Kahevalentne nõrgestatud gripiviiruse elusvaktsiin kaitseb sigade H1N2 ja H3N2 kliiniliste isolaatide eest, 1. osa

Abstraktne:

A-gripiviirused (IAV) võivad paljude imetajaliikide jaoks põhjustada väga nakkavat hingamisteede haigust. Sigadel põhjustavad IAV-d vastuvõtlikes populatsioonides kõrge haigestumuse ja madala suremusega haigusi, millel võib olla märkimisväärne finants- ja tootmismõju. Need võivad pakkuda ka võimalusi mutatsioonideks ja geenide ümbersorteerimiseks, tekitades pandeemiapotentsiaaliga gripitüvesid.

A-gripp on väga nakkav hingamisteede haigus, mis kujutab tõsist ohtu ülemaailmsele rahvatervisele. Immuunsusega seotud uuringud on näidanud, et tugev immuunsüsteem võib aidata inimestel gripiviirusega nakatunud viirusega paremini võidelda, vähendades seeläbi haiguse esinemissagedust ja raskusastet.

Immuunsus on meie immuunsüsteemi võime haigustega võidelda. Inimese immuunsüsteem koosneb kahest osast: kaasasündinud immuunsus ja omandatud immuunsus. Kaasasündinud immuunsüsteem on see, millega me sünnime ja sellel on kogu keha võime haiguste eest kaitsta. Omandatud immuunsüsteem on immuunsus, mis meie elus järk-järgult tekib, sealhulgas peamiselt immuunrakkudest ja antikehadest koosnev humoraalne immuunsus ning T-rakkudest ja immuunrakkudest koosnev rakuline immuunsus.

Uuringud on näidanud, et järgides tervislikku eluviisi ja toitumist, tehes trenni ning saades piisavalt vitamiine ja muid toitaineid, saate parandada oma immuunsüsteemi. Lisaks võib vaktsiin tugevdada ka organismi immuunsust gripiviiruste suhtes ja vähendada haigestumist.

A-gripiviirust jagavad inimesed ja loomad, mistõttu nad sageli muteeruvad. Eriti sügisel ja talvel on inimeste immuunsus madal ning seda võimalust ära kasutades võib A-gripiviirus kergesti rünnata. Kui aga nõuame tervisliku eluviisi arendamist, treeningu tugevdamist ja aktiivset vaktsineerimist, saame parandada oma immuunsust ja paremini toime tulla A-gripiviiruse invasiooniga. Lisaks, kui leiate, et teil on gripilaadsed sümptomid, peaksite pöörduma arsti poole ja saama õigeaegselt ravi, et teie keha saaks kiiresti taastuda.

Lühidalt öeldes on A-gripiviiruse ja immuunsuse vahel vastastikune mõju. Immuunsuse tugevdamine, tervisliku eluviisi ja toitumise säilitamine ning eriti vaktsineerimisega nõustumine on kõik tõhusad meetmed A-gripiviiruse ennetamiseks ja selle vastu võitlemiseks. Olgem positiivsed ja liikugem A-gripiviiruse ennetamise mõttes tervislikuma eluviisi poole! On näha, et peame immuunsust parandama. Tistanche võib oluliselt parandada immuunsust, sest lihatuhk sisaldab mitmesuguseid bioloogiliselt aktiivseid koostisosi, nagu polüsahhariide, kaks seeni, Huang Li jne. Need koostisained võivad stimuleerida erinevaid immuunsüsteeme. rakulaadsed rakud, suurendades nende immuunaktiivsust.

Click cistanche tubulosa eelised

Seetõttu on väga oluline ennetada ja kontrollida sigade grippi nakatumist ning peamine viis seda teha on vaktsineerimine. Sigade seas maailmas kõige levinumad IAV alatüübid on H1N1, H1N2 ja H3N2; nende viiruste geneetiline mitmekesisus võib aga piirkonniti suuresti erineda. Varem töötasime välja elastaasist sõltuva bivalentse nõrgestatud elusvaktsiini, kasutades kahte Kanada sigade gripi A viiruse (swIAV) isolaati A/Swine/Alberta/SD0191/2016 (H1N2) [SD191] ja A/Swine/Saskatchewan/SD0069/SD1569/202. ) [SD69], mis kaitses homoloogsete tüvede eest.

Selles uuringus demonstreerime, et see vaktsiin laiendab sigade kaitset praegustele, triivitud mittehomoloogsetele H1N2 ja H3N2 tüvedele, A/Swine/MB/SD0467/2019 (H1N2) [SD467] ja A/Swine/AB/SD0435/ 2019 (H3N2) [SD435].

Vaktsiin kutsus esile tugeva immuunvastuse seerumis ja kopsudes ning vähendas viiruse replikatsiooni ning nende tüvedega seotud kopsupatoloogiat. Seetõttu on see kahevalentne vaktsiin endiselt tugev kandidaat, mis oleks kasulik seagripi vaktsiinide turule Põhja-Ameerikas.

Märksõnad:

gripp; vaktsiin; siga.

1. Sissejuhatus

A-gripiviirused (IAV) on paljude liikide, sealhulgas sigade jaoks oluline patogeen. Nakatumine võib sigadel põhjustada väga nakkavaid hingamisteede haigusi [1]. Sigade gripiinfektsioon põhjustab kerget haigust, mille suremus on väga madal, kuid haigestumuse määr karjas võib ulatuda 100 protsendini [2]. See toob kaasa majanduskahju põllumeestele, kuna nakatunud sigade vähenenud kaalutõus, vähenenud tootmisvõimsus ja emiste reproduktiivsus [3,4].

Gripi kaasnakkus teiste sigade hingamisteede patogeenidega võib samuti viia sigade hingamisteede haiguste kompleksi väljakujunemiseni ja selle tulemusena suurendada suremust ja majanduslikku kahju [5].
Lisaks on sead vastuvõtlikud lindude ja inimeste IAV-ga ning sigade IAV-ga (swIAV) nakatumisele, kuna nende hingamisteedes on nii lindude kui ka imetajate siaalhappegalaktoosi sidemeid [6]. See võimaldab mitme tüvega samaaegselt nakatumisel toimuda ümbersortimist, mis võib viia uute pandeemiapotentsiaaliga tüvede tekkeni [4,7].

Kuna inimestel on siaalhappe galaktoosi sideme jaotus kogu hingamisteedes sarnane, on inimeste ja sigade vahel võimalik kahesuunaline ülekandumine. Esimene teadaolev esinemine oli 1918. aasta gripipandeemia ajal, kui inimestelt toodi sigadele IAV [8]. See põlvnemine püsis sigade populatsioonides stabiilsena kuni 1990. aastateni, mil inimeste ja lindude H3N2 tüved assorteeriti ümber ringleva H1N1 liiniga, et saada kahe- ja kolmekordsed reassortantsed H1N1, H1N2 ja H3N2 alatüüpide tüved [8, 9].

Äsja välja töötatud kolmekordse reassortantsgeeni (TRIG) kassett viis Põhja-Ameerika sigadel IAV kiire mitmekesistumise perioodi [10]. See TRIG-kassett on väga stabiilne ja hõlbustab erinevate HA ja NA kombinatsioonide asendamist [5]. Alates 2005. aastast on paljud selle sisemise TRIG-kassetiga ja inimese HA- ja NA-geenidega seotud tüved levinud USA-s seakarjadesse [9].

Järgmine märkimisväärne ülekandumine toimus 2009. aastal, kui sigade päritolu H1N1 tüvi (H1N1pdm2009) levis inimestele, põhjustades 2009. aasta gripipandeemia [11]. Inimese pandeemilise H1N1 IAV (H1pdm) ülekandumine inimeselt sigadele (pöördzoonoos) registreeriti Põhja-Ameerika sigadel mitu korda, mis viis uue sugupuu ja uute reassortantsete swIAV-de loomiseni [8, 10, 12].

Kokku on Põhja-Ameerika sigadel registreeritud seitse antigeenselt erinevat H1-klaadi ja neli erinevat H3-viiruste klade [5]. Hiljuti tuvastas Aasias swIAV seireprogramm domineeriva Euraasia linnulaadse (EA) reassortantse genotüübi 4 (G4) viiruse, millel on H1pdm ja kolmekordsed reassortantsed sisemised geenid.

Seda G4 viirust mõõdeti 10,4 protsendil testitud sigade töötajatest ja sellel on pandeemiapotentsiaali markerid, mis võivad inimestele edasi kanduda ja millel on praegu ringlevatest inimviirustest erinev antigeensus [7]. Seetõttu on väga oluline ennetada ja kontrollida sigade grippi nakatumist nii seatööstuse kui ka rahvatervise seisukohast ning peamine viis seda teha on vaktsineerimine [4].

USA-s on kõige levinum vaktsiinitüüp inaktiveeritud terve viirus (WIV), kuid heaks kiideti ka HA-d ekspresseeriv RNA vektorvaktsiin ja NS{0}}kärbitud elus nõrgestatud gripiviiruse vaktsiin (LAIV) [4] . Sigade seas kogu maailmas, sealhulgas Põhja-Ameerikas, kõige levinumad IAV alatüübid on H1N1, H1N2 ja H3N2 [13].

Nende viiruste geneetiline mitmekesisus võib piirkonniti siiski väga erineda ning Kanadas ja USA-s on swIAV-i geneetilises arengus erinevusi, eriti H1-alatüübi viiruste puhul [12]. Kanadas aastatel 2009–2016 tehtud seire näitas, et USA-s domineerivaid H1 geneetilisi klaade H1g (1A.3.3.3) ja H1d-1 (1B.2.2) Kanadas ei tuvastatud ning H1 viirused Kanadas erinesid USA omadest tugevalt [12].

Kanadas tuvastati uus H1-klaad (H1a-3), mis sai alguse Manitobast ja läbis kiire kasvu, enne kui levis üle kogu riigi ja USA-sse. Mis puutub H3 viirustesse, siis Ameerika sigadel dokumenteeriti kuus H3 liini (IV-A kuni IV-F) ja neist kolm leiti Kanada sigadelt (IV-B, IV-C ja IV-E) [12] ].

See rõhutab piirkondliku järelevalve ja ringlevate tüvede teadlikkuse tähtsust tõhusate vaktsiiniprogrammide teavitamisel ning näitab, et Ameerika sigadel ringlevatel IAV-l põhinevad vaktsiinid ei pruugi Kanada sigu kaitsta [12].

Varem loodi kahevalentne vaktsiin, kasutades kahte Kanada swIAV isolaati, A/ Swine/Alberta/SD0191/2016 (H1N2) [SD191] ja A/Swine/Saskatchewan/SD0069/2015 (H3N2), mis on H{{ esindajad. 9}} antigeenne rühm ja uus H3 antigeenne rühm Lääne-Kanadast (sigade klaster IV-E) [14]. See uudne vaktsiin on nõrgestatud elusviiruse vaktsiin, mis on valmistatud elastaasist sõltuvate vormide SD191 ja SD69, SD191−R342V ja SD69-K345V abil. Uuringud näitasid, et see kaitses nii SD191 kui ka SD69, aga ka heteroloogse H1N2 tüve A/Swine/Saskatchewan/SD0142/2015 (H1N2) eest, mis samuti eraldati Lääne-Kanadast [14].

Sellest ajast alates on ringlevad swIAV-tüved jätkanud triivimist. Lääne-Kanada sigade hiljutised kliinilised isolaadid koguti ja eraldati väliproovidest Saskatchewani ülikooli Lääne veterinaarmeditsiini kolledžis, Saskatoonis, SK, Kanadas. A/Swine/MB/SD0467/ 2019 (H1N2) [SD467] on H -3 antigeense rühma liige, kuid sellel on viis aminohappe asendust 54 peamisest H1 antigeensest saidist, võrreldes SD191-ga [10,15, 16].

A/Swine/AB/SD0435/2019 (H3N2) [SD435] on IV-E klastri liige, kuid on triivinud, hõlmates kuuest peamisest H3 antigeensest saidist kahte aminohappe asendust [17].

Selles uuringus hindasime, kas kahevalentne elastaasist sõltuv LAIV peab vastu uutele kliinilistele isolaatidele, ja võime teatada, et see kaitses sigu, kui neid nakatada praegu ringlevate swIAV tüvedega SD467 (H1N2) ja SD435 (H3N2).

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Rakud ja viirused

Madin-Darby koera neeru (MDCK) (ATCC, #CRL-2936) rakke hoiti minimaalses olulises söötmes (MEM) (Sigma-Aldrich, M4655, St. Louis, MO, USA), mis sisaldas 10 protsenti veise loote seerumit (FBS) (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Kanada 16000-044) ja neid hoiti niisutatud 5% CO2 inkubaatoris temperatuuril 37 ◦C. A/Swine/Alberta/SD0435/2019 (H3N2) [SD435] ja A/Swine/Manitoba/SD0467/2019 (H1N2) [SD467] swIAV eraldati väliproovidest Saskatchewani ülikooli Lääne veterinaarmeditsiini kolledžis Saskatoonis , SK, Kanada.

Vaktsiiniviirused SD191-R342V ja SD69- K345V päästeti nagu eelnevalt kirjeldatud [14]. Kõiki viiruseid kasvatati MDCK rakkudes 0,2 protsendi veise seerumi albumiini (BSA) (Sigma-Aldrich, A7030) juuresolekul koos kas 1 µg/ml L-[(tolueen{) {11}}sulfoonamiid)-2-fenüül]etüülklorometüülketoon (TPCK)-trüpsiin (WT viirused) või 0,5 µg/ml inimese neutrofiilide elastaas (elastaasist sõltuvad viirused) (Sigma-Aldrich, E8140).
2.2. Loomkatsete disain

Kakskümmend neli neljanädalast swIAV-negatiivset siga saadi ettevõttest Prairie Swine Center Inc. (Saskatoon, SK, Kanada). Need sead valiti juhuslikult ja jagati nelja rühma, kus iga vaktsineeritud rühma kohta oli seitse siga ja vaktsineeritud rühma kohta viis siga.

Grupi määramist on kirjeldatud joonisel 1A. Need rühmad paigutati vaktsineerimisrühmade alusel eraldi ruumidesse (rühmad A pluss B ja C pluss D olid koos) ja lasti enne nakatumist seitse päeva aklimatiseeruda.

Viie nädala vanuselt (päev 0) ja kaheksa nädala vanuselt (päev 21) vaktsineeriti rühmade A ja B sigu intratrahheaalselt 4 ml MEM-iga, samas kui rühmad C ja D vaktsineeriti. kahevalentse vaktsiiniga, mis sisaldab 1 × 106 PFU iga SD191−R342V ja SD69-K345V 4 ml MEM-is. Kümme päeva hiljem (31. päev) nakatati sigadele kas MEM (mock) või 1 × 106 PFU kas SD435-WT (H3N2) või SD467-WT (H1N2).

Sigasid jälgiti viis päeva pärast nakatamist, rektaalseid temperatuure mõõdeti iga päev ja ninaproovid võeti mõlemast ninasõõrmest 1., 3. ja 5. päeval. Pärast esimest (20. päev) ja teist (30. päev) vaktsineerimist koguti seerum. seerumi viiruse neutraliseerimise (SVN) test ja ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs (ELISA).

5. päeval pärast nakatamist surmati kõik sead humaanselt ning kopsud ekstraheeriti ja hinnati swIAV-le iseloomulike suurte kahjustuste olemasolu. Viiruse isoleerimiseks koguti ka kopsukoe proovid (joonis 1B).

2.3. Eetikaavaldus

Kõik loomadega tehtavad protseduurid kiitsid heaks Saskatchewani ülikooli ülikooli loomade hooldamise komitee (UACC) ja loomauuringute eetikanõukogu (AREB). See protokoll kiideti heaks 12. novembril 2021 (loomade kasutamise protokoll nr 20190064). Kõik protseduurid viidi läbi vastavalt Kanada loomahooldusnõukogu (CCAC) nõutavatele standarditele Saskatchewani ülikoolis, Saskatchewani ülikoolis, SK, Kanadas, vaktsiini- ja nakkushaiguste organisatsioonis (VIDO).

2.4. Proovide võtmine

Nina tampoonid mõlemast ninasõõrmest asetati 1 ml MEM-i, mis sisaldas 1 × antibiootikumi antimükootilist ainet (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Kanada, 15240-062) ja külmutati temperatuuril –80 ◦C kuni qRT-PCR läbiviimiseni. Kõik sead surmati humaanselt etanooli (240 mg/ml naatriumpentobarbitaali; 2 ml 4,5 kg kohta) intravenoosse manustamisega. Eutanaasia korral eemaldati kopsud tervikuna, et määrata nii lillakaspunaste, tugevate kahjustuste kui ka kopsupõletiku protsent.

Protsendid määrati nii kopsusagara massi kui ka kogu kopsumahu põhjal [18]. Viiruse tiitrimiseks võeti kopsuproovid ka parematest apikaalsetest, südame- ja diafragmaalsagaratest. Neid kopsuproove segati tiitrimiseks võrdsetes kogustes 10% (mass/maht) MEM-i, mis sisaldas 1x antibiootikumi-mükootilist ainet.

Joonis 1. Sigade rühmitamine ja katsekava kahevalentse LAIV-i kaitsetõhususe hindamiseks uute kliiniliste isolaatide vastu. Sigu (n=5 MEM/MEM rühmades ja n=7 kahevalentsetes/bivalentsetes rühmades) vaktsineeriti intratrahheaalselt 4 ml MEM-i või kahevalentse vaktsiiniga, mis koosnes 1 × 106 PFU-st. SD191−R342V ja SD69-K345V päevadel 0 ja 21. 31. päeval nakatati sead intratrahheaalselt MEM-iga või SD435 (H3N2) või SD467 (H1N2) 1 × 106 PFU-ga. (A)

Selle loomkatse immuniseerimise, nakatamise ja proovide võtmise ajakava. Kahekümne neljal neljanädalasel swIAV-negatiivsel sead lasti enne nakatumist seitse päeva aklimatiseeruda. Viie nädala vanuselt (päev 0) ja kaheksa nädala vanuselt (päev 21) vaktsineeriti rühmade A ja B sigu intratrahheaalselt 4 ml MEM-iga, samas kui rühmad C ja D vaktsineeriti. kahevalentse vaktsiiniga, mis sisaldab 1 × 106 PFU iga SD191−R342V ja SD69-K345V 4 ml MEM-is.

Kümme päeva hiljem (31. päev) nakatati sigadele kas MEM (mock) või 1 × 106 PFU kas SD435-WT (H3N2) või SD467-WT (H1N2). Sigasid jälgiti viis päeva pärast nakatamist, rektaalseid temperatuure võeti iga päev ja 1., 3. ja 5. päeval võeti mõlemast ninasõõrmest ninatampoonid. Seerum koguti pärast esimest (20. päev) ja teist (30. päev) vaktsineerimist. 5. päeval pärast nakatamist (36. päev) surmati kõik sead humaanselt ja kopsud eraldati hindamiseks. (B) Loodud saidil BioRender.com.

2.5. Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs (ELISA)

Katteantigeenide valmistamiseks paljundati SD435 ja SD467 MDCK rakkudes ja puhastati sahharoosi gradiendi ultratsentrifuugimisega. Viiruste inaktiveerimine toimus, lisades viirusele 97% propiolaktooni kontsentratsioonis 1:1000 (maht/maht) (Thermo Fisher Scientific, AAB2319703). Seda segu loksutati temperatuuril 4 °C üleöö, inkubeeriti 37 °C juures kaks tundi, et hõlbustada -propiolaktooni hüdrolüüsi, seejärel hoiti kuni kasutamiseni temperatuuril -80 °C.

Vaktsineerimisest ja nakatamisest põhjustatud swIAV-spetsiifiliste IgG tasemete mõõtmiseks võeti sea seerumit pärast esimest (20. päev) ja teist (30. päev) vaktsineerimist ning enne lahkamist (36. päev).

Puhastatud propiolaktooniga inaktiveeritud viirused SD435 (1 µg/mL) ja SD467 (2 µg/mL), lahjendatud karbonaat/vesinikkarbonaat kattepuhvris (pH 9,6) kanti Immulon-2 96- süvendiplaatidele temperatuuril 1{{ 12}}0 µL süvendi kohta (Thermo Labsystems, Ottawa, ON, Kanada, 3655) ja inkubeeriti üleöö temperatuuril 4 ◦C. Pärast üleöö inkubeerimist pesti kaetud plaate neli korda TBST-ga (0,1 M Tris, 0,17 M NaCl ja 0,05 protsenti Tween 20), millele lisati seerumi või BALF-i neljakordsed seerialahjendused. plaati kahes eksemplaris, millele järgneb kahetunnine inkubeerimine toatemperatuuril. Seerum lisati alglahjendusega 1:10 ja BALF lisati lahjendamata kujul.

Igal plaadil võeti eelnevalt määratletud positiivsete kontrollseerumite proovid ning vastavad negatiivsed kontrollid, seerum ja BALF eelmises uuringus vaktsineerimata sigadelt [14]. Plaate pesti neli korda TBST-ga, misjärel kitse sigade IgG (H pluss L) fosfataasiga märgistatud afiinsuspuhastatud antikeha (1:5000) (Sigma Aldrich, SAB3700435) või hiire seavastane IgA (Serotec, MCA658) ( 1:300) lahjendati TBST-ga ja jäeti üheks tunniks toatemperatuuril inkubeerima.

IgA ELISA-d töötati välja biotinüülitud kitse hiirevastaste IgG (H pluss L) antikehade (CALTAG, Burlingame, CA, USA, M30015) ja streptavidiini leeliselise fosfataasi lahuse (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) mõlemad üks tund toatemperatuuril. Pärast inkubeerimist pesti nii IgG kui ka IgA plaate neli korda TBST-ga, millele lisati p-nitrofenüülfosfaadi substraat (PNPP) [10 mg/mL p-nitrofenüülfosfaadi di(tris)soola kristalliline (Sigma-Aldrich), 1% dietanoolamiini ( Lisati Sigma-Aldrich), 0,5 mg/ml MgCl2 ja pH 9,8] (1 mg/ml) ja inkubeeriti toatemperatuuril kaks tundi.

Reaktsioon peatati 0,3 M etüleendiamiintetraäädikhappe (EDTA) lisamisega ja plaatidelt loeti spektrofotomeeter 405 nm juures, etalonlainel 490 nm. Proovi tiiter määratleti kui kõrgeim lahjendus, mille juures selle proovi OD oli kõrgem kui määratletud piirväärtus (teadaoleva negatiivse proovi keskmine OD pluss kahekordne standardhälve).

2.6. Viiruse neutraliseerimise (VN) test

MDCK rakud (3,5 × 104 uM) plaaditi 96-süvendiga plaatidele. Seerum ja BALF inaktiveeriti kuumusega 56 °C juures 30 minutit. Plaadile lisati neljakordselt seerumi ja BALF-i kahekordsed lahjendused ning 60 µL lahjendatud seerumit või BALF-i inkubeeriti 1 tund temperatuuril 37 °C 100 TCID50 sisaldava võrdse mahuga SD435 või SD456.

Seejärel lisati MDCK rakkudele 100 ui segu ja tsütopatogeenne toime (CPE) dokumenteeriti 48 tundi ja 72 tundi pärast nakatumist (pi). Neutraliseeriva antikeha tiiter oli iga seerumiproovi kõrgeim lahjendus, mis kaitses rakke täielikult CPE eest vähemalt kahes süvendis 4-st.

2.7. Viiruse määramine

Pärast kogumist asetati kopsuproovid kohe jääle ja külmutati kuni töötlemiseni temperatuuril –80 ◦C. Töötlemiseks kaaluti iga kopsukude ja lisati 10-protsendiline (mass/maht) MEM-i, millele oli lisatud 1x antibiootikumi-mükootilist ainet (Thermo Fisher Scientific, 15240-062). Kopsukoe homogeniseeriti TissueLyser II-s (Qiagen, Hilden, Saksamaa) 30 Hz juures 5 minutit, millele järgnes tsentrifuugimine 5000 × g juures 10 minutit temperatuuril 4 °C. Homogeniseeritud supernatant koguti ja säilitati kuni edasise analüüsini temperatuuril –80 ◦C.

Nina tampooniproove segati vorteksiga 15 sekundit ja tsentrifuugiti 1600 × g juures 25 minutit temperatuuril 4 °C. Supernatandid koguti ja säilitati kuni edasise analüüsini temperatuuril –80 ◦C. Viiruse tiitrid määrati TCID50 analüüsiga kopsude ja kvantitatiivse RT-PCR abil nina tampooniproovide jaoks.

2.8. RNA ekstraheerimine ja kvantitatiivne RT-PCR (qRT-PCR)
SD467 ja SD435 viiruse RNA tasemete määramiseks nina tampooniproovides pärast nakatamist viidi läbi qRT-PCR. Standardkõver tehti, kasutades teadaoleva tiitriga SD435 ja SD467 RNA-d. Lühidalt, RNeasy Plus Mini komplekti (Qiagen, Toronto, ON, Kanada, 74136) kasutati vRNA ekstraheerimiseks 200 µl ninapesust.

RNA muundati cDNA-ks, kasutades universaalset gripipraimerit Uni12 ja SuperScript III transkriptaasi (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) [19]. qPCR viidi läbi kolmes eksemplaris StepOnePlusTM Real-Time PCR süsteemis (Applied Biosystems, CA, USA) Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), 5 µL cDNA ja 1 µL 10 µM päri- ja tagurpidi praimeriga. PCR reaktsioonid viidi läbi anniilimistemperatuuril 58 °C 40 tsüklit. Kõik qPCR praimerite järjestused on saadaval nõudmisel.

2.9. Statistiline analüüs

Statistiline analüüs viidi läbi GraphPad Prism 8 tarkvara abil. Kasutati Mann-Whitney ja Kruskal-Wallise mitteparameetrilisi teste. Olulised erinevused on tähistatud tähega * (p < 0.05), ** (p < 0.01), *** (p < 0,001) või **** (p < 0,0001). ns=ei ole oluline.

For more information:1950477648nn@gmail.com