± {{10). }},89 mg kumariin 6). Kasutades FITC-ovalbumiini neeldumise eelnevalt mõõdetud kalibreerimiskõverat vastavalt selle tiitritud kontsentratsioonile, arvutati kapseldatud FITC-ovalbumiini kontsentratsioon (4 ± 0,51 mg). VEGF-C kapseldatud kogus NP-s määrati ELISA abil ja see oli ~500 ± 17 ug. Kõik NP-d olid kaetud folaatidega, mis suunavad need neeru proksimaalsetesse tuubulitesse, arvestades folaadiretseptorite kõrget ekspressiooni. NP-koostu skeemi võib näha joonisel S2
Kumariin 6 või FITC-ovalbumiini vabanemisprofiile uuriti membraantoru dialüüsi meetodil. Üks ml nanoosakeste lahust lisati dialüüsiklaasi (Cutoff MW 3500) ja seejärel sukeldati 10 ml PBS-i, mis sisaldas 0,5 mahuprotsenti Tween 80 lahust. Antud ajal koguti ja asendati meediat. Kogutud proovide fluorestsentsi intensiivsust mõõdeti FITC-ovalbumiini puhul Ex/Em=444/500 nm (kumariin 6) või Ex/Em=488/530 nm, kasutades mikroplaadilugejat. Nii kumariin 6 kui ka FITC-ovalbumiini kumulatiivne vabanemisprotsent folaadi nanoosakestest on näha joonisel S3.
Läbilaskeelektronmikroskoopia (TEM, JEOL JEM-2010, Jaapan) uuringu jaoks tilgutati proovisuspensioonid süsinikuga kaetud vaskvõrele ja kuivatati vaakumi tingimustes. Seejärel vaadeldi võrku JEOL-i ülekandeelektronmikroskoobi all kiirenduspingel 200 kV. In vivo biojaotumise määramiseks süstiti emastele C57BL/6J hiirtele (n=3) läbi sabaveeni 100 µl igat NP1 (10 mg/ml) või NP2 (10 mg/ml). Kumariini 6 fluorestsentssignaalid registreeriti lainepikkusel Ex/Em=444/500 nm. Kaksteist tundi pärast süstimist loomad surmati ja iga organ koguti. Kogutud elundeid skaneeriti In Vivo FX Pro skanneri all, et kvantifitseerida NP jaotust. Kõik hiirtel tehtud protseduurid kiitis heaks Texas A&M University IACUC vastavalt NIH laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhendile.
2.2. Hiired
Metsiktüüpi C57BL/6J hiired osteti firmast Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA). Isased ja emased hiired vanuses 10–14 nädalat implanteeriti kirurgiliselt inhaleeritava isofluraani (1,5–5%) anesteesia all osmootsete minipumpadega (Alzet, mudel 1004, Cupertino, CA, USA), mis sisaldasid angiotensiin II (490) ng/kg/min; BACHEM, Torrance, CA, USA) (A2HTN), millele järgnes paikne lidokaiin. Teisele isaste ja emaste hiirte rühmale manustati kogu katse (LHTN) joogivees (0,5 mg/ml) L-NAME (Sigma, St. Louis, MO, USA). 2 päeva pärast kinnitati hüpertensioon kõigis rühmades sabamanseti vererõhu kaudu. Seejärel hiired randomiseeriti ja neile süstiti sabaveeni kas mitsellaarset nanoosakest, mis oli laetud VEGFR{16}}spetsiifilise VEGF-C mutandiga (VEGF C c156s) [16] või ainult vaba VEGF-C valku iga 3 päeva järel. 16 päeva (kokku 4 sabaveeni süsti). See süstimisskeem koostati eelmise töö põhjal [17] ja see võimaldas piisavalt aega veresoonte ümberkujundamiseks tasemel, mis on piisav vererõhu mõjutamiseks. Lisaks pikendas 3-päevane puhkeperiood hiire haprade sabaveenide eluiga, säilitades samal ajal pro-lümfangiogeense signaali. Isegi taastumisperioodil suutsid sabaveenid toime tulla vaid 5 süstiga, enne kui nad said pöördumatuid kahjustusi. Kõik hiired surmati 16 päeva pärast esialgset süstimist. Hiired surmati kudede perfusiooniga sügava isofluraananesteesia all ja seejärel emakakaela nihestus enne kudede kogumist. Kõik hiirtel tehtud protseduurid kiitis heaks Texas A&M University IACUC vastavalt NIH laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhendile.
2.3. Vererõhk
Süstoolse vererõhu (SBP) näidud võeti erinevatel ajahetkedel sabamanseti kaudu. Kõigi mõõtmiste jaoks kasutati hiirte mitteinvasiivset vererõhu mõõtmise süsteemi IITC Life Science (IITC Inc., Woodland Hills, CA, USA). Vererõhku mõõdeti pärast 30-minutilist aklimatiseerumisperioodi vaikses kohas. Selle aja jooksul lasti soojenduskambril ja tõkestuskambritel soojeneda temperatuurini 34 ◦C. Hiired laaditi õrnalt sobiva suurusega turvakambritesse ja jäeti enne SBP mõõtmist 5 minutiks soojenduskambrisse aklimatiseeruma. SBP mõõtmised tuletasid kahe sõltumatu pimestatud uurija rõhujälgimistest.
2.4. Seerumi ja uriini kogumine ja mõõtmine
Seerumi ja uriini kogumine ja mõõtmine: Hiired pandi metaboolsetesse puuridesse (Hatteras, Cary, NC, USA) ja lasti üleöö aklimatiseeruda. Pärast aklimatiseerumist koguti uriini 24 tundi, mis lõppes eutanaasiaga. Kogutud uriin mõõdeti. Veri koguti eutaniseerimisel vasaku vatsakese kaudu ja seerum eraldati hilisemate mõõtmiste jaoks. Seerumit ja uriini analüüsiti naatriumi kapillaarelektroforeesiga, kasutades DxC 700 AU keemiaanalüsaatorit (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) ja kreatiniini otsese potentsiomeetriaga, kasutades P/ACE MDQ Plus kapillaarelektroforeesisüsteemi (Sciex, Redwood City, CA). , USA). Neid mõõte kasutati uriiniga eritumise, naatriumi fraktsionaalse eritumise (FENa) ja kreatiniini kliirensi arvutamiseks.
2.5. Immunofluorestsents
Eutaniseerimisel koguti neerud, lõigati sagitaalselt pooleks ja fikseeriti 10% puhverdatud formaliini lahuses (Sigma, St. Louis, MO, USA) 48 tundi. Pärast fikseerimist pesti neerupooli 100% etanoolis ja sisestati parafiini. Neerupooled lõigati 5–7 µm osadeks, mis deparafineeriti, rehüdreeriti ja permeabiliseeriti 0, 1% Tritoni lahusega (BioRad, Hercules, CA, USA). Koe blokeeriti 10% AquaBlocki lahusega (EastCoastBio, North Berwick, ME, USA), enne kui see immunomärgistati üleöö lümfisüsteemi endoteelirakkude markeritega LYVE-1 või podoplaniiniga (kitse polüklonaalne; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). inkubeerimine temperatuuril 4 ◦C. Lümfisoonte visualiseerimiseks kasutati Alexafluor 488 või 594 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) sekundaarseid antikehi. Proove inkubeeriti sobivalt konjugeeritud sekundaarsete antikehadega tund aega toatemperatuuril. Negatiivseid kontrolle inkubeeriti ainult sekundaarse antikehaga. Kõik märgistatud slaidid paigaldati DAPI-d sisaldava ProLong Gold pleekimisvastase reagendiga (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Pildistamiseks kasutati Olympus Q5 kaameraga fluorestsentsmikroskoopia süsteemi Olympus BX51. Pildid jäädvustati 40-kordse suurendusega, kasutades Olympus CellSensi pildindustarkvara (Olympus, Shinjuku, Tokyo, Jaapan). Samu meetodeid kasutati lümfiteede pildistamiseks südames, maksas, kopsus ja nahas (10× või 20× suurendus).
2.6. Neerude immunofluorestsents
Kvantifitseerimine Igast neeruosast koguti 5–7 pilti 20-kordselt eelnevalt kindlaksmääratud piirkondadest, vältides üldiselt koe defekte, väiksemaid tuppkesi ja suurt hulka glomeruleid. ImageJ-d kasutati alaväärtuste kogumiseks, mis mõõdeti podoplaniini + pikslite koguarvu pärast positiivse endoteeli läve seadmist.
2.7. Neerude lümfisoonte maksimaalse laiuse kvantifitseerimine
Igast neeruosast koguti kujutised kõigist arteritega seotud lümfisoontest ajukoores 20x. Lümfisooned tuvastati podoplaniini värvimise järgi. ImageJ-d kasutati kõigi valendikku sisaldavate lümfisoonte kõige laiema punkti pikkuse pikslites kogumiseks.
2.8. Voolutsütomeetria
Eutaniseerimisel koguti neerud ja kapslid eemaldati. Kude peenestati põhjalikult ja digereeriti puhvris, mis sisaldas kollagenaas D (2,5 mg/ml, Roche Sigma, St. Louis, MO, USA) ja Dispase II (1 mg/ml, Sigma) temperatuuril 37 °C 1 tund. Seeditud proovid filtreeriti ja loputati läbi 100 ja 40 µm kurnade. Läbivool tsentrifuugiti rakuliste komponentide eraldamiseks ja punased verelibled lüüsiti NH4Cl/EDTA-s. Splenotsüüdid isoleeriti sarnaselt, et kasutada neid antikehade kontrollidena ja immuunrakkude suuruse ja kuju päri- ja külghajumise väravaks. Neerurakud resuspendeeriti 0,1% FBS lahuses. Mittespetsiifilise Fc seondumise vältimiseks inkubeeriti proove hiire CD16/CD32 vastase antikehaga (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) 10 minutit jääl. Seejärel inkubeeriti rakke fluorestsents-konjugeeritud antikehadega CD45, F4/80, CD11c ja CD3e vastu ning filtreeriti läbi teise steriilse 40 µm kurna. Kõik antikehad osteti ettevõttelt BD Biosciences. Kirjeldava paneeli kohta vaadake võrgutabelit S1. Omandamiseks kasutati BD LSR Fortessa X{23}} voolutsütomeetrit koos FACS DIVA tarkvaraga (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Kuni 500 000 rakust koosnevaid populatsioone analüüsiti FlowJo versiooniga 10.6.2.1 (FlowJo, LLC, Ashland, OR, USA). CD3e+ populatsioonid kvantifitseeriti CD45+ värava piires. CD3e PacBlue+ populatsioonid olid fluorofooride PE ja PerCP-Cy5.5 suhtes negatiivsed. F4/80+ ja CD11c+ populatsioonid kvantifitseeriti CD45+/CD3e-väravas (joonis S4). Need populatsioonid olid PacBlue, APC ja APC-Cy7 fluorofooride suhtes negatiivsed. Tulemused on väljendatud protsendina CD45+ rakkude koguarvust neeru kohta. Väramisstrateegia leiate jooniselt S4. Teave antikehade kohta on esitatud tabelis S1.
2.9. Statistika
Tulemused on esitatud punktigraafikute ja keskmiste või keskmiste ± SEM kujul. Kahe rühma erinevusi hinnati 2-sabaga paaritu Studenti t-testiga ja kolme või enama rühma vahel ühesuunalise ANOVA-ga, millele järgnes Student-Newman-Keulsi post hoc test. Kõigi võrdluste olulisuse tasemeks määrati 0,05. Kõik statistilised analüüsid viidi läbi tarkvara SigmaPlot 10 abil (Systat, San Jose, CA, USA).
Wecistanche'i tugiteenus - Hiina suurim tsistanšeksportija:
E-post:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Lisateabe saamiseks ostke:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
