3D-neeruorganoidid pingilt voodisse tõlkimiseks

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Navin Gupta et al

Abstraktne

Neerud on olulised organid, mis filtreerivad verd, eemaldades uriinijäätmed, säilitades samal ajal vedeliku ja elektrolüütide homöostaasi. Praegused tavapärased uurimismudelid, nagu staatilised rakukultuurid ja loommudelid, ei ole inimeste keerulise in vivo olukorra mõistmiseks piisavad või neil puudub translatsiooniline väärtus. Et kiirendadaneerudon vaja uusi uurimisvahendeid. Hiljutised arengud on võimaldanud indutseeritud pluripotentsete tüvirakkude suunatud diferentseerumist, et tekitada neeruorganoide.NeerOrganoidid sarnanevad inimese neeruga in vitro ja neid saab rakendada regeneratiivses meditsiinis ning arengu-, toksilisuse- ja haigusmudelitena. Kuigi praegused uuringud on näidanud palju lubadusi, on endiselt probleeme, sealhulgas ebaküpsus, piiratud reprodutseeritavus ning perfuseeritavate veresoonte ja kogumiskanalisüsteemide puudumine. See ülevaade annab ülevaate meie praegusest arusaamast nefrogeneesist, mis võimaldas luua neeruorganoide. Järgmiseks potentsiaalsed rakendusedneerudräägitakse organoididest, millele järgneb tulevikuväljavaade. Selles ülevaates tehakse ettepanek, et neeru organoidide uurimise edenemist hõlbustaks meie kasvavad teadmised nefrogeneesist ja paljutõotavate tehnikate, näiteks kiibil asuvate mudelite kombineerimine.

Märksõnad Neer organoid. Tüvirakud. Bioinsener.Nefron

Cistanche for neeru kohta lisateabe saamiseks klõpsake siin

Sissejuhatus

Neerud on olulised organid, mis filtreerivad verd, et tekitada ainevahetusjääke, mis on mõeldud uriiniga eritumiseks. Neerud omavad märkimisväärset plastilisust uriini koostise kohandamisel, sobitades sissevõtmist eritumisega, et säilitada lahustunud ainete homöostaasi ja vedeliku tasakaalu. Kuna imetaja neer on mitteregenereeruv organ, kuhjub funktsionaalsete üksuste ehk nefronite kadu aja jooksul kõigil indiviididel [1]. Suure levimusega süsteemsed haigused, nimelt hüpertensioon ja suhkurtõbi, ravimitest või hemodünaamikast põhjustatud ägedadneerudvigastus(AKI) ja esmased neeruhaigused on neerufunktsiooni kiire kaotuse sagedased põhjused ja moodustavad kroonilise neeruhaiguse (CKD) peamised etioloogiad [2]. CKD jaguneb etappideks, mis põhinebneerud düsfunktsioon, mis põhjustab lahustunud aine häireid ja vedeliku tasakaaluhäireid, mis põhjustavad ulatuslikku haigestumust ja suremust. USA-s on kroonilise neeruhaiguse levimus 14 protsenti [3], selle aastane ravikulu on 120 miljardit dollarit [4], see mõjutab negatiivselt elukvaliteeti [5] ja arenenud staadiumides kulmineerub lõppstaadiumis neeruhaigus. ESRD), mis nõuab neeruasendusravi (RRT) vajadust. RRT vormid hõlmavad dialüüsi ja siirdamist, millest esimene moodustab 7 protsenti Medicare'i eelarvest [6] ja teine ​​on piiratud sobivate elundite pakkumisega [7]. Krooniline neeruhaigus ja ESRD koormavad suurel määral tervishoiuressursse ja -kulusid, samuti neid haigusi põdevaid patsiente [8].

Selle koormuse vähendamiseks on läbi viidud fundamentaal- ja translatiivseid uuringuid järgmistes valdkondadesneerud arengut, nefrotoksilisuse testimine, haiguste modelleerimine ja neerude regeneratiivne meditsiin. Traditsioonilised uurimisvahendid koosnevad in vitro rakukultuurist nii isoleeritud primaarsetest neerurakkudest kui ka viiruslikult transformeeritud immortaliseeritud rakuliinidest ning in vivo loommudelitest. Kuigi neid tavalisi mudeleid on kasutatud neerufüsioloogia ja -patoloogia uurimiseks mõningase eduga, on neil omased piirangud, mis võivad kaasa aidata laboriuuringute halvale translatsioonile kliiniliseks teraapiaks [9]. In vitro mudelid piirduvad suures osas üherakuliste tüüpide analüüsiga, jättes tähelepanuta rakkudevaheliste ja keskkonna interaktsioonide mõju keerulises heterogeenses koes, näiteks neerudes. Kuigi loommudeleid integreerivad kehasüsteemid, piiravad liikidevahelised erinevused, mille tulemuseks on ebaustavad järeldused, mis nõuavad palju aega ja kulusid [10]. Traditsiooniliste uurimismeetodite piirangute ületamiseks on vaja uudseid katsemeetodeid inimrakkudes ja kudedes [11].

Kuna vajadus on innovatsiooni ema, on inimese pluripotentseid tüvirakke (hPSC) kasutavate protokollide edusammud tekitanud keeruka kolmemõõtmelise, mitmerakulise ja elundispetsiifilise koe, mida nimetatakse organoidideks. Maksa, kopsu, südame, soolte ja neeru organoidid võimaldavad katsetada inimkudedega in vitro [12]. Teoreetiliselt saab kogu inimese soma sisaldavaid kudesid mastaapselt reprodutseerida tänu hPSC-dele, mis määratlevad pluripotentsuse ja eneseuuendamise omadused. Kahte tüüpi hPSC-d on inimese embrüonaalsed tüvirakud (ESC) ja inimese poolt indutseeritud pluripotentsed tüvirakud (iPSC-d). 1998. aastal avaldasid Thomson jt. kirjeldas esmakordselt inimese blastotsüstidest saadud ESC liinide genereerimist. Et vältida ESC-de embrüonaalse päritoluga seotud vaidlusi, leidsid 2006. aastal Takahashi et al. kirjeldas revolutsioonilist meetodit pluripotentsuse esilekutsumiseks terminaalselt diferentseerunud somaatilistes rakkudes. Neid rakke nimetatakse iPSC-deks ja need moodustuvad Yamanaka faktorite (Oct4, Sox2, Klf4 ja c-Myc) transkriptsioonilise aktiveerimise teel [13]. Lisaks eetiliste probleemide vältimisele võimaldavad iPSC-d ka personaliseeritud meditsiini lähenemisviise. iPSC-d esindavad piiramatut rakkude pakkumist, mis on isogeensed oma vanemliku somaatiliste rakkude suhtes [13]. Patsiendispetsiifilisi looduslikult esinevate mutatsioonidega iPSC-sid võib kasutada kliiniliselt oluliste haigusmudelite loomiseks inimkoes, eriti tingimustes, mille jaoks loommudel puudub. Pärilike haiguste mudelites võivad genoomiga korrigeeritud kontrollid luua otsese seose genotüübi ja fenotüübi vahel [14]. Immunokompetentse regeneratiivse meditsiini lähenemisviisid võivad kasutada patsiendi iPSC-dest genereeritud hulgi, elundispetsiifilist kudet, välistades vajaduse immunosupressiooni järele ja minnes ümber istutatavate elundite puudusest [15]. HPSC-de, eriti iPSC-de translatsioonilise kasulikkuse võimendamine võib muuta ravimite väljatöötamise ja elundite siirdamise valdkonnad, mis toob kaasa dramaatilisi tulemusi inimeste tervisele ja haigustele.

HPSC-de võime taastada kõiki keharakke kujutab endast suurt väljakutset, eriti selle, kuidas kontrollida diferentseerumist konkreetsete huvipakkuvate raku- ja koetüüpide suhtes. Imetajate organogenees toimib arhetüübina suunatud diferentseerumisele, vahepealsete rakutüüpide tõhusale järjestikusele indutseerimisele, mis ilmnevad elundite arengu käigus [16]. Vastupidi, otsene ümberprogrammeerimine hõlmab rakutüübispetsiifiliste transkriptsioonifaktorite esilekutsumist, jättes kõrvale vahepealsed rakutüübid somaatilise raku muundamise ajal määratletud sihtpopulatsiooniks. Kuigi otsene ümberprogrammeerimine toob kasu lihtsamast metoodikast, põhjustab DNA metülatsiooniprofiili ja vanemraku epigeneetika tõttu sageli mittetäieliku konversiooni sihtrakuks [17]. Isegi kui otsene ümberprogrammeerimine toimus täieliku konversiooniga, on tulemuseks tõenäoliselt ühtlane rakupopulatsioon [18]. Neerude osas aitab rohkem kui tosin erinevat rakutüüpi in vivo nefroni struktuuri ja funktsiooni. Nefroni taastamiseks oleks vaja otsest ümberprogrammeerimist kõigi kaasas olevate rakutüüpide ühisele esivanemale, nimelt nefroni eellasrakkudele, endoteeli eellasrakkudele ja strooma eellasrakkudele [19]. Natiivse neeruga sarnase koe arendamise nõutav lähenemisviis on suunatud diferentseerimine, meetod, mis põhineb sügavatel teadmistel neerude arengust. Selles ülevaates tõstame esile olulist rolli, mida neerude arengubioloogia on mänginud hPSC-st tuletatud neeruorganoidide genereerimisel, kommenteerime lühidalt neeruorganoidide tehnoloogia rakendusi ja arutame tulevikusuundi, mis käsitlevad kliinilise tõlke praegusi piiranguid ja väljakutseid.

Neerude areng

Neerude arendamine on suunatud diferentseerumise kuldstandardiks, et toota in vitro kude, mis on oma in vivo vastega kõige sarnasem. Aastakümneid kestnud arenguuuringud imetajate mudelites näitasid, et Wnt, FGF, retinoehape ja TGF-/BMP rajad reguleerivad morfogeneesi, koe mustrit ja elundi primordia esilekutsumist [12]. Need rajad on kriitilise tähtsusega kudede iteratiivseks arenguks kolmes idukihis, sealhulgas mesodermist pärinevas neerus. Endodermaalsete ja ektodermaalsete kihtide vahele jääv mesoderm on kujundatud hPSC-de (eesmiste epiblastide) gastrulatsiooni kaudu primitiivse triibu kaudu, mis on mööduv struktuur, mis määrab areneva embrüo eesmise-tagumise ja mediaalse-lateraalse telje [12]. Mesodermi eesmise-tagumise telje määrab involutsiooni kestus primitiivse triibu kaudu koos ajalise kokkupuutega Wnt-signaalidega, kuna hPSC-d, mis tungivad läbi primitiivse triibu, migreeruvad ettepoole, et algselt aidata kaasa eesmistele struktuuridele, täites seejärel tagant [1]. Mesodermi mediaalne-lateraalne telg on määratud rostrokaudaalse BMP gradiendiga primitiivses vöötis, kuna hPSC-d, mis läbivad gastrulatsiooni läbi rostraalse primitiivse vööta (madal BMP aktiivsus), muutuvad paraksiaalseks mesodermiks, keskmise primitiivse triibu kaudu (mõõdukas BMP aktiivsus). vahepealne mesoderm (IM) ja kaudaalse primitiivse triibu kaudu (kõrge BMP aktiivsus) muutuvad lateraalseks mesodermiks [20, 21]. Primitiivses triibas on Wnt-signaali kestus ja BMP-signaali aste peamised mustri määrajad kogu mesodermaalses idukihis.

Imetajate neerude arengus on 3 nefrostaadiumi, pronefros, mesonefros ja metanefros, mis kõik pärinevad mesodermist. Hiirtega läbiviidud uuringud näitavad, et metanefros, mis püsib täiskasvanud neeruna, tuleneb kahe IM-st pärineva koe, metanefrilise mesenhüümi (MM) ja kusejuha punga (UB) vastastikusest induktsioonist [22]. MM koosneb nefroni eellasrakkudest (NPC-d), mis on segatud stroomarakkudega, samas kui UB moodustub Wolffi kanalist väljuva jäänukina, degeneratiivse struktuurina, mis juhib primitiivse mesonefrose kloaaki [23]. MM-i mütsi mesenhüümi kontsentreeritud NPC-d läbivad progresseeruva morfogeneesi komakujulistest kehadest S-kujulisteks kehadeks, mis eristuvad segmentaalselt külgnevateks epiteelistruktuurideks, mis hõlmavad nefroni, nimelt podotsüütideks, proksimaalseteks tuubuliteks, Henle ahelaks, distaalseteks tuubuliteks [ ja ühendtuubuliteks. 24–27]. Üksikute nefronite ühendustuubulid koonduvad UB-st tuletatud hargnenud kogumissüsteemis pärast kahe koe vastastikust induktsiooni [28]. UB-st tuletatud Wnt-signaalimine katalüüsib NPC-de mesenhümaal-epiteeli üleminekut (MET) nefroniepiteelile [29], samas kui MM-st tuletatud GDNF-signaalid läbi Ret/GFRA1 kompleksi reguleerivad hargnemismorfogeneesi [30] (joonis 1).

Joon. 1 Inimese neeru areng primitiivsest vöötusest küpse nefronini. [1] Primitiivne vööt (PS) tekitab mesodermi ja seejärel vahepealse mesodermi (IM), millest saab varase gastrulatsiooni ajal eristada tagumist IM-i (PIM) ja eesmist IM-i (aIM). [2] Metanefriline mesenhüüm (MM), mis sisaldab nefroni eellasrakke (NPC) ja stroomarakke, moodustub PIM-ist, samas kui aIM moodustab Wolffi kanali, millest areneb kusejuha (UB). UB hakkab hargnema NPC-de, strooma eellasrakkude (SPC) ja endoteeli eellasrakkudega (EPC). Selles etapis ei imbu veresoonkond NPC populatsioonidesse. [3] Järgmiseks arendavad NPC-d neerupõiekesed, mis moodustavad komakujulise keha, millele järgneb s-kujuline keha. Lõpuks ühendub see struktuur UB-ga ja muutub küpseks nefroniks. Veri filtreeritakse glomeruli (hall), mis viib ultrafiltraadi kogumistorusse (kollane) läbi proksimaalse tuubuli (oranž), Henle ahela (sinine) ja distaalse tuubuli (roheline). Igale struktuurile vastavad markerid on antud.

Suur läbimurre meie arusaamises neerude arengust toimus 2014. aastal, kui Taguchi et al. avastas ootamatult, et T plus MM prekursorid on arenguliselt erinevad Osr1 pluss UB eellastest [31], kasutades liini jälgimise tehnikaid, märkides, et eelnev töö viitas Osr1 pluss IM ühisele esivanemale ilma täiendava piiritlemiseta [22]. Ülalmainitud uuringus kasutati Osr1-GFP hiirt, et teha kindlaks, kas Osr1 ekspresseerub eri aegadel ja erinevates kohtades IM nefritsoonis. Histoloogilise analüüsi ja OSR1-GFP pluss rakkude sorteerimise/reaggregeerimisega erinevatel arenguetappidel suutsid autorid näidata, et eesmine IM aitab kaasa mesonefrosele, mesonefrilisele kanalile (Wolffi kanal) ja kusejuhale (kesta väljumine). Wolffi kanal), samas kui tagumine IM sisaldab Six2 pluss Sall1 pluss MM-i NPC-sid, mis diferentseeruvad nefroni epiteelirakkudeks. Kindlaksmääramine, et MM on tuletatud tagumisest IM-st ja UB eesmisest IM-st, koos iseloomuliku markeri ekspressiooniga annab teekaardi neeruspetsiifiliste liinide spetsiifiliseks indutseerimiseks ja on võimaldanud suunatud diferentseerimisprotokolle tõhusalt indutseerida MM-st tuletatud nefronit. epiteel ilma teiste IM derivaatide saastumiseta. Oluline on see, et ajaloolistes uuringutes eeldati, et hiire neerude areng peegeldas inimese nefrogeneesi. Võrreldes inimese ja hiire neerude arengut, on hiljutised uuringud selgitanud nii koonduvaid kui ka lahknevaid tunnuseid, sealhulgas lobe moodustumist, eellasniši korraldust ja oletatavate rakutüüpi määravate markerite ekspressiooni [32]. Sellistes uuringutes on inimese neerude andmed saadud postuumsest embrüonaalsest koest, mis võimaldab saada teadmisi, mitte katsetada. hPSC-st tuletatud neeruorganoidide tulek võimaldab translatsioonirakenduste hulgas testitavaid hüpoteese inimese neerude arengus.

3D neeru organoidid

Hiljutised arengud on võimaldanud inimese poolt indutseeritud pluripotentsetest tüvirakkudest (hiPCS) moodustada neeruorganoide läbi suunatud diferentseerumise [33], luues uudse translatsiooniplatvormi ravimite arendamiseks ja regeneratiivse meditsiini tehnikateks. Organoidid on mini-in vitro elundid, mis organiseeruvad (tüvi)rakkudest 3D-mikrokeskkonnas. Neil on kudede morfoloogia, rakkude arvu, proliferatsiooni ja diferentseerumise osas suured sarnasused oma in vivo kolleegidega [34].

Pärast MM-i ja UB-i erineva päritolu piiritlemist imetajate neerude arengu ajal ja järk-järgult tagasi töötamist, et tuvastada vaheetapid ja nende iseloomulik markerite ekspressioon, Taguchi et al. kehtestas MM-i jaoks suunatud diferentseerimisprotokollid nii hiire kui ka inimese PSC-des [31]. Täpsemalt, OCT3 / 4 pluss SOX2 pluss hPSC-dest moodustatud embrüoidkehad allutati laiendatud Wnt- ja BMP4-signaalidele, et kutsuda esile T pluss CDX2 pluss tärkav mesoderm, mis on mõeldud panustama tagumise tärkava mesodermi rakkudesse. Mesodermi mediaalne-lateraalne telg suunati WT1 pluss HOXD11 pluss OSR1 pluss posterior IM poole, ravides samaaegselt BMP4, Activini ja retinoehappega. Järgmisena kasutati OSR1 pluss SIX2 pluss SALL1 pluss WT1 pluss NPC-de väljatöötamise toetamiseks madalat Wnt ja FGF9, teatatud induktsiooniefektiivsusega ~62 protsenti . Kui NPC-d genereeriti nii hiire kui ka inimese PSC-dest, oli nende edasiseks eristamiseks proksimaalseteks tuubuliteks, distaalseteks tuubuliteks ja podotsüütide klastriteks vajalik kookultuur hiire embrüonaalse seljaajuga.

Kasutades nii hESC-sid kui ka hiPSC-sid ühekihilises kultuuris, Morizane et al. kirjeldas suunatud diferentseerimisprotokolli, mis indutseeris SIX2 pluss SALL1 pluss WT1 pluss NPC-d kuni 90-protsendilise efektiivsusega diferentseerimispäevadel 8–9. Lühidalt, pikendatud Wnt-i signaalimine kutsus esile hilise primitiivse triibu, mis allutati aktiviinile, moodustades PIM-i, mis diferentseerus vastusena FGF9-le NPC-deks. Seejärel agregeeriti NPC-d tsentrifuugimise teel kolmemõõtmelisse suspensioonikultuuri, allutati mööduvale CHIR99021 (CHIR) impulsile, et simuleerida UB-st tuletatud Wnt signaaliülekannet, et katalüüsida MET-i NPC-des, ning neid jätkati FGF9-ga, et laiendada ja säilitada tüve tüve. NPC nišš [35]. Pärast CHIR-impulssi läks MM üle PAX8 pluss LHX1 pluss peritubulaarseks agregaadiks, mis diferentseerus 14. diferentseerumispäevaks veelgi LAM1 pluss neeruvesiikuliks. Stohhastilise diferentseerumise korral (st ilma täiendavate teguriteta) muutusid neeruvesiikulid ise nefronilaadseks. struktuurid, mis koosnevad külgnevatest epiteelitest, millel on mitu markerit iga podotsüütide (NPHS1 pluss PODXL plus), proksimaalsete tuubulite (LTL pluss ), Henle ahela (CDH1 pluss UMOD plus ), distaalsete tuubulite (CDH1 pluss UMOD−) ja ühendustuubulite ( CDH1 pluss AQP2 plus ) [36].

Freedman et al. on kasutanud teistsugust lähenemist, et luua neeruorganoidide saamiseks lihtsustatud protokoll. Siin on autorid kasutanud sandwich-Matrigel-meetodit, et luua hPSC-dele 3D-mikrokeskkond, et moodustada õõnsaid amnionilaadseid õõnsusi ümbritsevaid sferoide [37]. Suunatud diferentseerimise kaudu stimuleeritakse neid sferoide kaheetapilise protokolliga neeruorganoidideks saama. Moodustunud sferoide töödeldi CHIR-ga 1,5 päeva, millele järgnes kokkupuude B27--lisandiga söötmega. 10. päeval moodustusid pärast mesenhümaal-epiteeli üleminekut keerdunud, poolläbipaistvad, torukujulised organoidid. Takato jt. on tuvastanud nii kogumiskanali kui ka neeru mesenhüümi eellasrakkude arengutunnused [38]. Siin kasutasid autorid seda teavet nii metanefrilise (vs mesonefrilise) mesenhüümi kui ka ureetilise epiteeli indutseerimiseks 4-päevase CHIR-i kokkupuutega, millele järgnes 3-päevane FGF9-ga kokkupuude. Seejärel kultiveeriti agregaate 20 päeva, võimaldades moodustada organoidid, mis vastasid esimese trimestri neerudele. Autorid on väitnud kogumiskanali olemasolu GATA3 ja ECAD markerite olemasolu kaudu. Hiljem hinnati seda aga ebausaldusväärseks, kuna MM-ist saadud distaalsed ja koguvad tuubulid võivad samuti neid markereid väljendada [39, 40] (joonis 2).

Joonis 2 Suunatud diferentseerumisprotokollid inimese poolt indutseeritud pluripotentsete tüvirakkudest pärinevate neeruorganoidide genereerimiseks. Visualiseeritakse inimese neeru organoidide genereerimise nelja protokolli sarnasused ja erinevused. Iga visualiseeritud protokoll sisaldab ajakava päevades, organoidi arengu etappi ja täiendatud tegureid, mis juhivad organoidide suunatud diferentseerumist ja küpsemist. Taguchi jt protokollid. ja Takasato et al. tulemuseks organoidid Transwelli membraanidel. Morizane et al. võimaldas luua neeruorganoide 96-kaevuplaatidel ja Freedman et al. Matrigeli võileivapõhises lähenemisviisis

Pärast ülaltoodud nelja suunatud diferentseerimisprotokolli avaldamist 2015. aastal on mitmed rühmad järginud sarnast lähenemisviisi, et muuta hPSC-d järjestikku hiliseks primitiivseks jooneks, PIM-iks, MM-iks, peritubulaarseks agregaadiks, neerupõieks ja lõpuks neeruorganoidideks [41–44]. Wu et al. tegi Morizane'i ja Takasato protokollide võrdleva analüüsina üherakulise transkriptoomilise analüüsi nii üksteise kui ka inimese loote neeru (16. rasedusnädalal) ja täiskasvanud inimese neeru (62--aastane normaalse seisundiga mees).neerudfunktsiooni). Kui hinnati staatilistes tingimustes 26. diferentseerumispäeval, genereerisid mõlemad protokollid ebaküpset kude, millest igaüks ekspresseeris ~ 20 protsenti täiskasvanud proksimaalsetest tuubulitest ja podotsüütide transkriptsioonifaktoritest [41]. Siiski, Tran et al. kasutas Morizane'i protokolli abil välja töötatud neeruorganoidide üherakulist transkriptoomikat, et toetada organoididest pärinevate podotsüütide kasutamist haiguste modelleerimiseks ja filtreerimisfunktsiooni taastamiseks. Organoidide podotsüütidel oli väga sarnased, progresseeruvad transkriptsiooniprofiilid inimese loote neerude ja siirdamisel värvatud peremehe veresoonkonnaga, et soodustada edasist küpsemist [42]. Garreta et al. leidis, et neeruorganoidide transkriptsiooniprofiil laienes inimese loote teise trimestri neerude omale diferentseerumise 16. päevaks, kasutades pehmet hüdrogeeli, et pikendada 3D-mikrokeskkonna kestust, et hõlbustada raku-raku ja raku-maatriksi interaktsioone [44] . Järgides sarnast diferentseerimisprotokolli, Low et al. viidi läbi üherakuline RNA sekveneerimine (RNAseq), mis tuvastas neeruveresoonkonna potentsiaalse allikana nefroni eellasrakkude alamhulga, mis erineb hiirte arengu uuringutest, mis näitasid allikana FLK1 pluss endoteeli eellasrakke, mis erinevad NPC-dest. MM [45] ja pärineb osaliselt FOXD1 strooma eellasrakkudest [46]. Teised peamised leiud hõlmasid aga seda, et Wnt-i signaalimine reguleerib vaskularisatsiooni ja proksimaalsete ja distaalsete nefronisegmentide osakaalu, organoidide funktsionaalset küpsemist pärast implanteerimist ja autosomaalse retsessiivse polütsüstilise neeruhaiguse (ARPKD) modelleerimist patsiendilt saadud iPSC-de abil [43].

Neeruorganoidide translatiivne kasulikkus

Üldiselt piirduvad praegused haiguste või ühendite uurimise mudelid sageli rakuuuringute ja loommudelitega. Lahtrimudeleid on lihtne kasutada ja neid saab kasutada suurel hulgal. Kuid need hõlmavad sageli üherakulisi liine ja ei suuda mõista inimese in vivo neerude keerukust, nagu 3D-mikrokeskkond ja mitu rakku. Seetõttu ei suuda rakumudelid jäljendada in vivo 3D koe morfoloogiat ja heterogeenset ja keerulist mikrokeskkonda. Keerulise in vivo keskkonna arvessevõtmiseks on loommudelid, nagu hiired, olnud tavapärased uurimismudelid. Need mudelid on aga inimtingimustesse halvasti tõlgitavad [47, 48]. Samuti on suurenenud eetilised mured loomade uurimiseesmärkidel kasutamise pärast [49, 50]

Seetõttu on vaja uudseid mudeleid, mis suudavad täpsemalt jäljendada inimese in vivo olukorda [51].

Organoididel on potentsiaal nendest piirangutest üle saada tänu nende ainulaadsele võimele jäljendada inimeste in vivo olukorda. Ja kuna organoidid on saadud hiPSC-dest, saab neid kasutada ka isikupärastatud meditsiinis. Näiteks võib teatud ühendeid (ühendite kombinatsioone) testida toksilisuse või efektiivsuse määramiseks konkreetse inimese rakkudest saadud organoididega. Võimalikud on ka suuremahulised rakendused. Näiteks saab organoide kasutada eelkliiniliste mudelitena teatud ühendite omaduste määramiseks. Lisaks saab kliinilistes uuringutes kasutada usaldusväärseid inimeste haiguste mudeleid, et kiirendada ravi väljatöötamist eriti haruldaste haiguste puhul, mille puhul patsiente napib.

Kuigi täielikult toimivate neerude loomiseks in vitro on vaja rohkem edusamme, näitavad senised uuringud palju lubadusi. Mõned uuringud on juba näidanud neeruorganoidide rakendusi, nagu need praegu on. Need neeruorganoidide edusammud võimaldavad (tulevikus) kasutada regeneratiivses meditsiinis ning arengu-, toksilisuse- ja haigusmudelitena. Nende translatsioonirakenduste hulgas peetakse organoide ka potentsiaalseteks meetoditeks regeneratiivse meditsiini rakendamisel biotehniliste neerude loomiseks, et tutvustada dialüüsi ja neerusiirdamise alternatiivseid ravimeetodeid (joonis 3). Kuna arvukad ülevaated on teatanud neeruorganoidide avaldatud translatsioonirakendustest [1, 52–59], keskendub käesolev ülevaade tüvirakkudest pärineva neerukoe tulevasele põlvkonnale, mis on histoloogiliselt biosarnane natiivse inimese neeruga, et hõlbustada neeruorganoidide uuringute tõlkimist. kliinilise hoolduse mõjutamise suunas.

Praegused väljakutsed ja tulevikuperspektiivid

Neerud on tugevalt vaskulariseeritud organ, mis võtab kollektiivselt vastu 20 protsenti südame väljundist, filtreerides päevas kuni 180 liitrit verd [60]. Üheksateist kilomeetrit glomerulaarkapillaare, mille pindala on ~ 6000 cm2, aitavad kaasa glomerulaarfiltratsiooni barjäärile (GFB) [61]. GFB koostisosad on fenestreeritud glomerulaarkapillaarid, negatiivselt laetud glomerulaarne basaalmembraan ja podotsüüdid, millel on jalajälgede vahel lõhenenud diafragma [61]. GFB struktuur loob selle funktsiooni, vere filtreerimise, mis põhineb lahustunud ainete suurusel ja laengul. Glomerulaarfiltratsioonist moodustunud primitiivne uriin siseneb nefronituubulitesse, kus seda töödeldakse absorbeerivate ja sekretoorsete mehhanismide abil. Kuni 180 l filtraadist imendub ~ 99 protsenti, kusjuures ainult 1–2 l on mõeldud tavatingimustes uriiniga eritumiseks. Arvestades olulist mahu resorptsiooni peritubulaarsetes kapillaarides, ei ole üllatav, et mitmed nefronid voolavad ühistesse kogumiskanalitesse, mis koonduvad neeruvaagnasse, moodustades üksikud kusejuhad. Üldine struktuur, alates ulatuslikust proksimaalsest nefroni vaskularisatsioonist kuni laialdaselt levinud tubulaarse epiteeli-perituubulaarse kapillaarkihi side kuni arboreeritud distaalse nefroni äravooluni, mängib neerufunktsioonis kriitilist rolli. Neerud säilitavad suhteliselt vajaliku funktsiooni isegi siis, kui nende võimsus väheneb 20 protsendini, kusjuures paljud neist patsientidest jäävad asümptomaatiliseks. Vähenemine alla 15 protsendi tähendab aga sageli vajadust RRT järele [62, 63]. Taastumisvõimega NPC-d kaovad inimestel enne sündi ja seetõttu ei saa nefronid uueneda. Praegu puuduvad ravimeetodid kaotatud neerufunktsiooni taastamiseks, seega on nõudlus regeneratiivse meditsiini rakenduste järele suur. Lisaks on vaja GFB-d, et modelleerida haigusi, mis mõjutavad filtreerimist, funktsionaalset tubulaarset transporti, mis on vajalik mitmesugusteks toksilisuse testimiseks ja haiguste modelleerimiseks, ning MM-st pärinevate nefronite kombinatsiooni UB-st pärinevate kogumiskanalitega, mis on vajalikud enamiku neeru kaasasündinud anomaaliate modelleerimiseks. ja kuseteede (CAKUT) [64]. Korraldatud neeruveresoonkonna ja hargnenud kogumissüsteemi arendamine kujutaks endast märkimisväärset translatsioonihüpet neeru organoidtehnoloogias.

Neerude organoidne vaskularisatsioon

Neerude vaskularisatsioon hõlmab kahte erinevat protsessi: vaskulogeneesi ja angiogeneesi [65]. Vaskulogeneesis toimub veresoonte kokkupanek de novo, samas kui angiogenees hõlmab juba olemasolevate veresoonte hargnemist või pikendamist. Nende kahe protsessi koosmõju nefrogeneesi ajal jääb teadmata, kuid vaskulogeensed neeru mikroveresooned võivad eelneda angiogeense neeruarteri arengule [65]. Hiirtel ei ole MM-il ureetiliste pungade sissetungi ajal veresoonkonda, kuid järgmisel päeval tekib rikkalik kapillaaride võrgustik, millele järgneb vaskulariseeritud glomerulite moodustumine. Viimast realiseerivad endoteelirakud, mis tungivad vaskulaarsesse lõhe, moodustades ühe kapillaarsilmuse staadiumis glomeruleid [66–68]. Samal ajal aitavad MM-i vahelduvad vaskulogeensed FLK1 pluss endoteeli eellasrakud kaasa rikkalikule glomerulaarkapillaaride võrgustikule [69]. Sarnaselt suunatud diferentseerimise lähenemisviisidele MM-i moodustamisel ex vivo, peaks hPSC-st pärineva neerukoe vaskularisatsioon järgima selle embrüonaalset päritolu, et arendada mustrilist, hierarhilist neeru veresoonte võrgustikku.

Leiti, et PIM-st saadud MM-i esialgsete protokollide alusel välja töötatud 3D-neeruorganoidid sisaldavad vaskulaarseid rakke; glomerulid jäid siiski suures osas avaskulaarseteks ja veresoonte üldine arvukus oli natiivse neerukoega võrreldes kehv [70]. Oluline on see, et need vaskulogeensed veresoonte komplektid jäljendavad arengus varajast mikroveresoonte moodustumistneerudpabertaskurätik, mis toimus enne angiogeense neeruarteri invasiooni [65]. Taguchi et al. siirdasid oma indutseeritud hiire MM-i hiirtele koos angiogeense peremeesorganismist pärineva veresoonkonnaga, mille tulemuseks oli suurenenud glomerulaarsed kapillaarid. WT1 pluss podotsüütide klastrid paiknesid koos PECAM1 pluss veresoontega, mis leidsid pildistamisel sisaldavat peremeesorganismi punaseid vereliblesid [31]. Sarnast neeruorganoidide subkapsulaarset siirdamist on korratud, näidates, et organoidide glomerulites on veresoonkond püsivalt pärit peremeesorganismist ja moodustub varane glomerulaarne alusmembraan, mis koosneb fenestreeritud endoteelirakkudest ja podotsüütide jala protsessidest [71]. Neeruorganoidide subkutaansel siirdamisel on väidetud väikest glomerulaarfiltratsiooni taset, mis põhineb süsteemselt manustatud fluorestseeruvate dekstraanide rakusisesel tuvastamisel tuubulites, mis tähistavad glomerulaarfiltraadist omastamist [72]; Siiski ei saa välistada apikaalset omastamist, mis on tingitud tihedate ühenduste puudumisest kogu Bowmani kapslis proksimaalsesse tuubulisse või basolateraalset omastamist tubulaarsete fagotsüütiliste mehhanismide kaudu [73]. Tuginedes nende tööle, mille käigus neerukapsli alla siirdatud neeruorganoidid muutuvad peremeesorganismi poolt vaskulariseerituks ja näitavad glomerulaarset ja tubulaarset küpsemist [71], hiljuti on van den Berg et al. töötas välja elegantse in vivo süsteemi, mis kasutab suure eraldusvõimega mitmefotoni kujutist, et demonstreerida suuruse selektiivset glomerulaarsõelumist [74]. Eelkõige ei suuda liikidevahelisest kimäärsest koest moodustunud vaskulariseeritud glomerulid ületada piiranguid, mis on seotud jätkuva sõltuvusega loomasüsteemidest, sealhulgas liikidevahelised arengu- ja füsioloogilised erinevused, personaliseeritud meditsiini lähenemisviiside märkimisväärne kadu, madal läbilaskevõime ja kõrge hind.

Neeru organoidne vaskularisatsioon on saavutatud in vitro, sarnaste tulemustega, nagu on kirjeldatud siirdamiskatsetes. Abielludes neeru organoid- ja neer-kiibil tehnoloogiate vedeliku mikrokeskkonna kokkuvõtmiseks in vivo, Homan ja Gupta et al. leidis, et kiibil asuvatele neeruorganoididele rakendatud vedeliku nihkepinge hõlbustas perfuseeritavate veresoonte võrkude moodustumist, mis tekkisid kaasindutseeritud endoteeli eellasrakkude laienemisest ja diferentseerumisest. Lisaks näitasid autorid tubulaarsete epiteelirakkude ja podotsüütide suurenenud polaarsust ja küpsemist, mis avaldavad jalaprotsesse, mis külgnesid glomerulaarkapillaare, moodustades primitiivse GBM [70, 75]. Kuigi neerude organoidid olid superfusioonitud, mitte ainult veresoonkonna sees, simuleerib vedela nihkepinge rakendamine tervetele organoididele interstitsiaalset voolu, mis tekib sektsioonide vedeliku nihkest ~ 99 protsendi glomerulaarfiltraadi reabsorptsiooni ajal. Teisisõnu, ~ 99 protsenti torukujuliste luumenite mahust kandub üle interstitsiumi ja reabsorbeeritakse in vivo peritubulaarsete kapillaaride poolt. Kuigi perfuseeritavat veresoonkonda demonstreeriti fluorestseeruvate sondide abil, ei toetanud glomerulaarfiltratsiooni fluorestsentsi tuvastamine torukujulistes luumenis, kuna kasutati helmeid, mille läbimõõt oli 500 nm, samas kui glomerulaarkapillaarides on fenestratsioonide keskmine läbimõõt ~ 70 nm [ 76]. Eelkõige on kogu süsteemi veresoonkond tuletatud neeru organoididest ilma angiogeense invasioonita.

Praeguste väljakutsete ületamise meetodid hõlmavad angiogeensete vaskulaarsete võrkude ühendamist in vitro vaskulogeensete neeruorganoididega, et võimaldada GBM-i küpsemist funktsionaalse glomerulaarfiltratsiooniga. On palju usutavaid põhjuseid, miks lõplikku glomerulaarfiltratsiooni ei ole neerude organoid-kiibil meetodites veel toimunud, sealhulgas pikisuunaliste katsete puudumine, piiratud hüdrostaatiline rõhk, mis edastatakse glomerulaarsetes kapillaarides, nefroniepiteeli ebaküpsus ja potentsiaal oluliseks vereringeks. embrüonaalsete neerude arengut soodustavad tegurid. Varem on kirjeldatud in vitro otse perfuseeritavaid angiogeenseid vaskulaarseid võrgustikke, mis on võimelised toetama paksu kude või tungima kiibil olevatesse manustatud rakukonstruktsioonidesse [77, 78]. Selline veresoonkond võib anastomoseeruda organoidsetest mikroveresoontest, et piirata perfusiooni vaskulaarsesse sektsiooni, võimaldades olulise hüdrostaatilise rõhu ülekandumist glomerulaarkapillaaridesse. Teisi piiranguid saab käsitleda pikisuunaliste uuringute, embrüonaalse seerumiga perfuseerimise ja optimaalse diferentseerumispäeva organoidide kasutamisega (mõjutavad küpsust) sellistes seadmetes. Kui angiogeenne veresoonte võrk koosneks inimese rakkudest, hoitakse kõrvale liikidevaheliste erinevustega seotud piirangutest. Samamoodi hõlbustaks hPSC-st pärinevate veresoonte kasutamine, nagu on kirjeldatud [79], personaliseeritud meditsiini lähenemisviise nii ravimiarenduse kui ka regeneratiivse meditsiini strateegiate jaoks.

Kuseteede pungade moodustumine

Glomerulaarse ultrafiltraadi valmistamine ex vivo oleks märkimisväärne avastus, mis hõlbustab tüvirakkudest pärineva neerukoe translatsioonilist kasutamist, kuid järgnevaks äravooluks oleks vaja kogumissüsteemi. Dihhotoomiliselt hargnenud kogumiskanalite võrk koondab üksiku neeru ~ 1 miljoni nefroni väljundi ühte kusejuhasse [60]. Kogumiskanalid mitte ainult ei transpordi filtraati, vaid osalevad ka vee reabsorptsioonis ja elektrolüütide tasakaalus erinevate transporterite ja kanalite kaudu selle erinevat tüüpi torukujulistes epiteelirakkudes. Kogumiskanalid on kuseteede punga hargneva morfogeneesi saadus, mida kontrollivad erinevad molekulaarsed signaalid, mida saab selle protsessi jäljendamiseks kasutada in vitro, sealhulgas FGF, GDNF/RET ja Wnt signaalirajad [68].

Neeru arengu uuringud, milles kasutati mikrodissekteeritud hiire MM-i ja UB-d, annavad olulise ülevaate täiskasvanud inimese neerude varasest moodustumisest. Indutseerimata MM, mis on eraldatud UB epiteeli struktuuridest, takistab kummagi koe küpsemist. MM ja UB kooskultuur ex vivo on aga võimeline taastama hiire neeru, mis viitab sellele, et nendel neerude prekursorite populatsioonidel on iseseisev programm, mis on piisav neeru organogeneesi juhtimiseks [80]. Arengu vaatenurgast hõlmab optimaalne meetod funktsionaalse neerukoe arendamiseks hPSC-dest in vitro tõenäoliselt MM-i ja UB-i eraldi esilekutsumist kõrge efektiivsusega ja kahe erineva populatsiooni kooskultuuri.

Eelnevalt kirjeldatud diferentseerimisprotokollid genereerivad valdavalt MM-i, mis on mõeldud muutuma nefronistruktuurideks. Suunatud diferentseerimine UB kanalite eellasrakkude kogumisele avaldati esmakordselt 2013. aastal, enne kui Taguchi kirjeldas MM-i ja UB erinevaid IM-i päritolu. Xia et al. konverteeris hPSC-d mesodermaalseks koeks, kasutades FGF2 ja BMP4 2 päeva jooksul, seejärel indutseeris UB eellasrakud, kasutades aktiviini, BMP2 ja retinoehappe kombinatsiooni veel 2 päeva kaheetapilise diferentseerumisprotokolli alusel [81, 82]. hPSC-st pärinevad UB eellasrakud kogunesid ise liikidevaheliseks kimäärseks koeks, kui neid kombineeriti embrüonaalse hiire MM-iga. Taguchi et al., analüüsides 2017. aastal geeniekspressiooniprofiile kuseteede pungade arengu ajal hiire embrüote puhul. on loonud protokolli nii MM-i kui ka UB-koe kaasamiseks neeru organoididesse, kasutades hiire ESC-sid (mESC-sid) [83]. See protokoll põhines FACS-sorteerimisel CXCR4 pluss KIT pluss Wolffiani kanali eellasrakkudel. Wolffi kanali eellasrakkude kooskultuur koos mESC-st tuletatud MM-ga nõudis strooma eellasrakkude olemasolu, et moodustada uuesti kokkupandud organoidid, mis läbisid kõrgema järgu organogeneesi, moodustades hargneva kusejuha epiteeliga omavahel ühendatud nefronid. Lõppkokkuvõttes ei korratud tulemusi hPSC-st saadud MM-is ja UB-s UB hargnemise enneaegse lakkamise tõttu, mis autorite arvates võib olla tingitud stromaalse eellaskogumi puudumisest [83]. Suunatud diferentseerumise loomine inimese neeru strooma eellasrakkudega ja suurenenud juurdepääs inimese loote primaarsetele neerukudedele võib tuvastada teatatud mittetäieliku hargneva morfogeneesi põhjuse. Siiski võib nõutava rakutüübi induktsiooni efektiivsuses olla piiranguid, nimelt prolifereeruvad Ret pluss UB tipurakud, mis vastutavad hargnemise ja struktuurse sideme moodustamise eest distaalsete nefronite ühendustuubulitega [84].

UB ja selle derivaatide suhtes on hPSC-de suunatud diferentseerimisprotokolle vähe, kusjuures avaldatud protokollid näitavad piiranguid. Täiustatud protokollid on vajalikud, et võimaldada kogumiskanalite võrgu lisamist, mis hõlmaks kõiki nefroone sisaldavaid neeruorganoide. Sarnaselt SIX2 ekspressioonil põhinevate NPC-de induktsioonitõhususe maksimeerimisega on üks selline strateegia UB-otsarakkude induktsioonitõhususe maksimeerimine Ret-ekspressioonil põhinevates. Selleks on vaja mõista neerude arengut. Eelkõige moodustub UB Wolffi kanali (teise nimega mesonefriline kanal) väljavooluna, mis tekib eesmiste IM-rakkude kaudaalsel migratsioonil urogenitaalsiinusest alla kloaaki, märkides, et need rakud läbivad teel MET-i. UB-i pöördeline päritolu seab väljakutse tugeva suunatud diferentseerimisprotokolli loomisele. Kuid aIM-is esinevad Ret-ekspresseerivad mesenhümaalsed rakud on võimelised UB-le kaasa aitama [84], nii et 3-sammuprotokoll võib muuta hPSC-d varajaseks primitiivseks triibuks (samm 1), seejärel aIM-iks (samm 2) , seejärel Ret pluss UB otsa rakud (samm 3). Nimelt sisaldab NIH-i ReBuilding a Kidney (RBK) konsortsiumi mobiilsidehoidla Ret reporteriliini

Järeldus

Neerud on tähelepanuväärne organ, mis muu hulgas reguleerib organismi vee ja elektrolüütide homöostaasi. Nende protsesside reguleerimata jätmine võib põhjustada tõsiseid terviseprobleeme, millel on suur ühiskondlik ja majanduslik koormus. In vivo inimese nefrogeneesi mõistmise kaudu heidame valgust selle protsessi in vitro kapituleerimisele. Praegused edusammud on võimaldanud luua hiPSC-st tuletatud neeruorganoide. Need neeruorganoidid meenutavad inimese neeru ja pakuvad tavapäraste uurimismudelitega võrreldes täiendavaid eeliseid. Neeruorganoidide kasutamine hõlmab regeneratiivset meditsiini ning arengu-, toksilisuse- ja haigusmudeleid. Vaatamata viimaste aastate edusammudele vajavad neeruorganoidid paremaid protokolle ja modifikatsioone kudede küpsemise, perfuseeritava veresoonkonna ja kogumissüsteemi integreerimise suunas. Järgmiseks peavad need süsteemid sobima, et pakkuda tavapärastele raku- ja loomauuringute mudelitele lisaväärtust või neid isegi asendada. Organoidide genereerimisprotokollide täiustamine meie kasvavate teadmiste kaudu neerude arengust koos kiibil oleva elundi tehnoloogia omaksvõtuga võib hõlbustada ja kiirendada neerude 3D organoidide ülekandmist kliiniliseks kasutamiseks.

Alates: '3D-neeruorganoidid pingist voodisse tõlkimiseks', autorNavin Gupta et al

---J Mol Med (2021) 99:477–487