Zika viiruse mittestruktuurne valk 4B interakteerub DHCR7-ga, et hõlbustada viirusnakkust

ABSTRAKTNE

Zika viirus (ZIKV) arendab mittestruktuurseid valke, et vältida immuunvastust ja tagada tõhus replikatsioon peremeesrakkudes. Hiljuti teatati, et kolesterooli metaboolne ensüüm 7-dehüdrokolesteroolreduktaas (DHCR7) mõjutab kaasasündinud immuunvastuseid ZIKV-nakkuse korral. Kuid DHCR7-vahendatud viiruse vältimises osalevad olulised mittestruktuursed valgud ja mehhanismid pole hästi välja selgitatud. Selles uuringus näitasime, et ZIKV infektsioon hõlbustas DHCR7 ekspressiooni. Eelkõige soodustas ülesreguleeritud DHCR7 omakorda ZIKV nakatumist ja DHCR7 blokeerimine pärssis ZIKV infektsiooni. Mehaaniliselt interakteeris ZIKV mittestruktuurne valk 4B (NS4B) DHCR7-ga, et indutseerida DHCR7 ekspressiooni. Lisaks pärssis DHCR7 TANK-siduva kinaasi 1 (TBK1) ja interferooni reguleeriva faktori 3 (IRF3) fosforüülimist, mille tulemusel vähenes beeta-interferoon (IFN-) ja interferooniga stimuleeritud geenide (ISG) tootmine. Seetõttu teeme ettepaneku, et ZIKV NS4B seostuks DHCR7-ga, et represseerida TBK1 ja IRF3 aktivatsiooni, mis omakorda pärsib IFN- ja ISG-sid, hõlbustades seeläbi ZIKV-st kõrvalehoidmist. See uuring avardab teadmisi selle kohta, kuidas viiruslikud mittestruktuursed valgud antagoniseerivad kaasasündinud immuunsust, et hõlbustada viirusnakkust kolesterooli metaboolsete ensüümide ja vaheühendite kaudu.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

1. Sissejuhatus

Sääskede kaudu leviva flaviviirusena tuvastati Zika viirus (ZIKV) algselt 1947. aastal Ugandas asuvast reesusmakaagist. ZIKV epideemiast on maailmas mitu puhangut saanud kumulatiivne ülemaailmne terviseoht tänu sääskede plahvatuslikule levikule ja ülemaailmsele reisimisele. asümptomaatilised transportijad ja seksuaalne ülekanne. Enamik ZIKV-nakkusi eelmiste epideemiate ajal olid asümptomaatilised või kerged (Wang et al., 2016), kuid viimastel epideemiatel on ZIKV-nakkus põhjustanud laastavaid haigusi, sealhulgas neuroloogilisi tagajärgi raseduse ajal (mikrotsefaalia ja loote surm) ja neuroloogilisi häireid. (Guillain-Barre sündroom) täiskasvanutel (Cao-Lormeau et al., 2016; Pierson ja Diamond, 2020; Rasmussen et al., 2016). Kaasasündinud immuunsüsteem on peremehe immuunkaitse esimene ja kriitiline liin viirusnakkuse vastu. Pärast ZIKV-nakkust tuvastas viiruse RNA intratsellulaarne retinoehappega indutseeritav geen I (RIG-I) (Chazal et al., 2018; Hertzog jt, 2018; Kato jt, 2006), mis käivitas allavoolu kaasasündinud immuunsüsteemi. vastused, sealhulgas TANK-i siduva kinaasi 1 (TBK1) aktiveerimine, interferooni reguleeriva faktori 3 (IRF3) fosforüülimine ja seejärel I tüüpi interferoonide (IFN-I) tootmine (Fitzgerald et al., 2003; Grant et al., 2016; Xia et al., 2018) ja kümnete erinevate viirusevastaste toimetega interferooniga stimuleeritud geenide (ISG) ekspressioon (Savidis et al., 2016; Schneider et al., 2014). Peremeesorganismi immuunsüsteem toodab viirusinfektsiooni piiramiseks IFN-e ja ISG-sid, kuid ZIKV ise arendas välja mitmesuguseid põgenemismehhanisme, et tagada edukas ellujäämine ja replikatsioon peremeesrakus, näiteks kodeerides spetsiifilisi mittestruktuurseid (NS) valke. ZIKV genoomne RNA genereerib seitset mittestruktuurset valku, sealhulgas NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B ja NS5 (Berthoux, 2020). ZIKV NS1 värbab peremees-deubikvitinaasi USP8, et stabiliseerida kaspaas-1 ja nõrgendada I tüüpi IFN-i signaaliülekannet, et saada kasu ZIKV infektsioonist (Zheng et al., 2018). On teatatud, et mutantne NS1 seondub TBK1-ga ja vähendab TBK1 fosforüülimist, mis viib IFN-i tootmise vähenemiseni (Xia et al., 2018). ZIKV NS3 seondub ja eraldab inimese karkassi valke (14-3-3ε ja 14-3-3η) (Riedl et al., 2019), samas kui NS4A interakteerub MAVS-iga, et nõrgendada RIG-I- ja MDA-d{50} }vahendatud kaasasündinud immuunvastused (Ma et al., 2018). Nimelt seob ja lagundab ZIKV NS5 signaalimuundurit ja transkriptsiooni 2 aktivaatorit (STAT2), et nõrgendada I tüüpi IFN signaaliülekannet (Grant et al., 2016; Kumar et al., 2016). Lisaks on tõestatud, et NS5 interakteerub RIG-I-ga ja pärsib RIG-I K{59}}-seotud polüubikvitinatsiooni, pärssides seeläbi IFN-i tootmist (Li et al., 2020). Lisaks on näidatud, et ZIKV NS2A, NS2B, NS4A ja NS4B võidavad IFN-i tootmise, sihites RIG-I raja diskreetseid elemente (Xia et al., 2018). Imetajarakkudes tõhusa replikatsiooni saavutamiseks tugineb ZIKV ka peremeesraku lipiidide metaboolsetele komponentidele, et moodustada ümbris ja täielik viirusosakeste komplekt (Chen et al., 2020; Leier et al., 2020). Kolesterool on üks rakumembraanide lipiidkomponente ja osaleb mitmetes bioloogilistes funktsioonides (Ikonen, 2008). Rakulise kolesterooli homöostaasi moduleerib tihedalt kolesterooli süntees, sealhulgas imendumine lipoproteiini osakestest ja vabanemine rakuvälistesse aktseptoritesse. Peaaegu kõik imetajate rakud sõltuvad kolesterooli metabolismist (Luo et al., 2020). Kogunev tõendusmaterjal on näidanud, et kolesterooli metabolism osaleb kaasasündinud immuunvastuses viirusnakkuse vastu (Blanc jt, 2013; Petersen et al., 2014; York jt, 2015). Viirusinfektsiooni korral muutus kolesterooli süntees märkimisväärselt ja sellega kaasnes IFN-I ja ISG-de suurenenud ekspressioon makrofaagides (Li et al., 2017; Liu et al., 2008; York et al., 2015). Kolesterooli -25-hüdroksülaas (CH25H) muudab kolesterooli metabolismi võtmeensüümina kolesterooli 25-hüdroksükolesterooliks (25HC), mis on kindlaks tehtud kui bioloogiline toode, mis aitab kaasa kaasasündinud immuunvastuse tekkele enamiku vastu. viirused, sealhulgas inimese immuunpuudulikkuse viirus 1 (HIV-1), vesikulaarse stomatiidi viirus (VSV), herpes simplex viirus 1 (HSV-1), Ebola viirus (EBOV), ZIKV, hiire gammaherpesviirus ( MHV68), Rifti oru palaviku viirus (RVFV) ja Venemaa kevadsuvise entsefaliidi viirus (RSSEV) (Blanc et al., 2013; Li et al., 2017; Liu et al., 2013). Praegused uuringud on piiratud selle uurimisega, kuidas kolesterooli ainevahetusproduktid (nt 25HC) võivad signaaliülekandega manipuleerida ja kaasasündinud immuunsuses osaleda. Praeguseks ei ole kolesterooli biosünteesi ülesvoolu ensüüme või vaheühendeid ikka veel hästi välja selgitatud. Olulise kolesterooli metaboolse ensüümina võib 7-dehüdrokolesterooli reduktaas (DHCR7) kustutada steroolide B ringis C (7–8) kaksiksideme ja katalüüsida kolesterooli 7-dehüdrokolesteroolist ({{100} }DHC) (Luu et al., 2015). 7-DHC on ka D-vitamiini eelkäija ja DHCR7 mutatsioonid on seotud kõrgema D-vitamiiniga, mis viitab sellele, et DHCR7-l on kolesterooli ja D-vitamiini muundamisel keerulised bioloogilised toimed (Kuan et al., 2013; Prabhu et al. , 2016a). Hästi esitatud uuring on näidanud, et DHCR7 vaikus võib aktiveerida PI3K-AKT3 raja, mis viib IRF3 Ser385 fosforüülimiseni ja soodustab IFN tootmist, et pärssida mitme viirusinfektsiooni in vitro ja in vivo (Xiao et al., 2020). Arusaam DHCR{116}}vahendatud kolesterooli metabolismist ZIKV NS-i valgu vahendatud immuunvastusest on aga halvasti määratletud. Siin selgitame selget mehhanismi, mille ZIKV NS4B sihib kolesterooli sünteesi võtmeensüümi DHCR7-le, et nõrgendada IFN-I vastust ja hõlbustada ZIKV infektsiooni. Leidsime, et ZIKV-infektsioon suurendas DHCR7 ekspressiooni. Huvitav on see, et täiustatud DHCR7 soodustab ZIKV-nakkust, samas kui DHCR7 löömine või sihtimine inhibiitoritega võib ZIKV-nakkust pärssida. Lisaks võib ZIKV NS4B siduda DHCR7 ja seega indutseerida DHCR7 ekspressiooni, mis inhibeeris TBK1 ja IRF3 aktivatsiooni ning vähendas IFN- ja ISG tootmist. Seetõttu teeme ettepaneku, et ZIKV NS4B seondumine DHCR7-ga vähendab IRF3 aktivatsiooni, mis omakorda pärsib IFN- ja ISG-sid, et hõlbustada ZIKV-st kõrvalehoidmist. See uuring avardab uudseid teadmisi selle kohta, kuidas ZIKV mittestruktuurne valk kaotab kaasasündinud immuunsuse, et hõlbustada viirusnakkust kolesterooli metaboolsete ensüümidega suhtlemise kaudu.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Cistanche Enhance Immunity toodete vaatamiseks klõpsake siin

【Küsi lisa】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Rakuliinid

U251 rakud osteti Hiina tüübikultuuride kogumise keskusest (CCTCC) (Wuhan, Hiina). Cercopithecus aethiops neeru (Vero) rakud, inimese embrüonaalse neeru (HEK 293T) rakud ja inimese kopsu adenokartsinoomi (A549) rakud osteti Ameerika koekultuuride kollektsioonist (ATCC). Rakke hoiti Dulbecco modifitseeritud kotkasöötmes (DMEM) (Gibco), millele oli lisatud 10% veise loote seerumit (FBS) (Gibco), penitsilliini (100 U/ml) ja streptomütsiinsulfaati (100 ug/mL) temperatuuril 37 °C ja 5 °C. % CO2. Aedes albopictus (C6/36) rakke kultiveeriti minimaalses olulises söötmes (MEM), millele oli lisatud 10% FBS-i, penitsilliini (100 U/ml) ja streptomütsiinsulfaati (100 ug/ml) 28 °C juures 5% CO2-ga.

2.2. ZIKV võimendamine, tiitrimine ja nakatumine

ZIKV isolaati z16006 (GenBank registreerimisnumber, KU955589.1) kultiveeriti C6/36 rakkudes ja ZIKV alikvootideks jaotati külmutusviaalidesse ja säilitati temperatuuril 80 °C. ZIKV tiitreid mõõdeti naastude analüüsiga. Rakke nakatati ZIKV-ga näidatud infektsiooni kordsusega (MOI) 2 tundi, millele järgnes pesemine fosfaatpuhversoolaga (PBS) ja seejärel kultiveeriti, koguti ja uuriti.

2.3. Plasmiidid ja reaktiivid

Ekspressiooniplasmiidi pcDNA3.1(þ)-3 Flag kasutati üksikute ZIKV geenide kloonimiseks ZIKV cDNA vastavatest fragmentidest. pGEX6p-1-NS4B konstrueerimiseks subklooniti ZIKV NS4B vektorisse pGEX6p-1, kasutades ClonExpress II One Step Cloning Kit'i (Vazyme Biotech, Nanjing, Hiina). Inimese DHCR7, RIG-I, TBK1 ja IRF3 kodeerivad cDNA-d, mis olid kloonitud pCAGGS-HA vektorisse või pcDNA3.1 (þ)-3 Flag vektorisse, konstrueeriti standardse molekulaarse kloonimise meetodiga. DHCR7 missense mutatsioon G410S konstrueeriti saidipõhise mutageneesi meetodil. Monoklonaalne küüliku ZIKV-vastane ümbrik (GTX133314) osteti ettevõttelt GeneTex (Irvine, CA, USA). Küüliku polüklonaalne anti-DHCR7 (A8049), küüliku monoklonaalne anti-ISG15 (A2416), küüliku monoklonaalne anti-TBK1 (A3458), küüliku monoklonaalne anti-P-TBK1 juures Ser172 (AP1026), küüliku polüklonaalne anti-IRF3 (A1118), -küüliku IgG (ac005) ja hiirevastane IgG (ac011) osteti ettevõttest ABclonal Technology (Wuhan, Hiina). Hiirevastased FITC ja küüliku Cy3-vastased sekundaarsed antikehad osteti ettevõttelt Abbkine (Wuhan, Hiina). Küüliku monoklonaalne anti-P-IRF3 ser396 (29047S) ja küüliku monoklonaalne anti-ISG56 (14769S) osteti ettevõttest Cell Signaling Technology (CST, Boston, MA, USA). Hiire monoklonaalne anti-Flag (F3165), küüliku monoklonaalne anti-HA (H6908) ja hiire monoklonaalne anti-GAPDH (G9295) osteti firmalt Sigma (St Louis, MO, USA). Hiire monoklonaalne antiflaviviiruse rühma antigeen-antikeha (MAB10216) osteti ettevõttelt Millipore (Mass, USA). Lipofectamine 2000 (11668-027) ja Trizol (15596018) osteti ettevõttelt Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA). Poly(I:C) osteti ettevõttest InvivoGen (San Diego, CA, USA).

2.4. Naastude analüüs

ZIKV-d sisaldav supernatant lahjendati seerumivaba DMEM-iga ja nakatati Vero rakud 12-süvendiga plaadil 2 tundi, millele järgnes pesemine kaks korda 1 ml PBS-ga. DMEM, mis sisaldas 2% FBS-i ja 2% madala sulamistemperatuuriga agaroosi, segati hästi mahusuhtes 1:1 ja igasse süvendisse lisati 1 ml segu. Nakatunud rakke kultiveeriti 37 °C juures 5% CO2-ga 5–7 päeva. Rakud fikseeriti 4% paraformaldehüüdiga 1 tund ja värviti 0,5% kristallvioletiga 30 minutit. 12-Kaevuplaati pesti veega ja naastud arvutati.

2.5. Lentiviiruse tootmine ja nakatumine

Inimese DHCR7 jaoks olid shRNA-de sihtjärjestused järgmised: sh-DHCR7-1: 50 -ATTGCCAGCACAGACGGATTT-30, sh-DHCR7-2: 50 -CGTGATTGACTTCTTCTGGAA{ {8}}. Negatiivse kontrolli jaoks segatud shRNA-d (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) või spetsiifilist sihtjärjestust sisaldav pLKO.1 vektor transfekteeriti HEK293T rakkudesse koos psPAX2 ja pMD2.G lipofektamiiniga 2{19} }00. Supernatante sisaldavad viiruseosakesed koguti 36 tundi pärast transfektsiooni ja seejärel tsentrifuugiti 210 g juures 10 minutit. Rakuvaba supernatandi faas filtriti rakujäätmete eemaldamiseks läbi 0, 45 μm filtri. U251 rakud nakatati lentiviiruse osakestega 8 ug/ml polübreeni juuresolekul. Pärast 48-tunnist kultiveerimist valiti U251 rakud puromütsiiniga (2 ug/ml, Sigma). Sh-DHCR7 hävitamise efektiivsus määrati RT-PCR ja Western blot analüüsiga.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

2.6. Western blot

Rakud lüüsiti RIPA puhvriga, millele oli lisatud proteaasi inhibiitoreid ja fosfataasi inhibiitoreid, jääl 1 tund, seejärel tsentrifuugiti 4 °C, 13, 000 g juures 1{{10}} min rakkude kogumiseks. lüsaat. Valgu kontsentratsiooni rakulüsaadis mõõdeti bitsinhoniinhappe (BCA) valgu testiga. Valk eraldati SDS-PAGE abil ja kanti seejärel polüvinüüldifluoriid (PVDF) membraanile. PVDF-i membraan blokeeriti 1 tunni jooksul immunoblot-blokeerimispuhvriga TBST (10 mmol/L Tris-HCl, pH 7,4, 0,15 mol/L NaCl ja 0,05% Tween-20), mis sisaldas 5% BSA-d. Pärast TBST-ga pesemist inkubeeriti membraani primaarsete antikehade ja teiste antikehadega ning seejärel tuvastati kemiluminestsentskujutise süsteemi (Bio-Rad) abil.

2.7. Üldkolesterooli analüüs

Üldkolesterool rakkudes tuvastati, kasutades Applygen Technologies Inc. (Peking, Hiina) koe üldkolesterooli analüüsi komplekti. Standardkõvera joonestamiseks lahjendati 5 mmol/l kolesteroolistandardi seeriaviisiliselt veevaba etanooliga ja rakkude üldkolesterooli kogused arvutati standardkõverate järgi. Katse viidi läbi vastavalt tootja poolt ette nähtud protseduurile.

2.8. Kaasimmunosadestamise testid

HEK293T rakud transfekteeriti näidatud plasmiididega. Rakud koguti ja lüüsiti RIPA lüüsipuhvriga, millele oli lisatud proteaasi inhibiitoreid. Pärast tsentrifuugimist 18, 000 g juures 15 minutit temperatuuril 4 °C koguti rakulüsaadid ja immunosadestati Flag-Trap ProteinG Sepharose'iga (GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA) 4 tundi temperatuuril 4 °C. Seotud valgud elueeriti 2 laadimispuhvriga ja analüüsiti immunoblotanalüüsiga.

2.9. Reaalajas PCR

Kogu RNA-d ekstraheeriti rakkudest, kasutades TRIzol reagenti (Invitrogen Life Technologies) ja cDNA toodeti M-MLV pöördtranskriptaasi komplektiga (Promega, Madison, WI, USA). RT-PCR viidi läbi, kasutades SYBR RT-PCR komplekte (DBI Bio-science) seadmel Roche LC480. Glütseraldehüüd-3-fosfaatdehüdrogenaasi (GAPDH) mRNA määrati endogeenseks võrdlusaluseks mRNA-de normaliseerimiseks ja geeniekspressiooni tasemed arvutati 2 ΔΔCT meetodil. RT-PCR praimerite järjestused on näidatud täiendavas tabelis S1. 2.10. Konfokaalne mikroskoopia

U251 rakud transfekteeriti plasmiidiga ja kultiveeriti 3 0 tundi, seejärel pesti kolm korda PBS-ga. Rakud fikseeriti 4% paraformaldehüüdiga 15 minutit ja immutati 5 minutiks PBS-iga, mis sisaldas 0,1% TritonX-100. Pärast pesemist PBS-ga suleti rakud 30 minutiks PBS-ga, mis sisaldas 5% BSA-d. Rakke pesti kolm korda PBS-ga ja inkubeeriti anti-HA, anti-FLAG ja anti-flaviviirusega, seejärel inkubeeriti anti-hiire FITC ja anti-küüliku Cy3 sekundaarsete antikehadega. Rakud värviti 40,6-diamidino-2-fenüülindooldivesinikkloriidiga (DAPI) ja viidi läbi Olympuse konfokaalse mikroskoobi abil.

2.11. GST rippanalüüsid

Plasmiid pGEX6p-1-NS4B transfekteeriti Escherichia coli (E. coli) tüvesse BL21. GST ja GST-NS4B indutseeriti IPTG-ga lõppkontsentratsiooniga 0,5 mmol/L ja kultuure kasvatati veel 6–8 tundi temperatuuril 37 °C. Ja seejärel GST valk ja GST- NS4B valk puhastati E. coli bakteritest. GST või GST-NS4B valku inkubeeriti glutatioon Sepharose helmestega (Novagen) ja pesti kolm korda PBS-ga. GST ja GST-NS4B valku inkubeeriti 4 tundi temperatuuril 4 C eukarüootse liitvalguga HA-DHCR7, mis pärines HA-DHCR ekspresseeritud HEK293T rakulüsaate kodeerivatest plasmiididest. Sademeid pesti viis korda, keedeti 2 SDS laadimispuhver ja tuvastati Western blot meetodil anti-GST ja anti-HA antikehadega.

2.12. HA-DHCR7 saidile suunatud mutagenees

Sobivad mutageensete praimerite paarid (täiendav tabel S1) sünteesiti ja neid kasutati muteeritud konstrukti genereerimiseks PCR abil. PrimeSTAR® HS Premixi (Takara) mallina kasutati HA-DHCR7. Pärast PCR-i lõigati PCR-produkti jäänud metsiktüüpi plasmiid selektiivselt DpnI-ga (New England Biolabs). Seeditud PCR produkt transfekteeriti E. coli tüvesse DH5. Soovitud mutant kinnitati Sangeri järjestuse analüüsiga.

cistanche taime suurendav immuunsüsteem

2.13. Statistiline analüüs

Kõiki katseid korrati vähemalt kolm korda sarnaste tulemustega. Andmed on väljendatud keskmise standardhälbena (SD). Varieeruvuse olulisus määrati kindlaks Studenti kahesuunalise paaritu t-testiga kahe rühma või ühesuunalise ANOVA jaoks koos Dunnetti mitme võrdluse testiga või kahesuunalise ANOVA ja Sidaki mitme võrdluse testiga mitme grupi võrdluse jaoks, kasutades tarkvara GraphPad Prism (versioon 8.0.1). Väärtust P < 0.{{10}}5 peeti statistiliselt oluliseks ja P > 0.05 loeti statistiliselt ebaoluliseks. Kõigi andmete puhul esitati olulisus kui *P <0,05, **P <0,01 ja ***P <0,001.

3. Tulemused

3.1. ZIKV infektsioon kutsub esile DHCR7 ekspressiooni

Kogunev tõendusmaterjal on näidanud, et kolesterooli metabolism mõjutab peremeesorganismi kaasasündinud immuunvastuseid flaviviiruse infektsiooni vastu, nagu ZIKV ja Dengue viirus (DENV) (Leier et al., 2020; Randall, 2018). DHCR7 kodeerib ensüümi, mis muudab 7-DHC kolesterooliks, mis on viimane etapp kolesterooli biosünteesis (Moebius et al., 1998). Esmalt tuvastasime DHCR7 ekspressiooni ZIKV infektsiooni korral. Inimese astrotsüüt U251 oli nakatunud ZIKV-ga, mis suurendas annusest sõltuvalt DHCR7 ekspressiooni nii mRNA kui ka valgu juures (joonis 1-C). Nähtuse kinnitamiseks uurisime järgmisena DHCR7 ekspressiooni Vero rakkudes ja leidsime, et ZIKV infektsioon indutseeris oluliselt DHCR7 ekspressiooni (joonis 1D-F), mis oli kooskõlas U251 rakkude tulemustega.

cistanche on kasulikud - tugevdab immuunsüsteemi

3.2. DHCR7 sihtimine kutsub esile kriitilise ZIKV-vastase aktiivsuse

DHCR7 mõju hindamiseks ZIKV infektsiooni vastu transfekteeriti U251 ja A549 rakud HA-DHCR7 kodeeriva plasmiidiga ja seejärel nakatati ZIKV-ga (MOI ¼ 1). Tulemused näitasid, et DHCR7 üleekspressioon suurendas oluliselt ZIKV mRNA ekspressiooni (joonis 2A ja B). Eelkõige suurenes DHCR7 valgu kuhjumisega ka ZIKV struktuurse valgu E ekspressioon (joonis 2C ja D). Lisaks viisime läbi naastude analüüsi, kasutades joonisel fig 2C olevat supernatanti ja leidsime, et DHCR7 üleekspressioon suurendas oluliselt naastu moodustavaid ühikuid, võrreldes kontrollrühmaga (joonis 2E ja F). On teatatud, et DHCR7 missense-mutatsioon G410S kaotab ensüümi aktiivsuse (Fitzky et al., 1998; Shim et al., 2004; Witsch-Baumgartner et al., 2000). DHCR7 mõju edasiseks määramiseks ZIKV infektsioonile konstrueerisime järgmisena DHCR7 (G410S) inaktiivse mutandi. Võrreldes DHCR7 metsiktüüpi, võib G410S mutant märkimisväärselt inhibeerida ZIKV infektsiooni (joonis 2G). Vaatluse kinnitamiseks teostasime ka konfokaalse mikroskoopia testi. Nagu on näidatud joonisel 2H, suurendas DHCR7 üleekspressioon ZIKV infektsiooni. Et teha kindlaks, kas endogeense DHCR7 ensüümi aktiivsus on ZIKV nakkuse jaoks kriitiline, kavandasime kaks lühikest juuksenõela RNA-d (shDHCR7-1 ja sh-DHCR7-2), mis on suunatud spetsiifiliselt DHCR7-le ja genereerisime DHCR7-vaigistatud U251 raku. jooned shRNA süsteemiga (joonis 3A). Lõpuks valisime sh-DHCR7-1 selle suurema vaigistuse tõhususe tõttu. Võrreldes rakuliini transdutseeritud kontroll-shRNA-ga, näitasid need DHCR7 knockdown-rakud madalamat vastuvõtlikkust ZIKV-nakkuse suhtes (joonised 3B ja C). Järgmisena kasutasime selektiivset DHCR7 inhibiitorit AY9944, mis takistab 7-DHC muutumist kolesterooliks (Xu et al., 2011), mis on näidanud, et see pärsib DHCR7 ensüümi aktiivsust (Horlick, 1966; Moebius et al., 1998). Võrreldes kontrolliga pärssis AY9944 manustamine annusest sõltuvat ZIKV infektsiooni U251 rakkudes (joonis 3D-F). Vero rakkudes viidi läbi ka naastude analüüs, et hinnata DHCR7 mõjusid ja näidata, et AY9944 võib ZIKV infektsiooni oluliselt maha suruda (joonis 3G ja H). Konfokaalne mikroskoopia näitas, et ZIKV E valk vähenes oluliselt AY9944 juuresolekul (joonis 3I). Need leiud näitasid, et DHCR7 sihtimine võib pärssida ZIKV infektsiooni.

Joonis 1. ZIKV infektsioon indutseerib DHCR7 ekspressiooni. A–F U251 ja Vero rakke nakatati ZIKV-ga (MOI ¼ 0, 1 ja 2) 24 tundi ning ZIKV (A, D) ja DHCR7 (B, E) rakusisesed RNA tasemed määrati RT-PCR koos GAPDH-ga sisekontrollina. DHCR7 ja ZIKV ümbriste suhtelised valgutasemed tuvastati Western blot meetodil (C, F). Andmed pärinevad vähemalt kolmest sõltumatust katsest (keskmine SD) või representatiivsetest andmetest (C, F). Statistiline olulisus arvutati ühesuunalise ANOVA abil koos Dunnetti mitme võrdluse testiga (A, B, D, E). **P < 0.01, ***P < 0,001. SD, standardhälve.

3.3. DHCR7 pärsib TBK1 ja IRF3 aktivatsiooni, et vähendada IFN- ja ISG-de tootmist

Kuna DHCR7 on oluline ensüüm 7-DHC kolesterooliks muundamiseks (Moebius et al., 1998) ja ZIKV infektsioon võib suurendada DHCR7 ekspressiooni, mõõtsime seega ZIKV infektsiooni korral kolesterooli taset. Selgitasime, et ZIKV infektsioonil on vähe mõju kolesterooli sünteesile U251 ja Vero rakkudes (joonis 4A ja B), kuigi DHCR7 suurenes (joonis 1A-D). Arvestades täiustatud DHCR7-d ZIKV-nakkuse korral ja IFN-ide võtmerolli ZIKV-nakkusega võitlemisel, määrasime järgmisena kindlaks DHCR7 mõju IFN-I signaalirajale. Kontroll- ja DHCR{11}}vaigistavad U251 rakud nakatati ZIKV-ga või transfekteeriti polü(I:C-ga) ja uuriti IFN-ekspressiooni. Võrreldes kontrollrühmaga, suurendas ZIKV-nakkus või polü(I:C)-ravi märkimisväärselt IFN-i ekspressiooni DHCR{15}}vaigistavates U251 rakkudes (joonised 4C ja D). ISG-d on interferooni toimete mõjurid ja mängivad olulist rolli kaasasündinud immuunkaitses ZIKV-nakkuse vastu. Samuti näitasime, et DHCR7 blokeerimine võib oluliselt tugevdada ISG15 ja ISG56 ekspressiooni nii mRNA kui ka valgu tasemel (joonis 4 E-J). Järjekindlalt võib ravi DHCR7 inhibiitoriga AY9944 indutseerida IFN-, ISG15 ja ISG56 ekspressiooni (joonis 4K, L). Oluline on see, et inaktiivne mutant G410S võib osaliselt muuta DHCR7 inhibeerivat toimet IFN- ja ISG ekspressioonile (joonis 4M, N). TBK1 ja IRF3 aktiveerimine on IFN-ISG-de indutseerimiseks hädavajalik, seega uurisime järgmisena DHCR7 mõju TBK1 ja IRF3 ekspressioonile ja aktiveerimisele. Näitasime, et DHCR7 mitte ainult annusest sõltuvalt pärssis valgu taset, vaid pärssis ka TBK1 ja IRF3 fosforüülimise taset (joonis 5-C). Veelgi enam, mitteaktiivne mutant G410S muutis mittetäielikult ümber DHCR7 inhibeeriva toime IRF3 ja TBK1 fosforüülimisele (joonis 5D). Vastupidiselt DHCR7 üleekspressiooni leidudele võib AY9944 ravi indutseerida U251 rakus IRF3 ja TBK1 aktivatsiooni (joonis 5E).

3.4. ZIKV NS4B interakteerub DHCR7-ga, et pärssida TBK1 ja IRF3 fosforüülimist

Tõendid on näidanud, et ZIKV arendas spetsiifilisi NS-valke, et hõlbustada tõhusat replikatsiooni peremeesrakkudes, vältides otseselt peremeesorganismi kaasasündinud ja adaptiivset immuunsust paljude diskreetsete mehhanismide kaudu. Tegime kaas-IP testi, et skriinida individuaalset ZIKV NS valku, mis võiks suhelda DHCR7-ga. HEK293T rakud kaastransfekteeriti pCMV-DHCR7-HA-ga ja plasmiidiga, mis ekspresseeris üksikut NS-valku, mis liideti Flag-märgisega. Nagu on näidatud joonisel 6A, seondub DHCR7 ainult NS4B-ga, kuid ei suhtle teiste NS-valkudega. Edasi viidi läbi vastastikused kaas-IP analüüsid ja need näitasid, et NS4B valk interakteerub DHCR7-ga HEK293T rakkudes (joonised 6B ja C). NS4B ja DHCR7 koostoime kinnitamiseks tegime järgmiseks konfokaalse mikroskoobi ja leidsime, et NS4B valk ja DHCR7 valk olid kolokaliseerunud tsütoplasmas (joonis 6D). GST allatõmmatav test näitas veelgi NS4B ja DHCR7 koostoimet (joonis 6E). Lisaks võib NS4B mööduv transfektsioon U251 rakkudes dramaatiliselt esile kutsuda DHCR7 ekspressiooni (joonis 6F). Oluline on see, et NS4B võib annusest sõltuvalt blokeerida nii TBK1 kui ka IRF3 fosforüülimise, mis oli positiivses korrelatsioonis TBK1 ja IRF3 suurenenud aktiveerimisega vastuseks DHCR7-le (joonis 6G ja H). Kuid NS4B üleekspressioon HEK293T rakkudes vähendas oluliselt TBK1 valgu taset, kuid avaldas vähe mõju IRF3 valgule (joonis 6G ja H). Nende tähelepanekute täiendavaks kinnitamiseks transfekteeriti NS4B DHCR7 knockdown U251 rakkudesse ja see avaldas inhibeerivat toimet endogeense valgu ja TBK1 ja IRF3 fosforüülimise tasemetele (joonis 6I). Kokkuvõttes näitasid need tulemused, et ZIKV NS4B suhtles DHCR7-ga ja suurendas DHCR7 ekspressiooni, et blokeerida TBK1 ja IRF3 aktiveerimist ning hõlbustada seejärel ZIKV infektsiooni.

Joonis 2. DHCR7 üleekspressioon soodustab ZIKV replikatsiooni. A-D U251 ja A549 rakke transfekteeriti HA-vektori või HA-DHCR7-ga näidatud kontsentratsioonidel 12 tundi ja seejärel nakatati ZIKV-ga veel 36 tundi. ZIKV RNA tasemed tuvastati RT-PCR abil, kasutades sisekontrollina GAPDH-d (A, B) ning ZIKV ümbriku valgutasemed HA-DHCR7 ja GAPDH tuvastati Western blot meetodil (C, D). E, F Vero rakke nakatati ZIKV-d sisaldava supernatandiga jooniselt 2C 48 tundi, et määrata ZIKV koopiad naastude analüüsiga. G U251 rakke transfekteeriti HA-vektoriga, HA-DHCR7 või HA-DHCR7 (G410S) 12 tundi ja nakatati ZIKV-ga 36 tundi ning ZIKV ümbriku valgutasemed, HA-DHCR7 ja GAPDH tuvastati Western blot abil. H U251 rakke transfekteeriti HA-vektoriga või HA-DHCR7-ga (1 ug) 12 tundi, nakatati ZIKV-ga 36 tundi ja seejärel inkubeeriti hiire anti-flaviviiruse ja küüliku anti-HA antikehadega, pärast värvimist FITC-konjugeeritud hiirevastase ja Cy3-konjugeeritud küülikuvastased sekundaarsed antikehad. Tuumad värviti DAPI-ga. Pildid visualiseeriti konfokaalse mikroskoopia abil. Skaalariba ¼ 100 μm. Andmed pärinevad vähemalt kolmest sõltumatust katsest (keskmine SD) või representatiivsetest andmetest (C, D, E, G, H). Statistiline olulisus arvutati Studenti kahepoolse paaritu t-testi (F) või ühesuunalise ANOVA abil koos Dunnetti mitme võrdluse testiga (A, B). *P < 0,05, ***P < 0,001. SD, standardhälve.

4. Arutelu

I tüüpi IFN-id ja nende allavoolu ISG-d seisavad silmitsi suure hulga patogeenidega ja mängivad otsustavat rolli peremeesorganismi immuunkaitses ZIKV vastu (Lazear et al., 2016). IFN-vahendatud järelevalvest kõrvalehoidmiseks ja piisava replikatsiooni saavutamiseks arendab ZIKV NS-valke, mis on suunatud IFN-i signaaliraja erinevatele punktidele, et põgeneda rakulise kaasasündinud immuunsüsteemi eest (Lee et al., 2021). Paigaldusuuringud on näidanud, et ZIKV NS1, NS3, NS4A ja NS5 inhibeerivad RIG-I/IFN-I raja erinevaid mooduleid ja hõlbustavad viirusnakkust, kasutades sõltumatuid ja erinevaid mehhanisme (Grant et al., 2016; Kumar et al., 2016). Ma et al., 2018; Riedl jt, 2019; Xia jt, 2018; Zheng jt, 2018). Kuid ZIKV NS4B immuunpiirangu vastu võitlemise spetsiifiline mehhanism on halvasti määratletud. ZIKV NS4B on äärmiselt hüdrofoobne valk, mis koosneb 251 aminohappest ja asub endoplasmaatilises retikulumi membraanis N-otsaga (Zou et al., 2014). IFN-I signaaliraja NS4B inhibeerimine on tuvastatud erinevates flaviviirustes (Ding jt, 2013; Munoz-Jordan et al., 2003, 2005; Shan jt, 2021; Yi jt, 2016; Zhang et al. al., 2021). Hiljutine uuring on teatanud, et Brasiilias isoleeritud ZIKV INMI1 tüvi kasutab NS4B-d, et antagoniseerida IFN-I signaaliraja allavoolu, purustades STAT1 fosforüülimise ja katkestades sellest tulenevalt STAT1 tuumatranspordi (Fanunza et al., 2021). Selles uuringus leidsime selge mehhanismi, milles ZIKV NS4B kaotas IFN-i tootmise, surudes alla TBK1 ja IRF3 fosforüülimise, mis on IFN-I signaaliraja ülesvoolu komponent. Nimelt on ZIKV NS4B-s avastatud aminohapete asendus (G18R), mis aitas kaasa IFN-i tootmise vähenemisele ja ISG ekspressiooni nõrgenemisele ning hõlbustas järelikult viirusnakkust hiirtel, mis näitab NS4B olulisust patogeneesi määrajana (Gorman et al. ., 2018). Uued tõendid näitasid kaasasündinud immuunvastuses osalemise kolesterooli metabolismi kriitilist tähtsust (Akula et al., 2016; Dang jt, 2017; Reboldi jt, 2014; York jt, 2015). Kuigi on dokumenteeritud, et mitmetel kolesterooli metabolismi vaheühenditel on laialdane viirusevastane toime (Blanc jt, 2013; Li et al., 2017; Liu jt, 2013; Xiao jt, 2020), näitas meie uuring uudset mehhanismi. et kolesterooli metaboolne ensüüm DHCR7 osales ZIKV infektsioonis, nõrgendades viirusinfektsiooni hõlbustamiseks TBK1 ja IRF3 aktivatsiooni. Desmosterooli ja kolesterooli metabolismis osaleva võtmeensüümina esindab DHCR7 lülitit 7-DHC muundamisel D-vitamiiniks UVB-kiirgusele avatud naharakkudes (Prabhu et al., 2016b). Veelgi enam, DHCR7 ei paikne mitte ainult Blochi raja väravas, vaid ka Kandutsch-Russelli raja lõpus (Prabhu et al., 2016a, 2016b), millel on oluline roll kolesterooli sünteesi kontrollimisel. DHCR7 läbirääkimine ja selle interaktsioon teiste ensüümidega mitmel viisil võib anda erinevatele rakutüüpidele või elunditele mitme funktsiooni. Eelmine uuring on näidanud, et DHCR7 blokeerimine võib vähendada desmosterooli, kolesterooli biosünteesi vahetut eelkäijat, pakkudes seeläbi piisavat kaitset HCV nakkuse eest (Luu et al., 2015; Rodgers et al., 2012). Oluline on see, et Xiao jt. on näidanud, et VSV-nakkus vähendab DHCR7 ekspressiooni, mis viib kolesterooli vähenemiseni, kuid palju rohkem 7-DHC akumuleerumist makrofaagides ja maksas (Xiao et al., 2020). 7-DHC-ga töödeldud makrofaagid suurendasid viirusevastast vastust; samas kui kolesterooli lisamine näitas vähest kaitset. DHCR7 inhibiitorid ja 7-DHC manustamine võivad olla kasulikud meetodid viirusinfektsioonide (nt HIN1, HSV ja VSV) vastu võitlemisel. Selles uuringus leidsime, et DHCR7 inhibiitor AY9944 võib pärssida ZIKV infektsiooni. Kuid meie uuring näitas, et ZIKV infektsioon indutseeris DHCR7 ekspressiooni, kuid sellel oli vähe mõju kolesterooli biosünteesile gliiarakkudes. Me ei uurinud 7-DHC ekspressiooni taset pärast ZIKV infektsiooni infektsioon ajus. DHCR7 üleekspressioon soodustas ZIKV infektsiooni, samas kui DHCR7 selektiivne inhibiitor (AY9944) suurendas tugevalt IFN tootmist ZIKV infektsiooni vastu. TBK1 ja IRF3 aktiveerimine on IFN-I signaalimise käivitamiseks ülioluline. Eelmine uurimine näitas, et DHCR7 vaigistamine või 7-DHC-ravi aktiveeris PI3K-AKT3 raja, et fosforüülida IRF3, kuid mitte TBK1 makrofaagides (Xiao et al., 2020). Sellegipoolest näitasid meie leiud, et DHCR7 vähendas annusest sõltuvalt nii IRF3 kui ka TBK1 ekspressiooni, samuti IRF3 ja TBK1 fosforüülimist. Need uuringud näitasid, et DHCR7 võib kaasa aidata ZIKV infektsioonile kolesterooli metabolismist sõltumatus mehhanismis ajus. On hästi välja selgitatud, et ZIKV kasutas NS-valke, et suhelda RIG-I / IFN-I raja erinevate komponentidega, et vältida immuunvastust ja hõlbustada viiruse replikatsiooni. Varem teatasime ZIKV NS5 interaktsioonist RIG-I-ga IFN-i tootmise nõrgendamiseks (Li et al., 2020). Teised näitasid, et ZIKV NS1 ja NS2B olid suunatud TBK1-le, NS3 sihtmärgiks RIG-I ja MDA5, et vähendada IFN-I ja ISG-de tootmist (Lee et al., 2021; Riedl et al., 2019). Kolesterooli metabolismi sihtivate ZIKV NS-valkude funktsioon on siiski suuresti tabamatu. Selles uuringus oleme illustreerinud ka teatamata koostoimet kolesterooli metaboolse ensüümi DHCR7 ja ZIKV NS valkude vahel. Näitasime, et DHCR7 on spetsiifiliselt seotud NS4B-ga, mitte teiste NS-valkudega. Esitasime kriitilised tõendid selle kohta, et ZIKV NS4B suhtles DHCR7-ga ja indutseeris oluliselt selle ekspressiooni, mis oli kooskõlas U251 rakkude tulemustega ZIKV infektsiooni korral. Oluline on see, et lisaks DHCR7 ja ZIKV NS4B seotuse otsesele demonstreerimisele leidsime ka, et ZIKV NS4B suurendas DHCR7 ekspressiooni, et pärssida TBK1 ja IRF3 fosforüülimist ja hõlbustada ZIKV nakatumist. Kooskõlas meie tulemustega näitas hiljutine uuring, et DHCR7 puudulikkus võib aktiveerida IRF3 ja IFN-signaali, et inhibeerida VSV-d ja teisi viiruseid makrofaagides.

Joon. 3. Knockdown DHCR7 vähendab ZIKV infektsiooni U251 rakkudes. U251 rakud transdutseeriti lentiviiruse osakestega, mis sisaldasid shRNA-d DHCR7 (shDHCR7-1 ja sh-DHCR7-2) või mittesihtjärjestuse (sh-NTC) vastu, millele järgnes puromütsiini selektsioon 14 päeva jooksul. Knockdowni efektiivsus määrati RT-PCR abil. B, C DHCR{11}}vaigistavad U251 (sh-DHCR7) ja sh-NTC U251 rakud olid 36 tunni jooksul nakatatud või ZIKV-ga nakatunud (MOI ¼ 1). Intratsellulaarne ZIKV RNA tase tuvastati RT-PCR-ga, kasutades sisekontrollina GAPDH-d (B) ning ZIKV ümbriku, DHCR7 ja GAPDH valgutasemed tuvastati Western blot meetodil (C). D, E U251 rakke töödeldi DHCR7 inhibiitoriga AY9944 näidatud kontsentratsioonil 2 tundi, seejärel nakatati ZIKV-ga (MOI ¼ 1) 48 tundi. Rakkudele viidi läbi RT-PCR, et tuvastada ZIKV RNA (D). ZIKV ümbriku, DHCR7 ja GAPDH valgu tasemed tuvastati Western blot (E) abil. F U251 rakke töödeldi DHCR7 inhibiitoriga AY9944 näidatud kontsentratsioonil 36 tundi ning DHCR7 ja GAPDH tuvastati Western blot abil. G, H Vero rakke nakatati ZIKV-d sisaldava supernatandiga jooniselt 3E 48 tundi, et määrata ZIKV koopiad naastude analüüsiga. I U251 rakke töödeldi AY9944-ga näidatud kontsentratsioonil 2 tundi, seejärel nakatati ZIKV-ga MOI ¼ 1 juures 36 tundi. Pildid visualiseeriti konfokaalse mikroskoopia abil. Skaalariba ¼ 100 μm. Andmed pärinevad vähemalt kolmest sõltumatust katsest (keskmine SD) või representatiivsetest andmetest (C, E, F, G ja I). Statistiline olulisus arvutatakse ühesuunalise ANOVA abil koos Dunnetti mitme võrdluse testiga (A, D, H) või kahesuunalise ANOVA abil Sidaki mitme võrdluse testiga (B). ***P < 0,001. SD, standardhälve.

Joonis 4. DHCR7 inhibeerib IFN- ja ISG tootmist. A, B U251 ja Vero rakke nakatati 24 tunni jooksul ZIKV-ga (MOI ¼ 0, 0,5 ja 1) ning rakulist kolesterooli mõõdeti koe üldkolesterooli analüüsikomplektiga. C-H DHCR{9}}vaigistavad U251 (sh-DHCR7) ja sh-NTC U251 rakud nakatati ZIKV-ga (MOI ¼ 1) või töödeldi polü(I:C)-ga (1 ug/ml) 6 tundi. Kogu raku RNA ekstraheeriti ja allutati RT-PCR-ile mRNA ekspressiooniks, kasutades sisekontrollina GAPDH-d. IFN- ja ISG-de suhtelised ekspressioonid normaliseeriti näidisrühma sh-NTC proovide omaga ja voltide muutused olid ebaolulised. IFN- (C, D), ISG15 (E, F) ja ISG56 (G, H). I, J DHCR7-vaigistavad U251 (sh-DHCR7) ja sh-NTC U251 rakud nakatati 24 tunni jooksul ZIKV-ga (MOI ¼ 1) või transfekteeriti Poly(I:C)-ga (1 ug/mL), ja ISG15, ISG56 ja GAPDH valgu tasemed tuvastati Western blot abil. K U251 rakke töödeldi näidatud annusega AY9944 2 tundi, seejärel nakatati ZIKV-ga (MOI ¼ 1) 6 tundi. IFN-RNA tase tuvastati RT-PCR abil, kasutades sisekontrollina GAPDH-d. L U251 rakke töödeldi näidatud annusega AY9944 2 tundi ja seejärel nakatati ZIKV-ga (MOI ¼ 1) 24 tundi. ISG15, ISG56 ja GAPDH valgu tasemed tuvastati Western blot abil. M U251 rakke transfekteeriti HA-vektoriga, HA-DHCR7 või HA-DHCR7 (G41{75}}S) 24 tundi ja nakatati ZIKV-ga (MOI ¼ 1) 6 tundi. IFN-RNA tasemed tuvastati RT-PCR abil, kasutades sisekontrollina GAPDH-d. N U251 rakku transfekteeriti HA-vektoriga, HA-DHCR7 või HA-DHCR7 (G410S) 24 tundi ja seejärel nakatati ZIKV-ga (MOI ¼ 1) 24 tundi. ISG15, ISG56 ja GAPDH valgu tasemed tuvastati Western blot abil. Andmed pärinevad vähemalt kolmest sõltumatust katsest (keskmine SD) või representatiivsetest andmetest (I, J, L, N). Statistiline olulisus arvutatakse ühesuunalise ANOVA abil koos Dunnetti mitme võrdluse testiga (A, B, K, M) või kahesuunalise ANOVA abil Sidaki mitme võrdluse testiga (C–H). ns, P > 0,05, ***P < 0,001. SD, standardhälve.

Joonis 5. DHCR7 inhibeerib TBK1 ja IRF3 aktivatsiooni. A, B HEK293T rakud kotransfekteeriti TBK1- kodeeriva plasmiidiga koos DHCR7- ekspresseeriva plasmiidi või tühja vektoriga (A). HEK293T rakud kaastransfekteeriti IRF{10}}kodeeriva plasmiidiga, RIG-I kodeeriva plasmiidiga koos DHCR7- ekspresseeriva plasmiidi või tühja vektoriga (B). Rakud koguti 24 tundi pärast transfektsiooni ja neile tehti Western blot näidatud antikehadega [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti-IRF3, anti-PIRF3 (S396), anti-HA ja anti-GAPDH ]. C U251 rakke transfekteeriti näidatud annuses DHCR7 ekspresseeriva plasmiidi või tühja vektoriga 24 tundi. Seejärel nakatati rakud ZIKV-ga (MOI ¼ 1), mis koguti 6 tundi pärast nakatamist ja viidi läbi Western blot näidatud antikehadega [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti-IRF3, anti-P-IRF3 ( S396), anti-HA ja anti-GAPDH]. D U251 rakke transfekteeriti HA-vektoriga, HA-DHCR7 või HA-DHCR7 (G410S) 24 tundi. Seejärel nakatati rakud ZIKV-ga (MOI ¼ 1), mis koguti 6 tundi pärast nakatamist ja viidi läbi Western blot näidatud antikehadega [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti-IRF3, anti-PIRF3 (S396) , anti-HA ja anti-GAPDH]. E U251 rakke töödeldi näidatud annusega AY9944 2 tundi ja nakatati ZIKV-ga (MOI ¼ 1) 6 tundi, seejärel viidi läbi Western blot näidatud antikehadega [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti. -IRF3, anti-P-IRF3(S396) ja anti-GAPDH]. Andmed pärinevad vähemalt kolmest sõltumatust katsest ja on näidatud representatiivsete andmetena (A–E).

Joonis 6. ZIKV NS4B interakteerub DHCR7-ga, et pärssida TBK1 ja IRF3 fosforüülimist. HEK293T rakud kaastransfekteeriti plasmiididega, mis kodeerivad HA-DHCR7, ja plasmiididega, mis kodeerivad ZIKV mittestruktuurseid valke (FLAG-NS1, FLAG-NS3, FLAG-NS4A, FLAG-NS4B ja FLAG-NS5) või tühja kontrollplasmiidiga 3 jaoks. 0 h. Rakulüsaadid immunosadestati anti-Flag antikehadega ja seejärel analüüsiti immunoblotanalüüsiga näidatud antikehadega. B, C HEK293T rakke kaastransfekteeriti HA-DHCR7 kodeerivate plasmiididega, FLAG-NS4B kodeerivate plasmiididega või tühja kontrollplasmiidiga 30 tundi. Rakulüsaadid immunosadestati anti-HA antikehaga (B) või anti-FLAG antikehaga (C) ja seejärel analüüsiti immunoblotimisega näidatud antikehadega. D U251 rakud transfekteeriti FLAG-NS4B plasmiidiga koos plasmiididega, mis kodeerivad HA-DHCR7. FLAG-NS4B (roheline), HA-DHCR7 (punane), tuumamarkeri DAPI (sinine) ja ühinemise lokaliseerimist analüüsiti konfokaalse mikroskoopiaga. Skaalariba ¼ 10 μm. E HA-DHCR7-ga transfekteeritud HEK293T rakkude rakulüsaate inkubeeriti GST valgu või GST-NS4B valguga, mida inkubeeriti glutatioon-Sepharose helmestega. Segud tuvastati Western blot meetodil anti-HA ja anti-GST antikehadega (ülemine). Transfekteeritud HEK293T rakkude lüsaadid ja puhastatud valgud tuvastati Western blot meetodil anti-HA ja anti-GST antikehadega (alt). F U251 rakud transfekteeriti FLAG-NS4B kodeeriva plasmiidiga (0, 1, 2 ug). DHCR7, FLAG-NS4B ja GAPDH suhtelised valgutasemed tuvastati Western blot abil. G, H HEK293T rakud kotransfekteeriti NS4B-d ekspresseeriva plasmiidi või tühja vektoriga koos TBK1-kodeeriva plasmiidiga (F), IRF3--ekspresseeriva plasmiidiga ja plasmiididega, mis kodeerivad RIG-I (G) . Rakud koguti 24 tundi pärast transfektsiooni ja neile tehti Western blot näidatud antikehadega [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti-IRF3, anti-P-IRF3 (S396), anti-FLAG ja anti-GAPDH ]. I DHCR{83}}vaigistavad U251 (sh-DHCR7) ja sh-NTC U251 rakud transfekteeriti NS4B-d ekspresseeriva plasmiidi või tühja vektoriga. Rakud koguti 6 tundi pärast transfektsiooni ja neile tehti Western blot näidatud antikehadega [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti-IRF3, anti-P-IRF3 (S396), anti-FLAG ja anti-GAPDH ]. Andmed esindavad kolme sõltumatut katset.

5. Kokkuvõtted

Kokkuvõttes näitas eelmine uuring, et kolesterooli metabolismi ensüüm DHCR7 osaleb kaasasündinud immuunvastuses erinevate viirusnakkuste vastu. Meie uuring on näidanud, et ZIKV NS4B suhtles DHCR7-ga ja indutseeris DHCR7 ekspressiooni. Suurenenud DHCR7 pärsib suuresti TBK1 ja IRF3 aktivatsiooni ning vähendab IFN- ja ISG tootmist, mis hõlbustab seega ZIKV nakatumist gliiarakkudes. Need leiud on avastanud uudse viiruse immuunpõgenemismehhanismi, mille kohaselt ZIKV ületab immuunvastuse, suunates otse DHCR7-le NS4B-ga.

Viited

Akula, MK, Shi, M., Jiang, Z., Foster, CE, Miao, D., Li, AS, Zhang, X., Gavin, RM, Forde, SD, Germain, G., Carpenter, S., Rosadini, CV, Gritsman, K., Chae, JJ, Hampton, R., Silverman, N., Gravallese, EM, Kagan, JC, Fitzgerald, KA, Kastner, DL, Golenbock, DT, Bergo, MO, Wang, D ., 2016. Kaasasündinud immuunvastuse kontroll mevalonaadi raja kaudu. Nat. Immunol. 17, 922–929.

Berthoud, L., 2020. Flaviviiruste piiramine. Virol. Patt. 35, 363–377.

Blanc, M., Hsieh, WY, Robertson, KA, Kropp, KA, Forster, T., Shui, G., Lacaze, P., Watterson, S., Griffiths, SJ, Spann, NJ, Meljon, A., Talbot, S., Krishnan, K., Covey, DF, Wenk, MR, Craigon, M., Ruzsics, Z., Haas, J., Angulo, A., Griffiths, WJ, Glass, CK, Wang, Y. , Ghazal, P., 2013. Transkriptsioonifaktor STAT-1 seob 25-hüdroksükolesterooli makrofaagide sünteesi viirusevastase interferooni vastusega. Immunity 38, 106–118.

Cao-Lormeau, V.-M., Blake, A., Mons, S., Lastere, S., Roche, C., Vanhomwegen, J., Dub, T., Baudouin, L., Teissier, A., Larre, P., Vial, A.-L., Decam, C., Choumet, V., Halstead, SK, Willison, HJ, Musset, L., Manuguerra, J.-C., Despres, P., Fournier , E., Mallet, H.-P., Musso, D., Fontanet, A., Neil, J., Ghawche, F., 2016. Guillain-Barre'i sündroomi puhang Zika viirusinfektsiooniga Prantsuse Polüneesias: juhtum - kontrolluuring. Lancet 387, 1531–1539.

Chazal, M., Beauclair, G., Gracias, S., Najburg, V., Simon-Loriere, E., Tangy, F., Komarova, AV, Jouvenet, N., 2018. RIG-I tunneb ära 5' dengue ja Zika viiruse genoomide piirkond. Cell Rep. 24, 320–328.

Chen, Q., Gouilly, J., Ferrat, YJ, Espino, A., Glaziou, Q., Cartron, G., El Costa, H., AlDaccak, R., Jabrane-Ferrat, N., 2020. Metabolic Zika viiruse ümberprogrammeerimine kutsub esile põletiku inimese platsentas. Nat. Commun. 11, 2967. Dang, EV, McDonald, JG, Russell, DW, Cyster, JG, 2017. Kolesterooli sünteesi oksüsterooli piiramine takistab AIM2 inflammasoomi aktivatsiooni. Lahter 171, 1057–1071 e1011.

Ding, Q., Cao, X., Lu, J., Huang, B., Liu, YJ, Kato, N., Shu, HB, Zhong, J., 2013. C-hepatiidi viirus NS4B blokeerib STINGi ja STINGi interaktsiooni TBK1, et vältida peremeesorganismi kaasasündinud immuunsust. J. Hepatol. 59, 52–58.

Fanunza, E., Grandi, N., Quartu, M., Carletti, F., Ermellino, L., Milia, J., Corona, A., Capobianchi, MR, Ippolito, G., Tramontano, E., 2021 INMI1 Zika viirus NS4B antagoniseerib interferooni signaaliülekannet, pärssides STAT1 fosforüülimist. Viirused 13, 2448.

Fitzgerald, KA, McWhirter, SM, Faia, KL, Rowe, DC, Latz, E., Golenbock, DT, Coyle, AJ, Liao, SM, Maniatis, T., 2003. IKKε ja TBK1 on IRF3 signaalimise olulised komponendid rada. Nat. Immunol. 4, 491–496.

Fitzky, BU, Witsch-Baumgartner, M., Erdel, M., Lee, JN, Paik, Y.-K., Glossmann, H., Utermann, G., Moebius, FF, 1998. Mutations in the Δ{{ 3}}steroolreduktaasi geen Smith-Lemli-Opitzi sündroomiga patsientidel. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 8181–8186.

Gorman, MJ, Caine, EA, Zaitsev, K., Begley, MC, Weger-Lucarelli, J., Uccellini, MB, Tripathi, S., Morrison, J., Yount, BL, Dinnon 3., KH, Ruckert, C ., Young, MC, Zhu, Z., Robertson, SJ, McNally, KL, Ye, J., Cao, B., Mysorekar, IU, Ebel, GD, Baric, RS, Best, SM, Artjomov, MN, Garcia -Sastre, A., Diamond, MS, 2018. Zika viirusnakkuse immuunkompetentne hiiremudel. Cell Host Microbe 23, 672-685.e6.

Grant, A., Ponia, SS, Tripathi, S., Balasubramaniam, V., Miorin, L., Sourisseau, M., Schwarz, MC, Sanchez-Seco, MP, Evans, MJ, Best, SM, Garcia-Sastre , A., 2016. Zika viirus on suunatud inimese STAT2-le, et pärssida I tüüpi interferooni signaaliülekannet. Cell Host Microbe 19, 882–890.

Hertzog, J., Dias Junior, AG, Rigby, RE, Donald, CL, Mayer, A., Sezgin, E., Song, C., Jin, B., Hublitz, P., Eggeling, C., Kohl, A., Rehwinkel, J., 2018. Nakatumine Zika viiruse Brasiilia isolaadiga tekitab RIG-I stimuleeriva RNA ja viiruse NS5 valk blokeerib I tüüpi IFN induktsiooni ja signaalimise. Eur. J. Immunol. 48, 1120–1136.

Horlick, L., 1966. Uue kolesterooli biosünteesi inhibiitori (AY 9944) mõju seerumi ja koe steroolidele rottidel. J. Lipid Res. 7, 116–121.

Ikonen, E., 2008. Rakulise kolesterooli kaubitsemine ja lahterdamine. Nat. Rev Mol. Cell Biol. 9, 125–138.

Kato, H., Takeuchi, O., Sato, S., Yoneyama, M., Yamamoto, M., Matsui, K., Uematsu, S., Jung, A., Kawai, T., Ishii, KJ, Yamaguchi , O., Otsu, K., Tsujimura, T., Koh, CS, Reis e Sousa, C., Matsuura, Y., Fujita, T., Akira, S., 2006. Differential roles of MDA5 and RIG-I helikaasid RNA viiruste äratundmisel. Loodus 441, 101–105.

Kuan, V., Martineau, AR, Griffiths, CJ, Hypp€onen, E., Walton, R., 2013. DHCR7 mutatsioonid, mis on seotud kõrgema D-vitamiini staatusega, võimaldasid inimestel varakult rännata põhjalaiuskraadidele. BMC Evol. Biol. 13, 144.

Kumar, A., Hou, S., Airo, AM, Limonta, D., Mancinelli, V., Branton, W., Power, C., Hobman, TC, 2016. Zika viirus inhibeerib I tüüpi interferooni tootmist ja allavoolu signaalimine. EMBO Rep. 17, 1766–1775.

Lazear, HM, Govero, J., Smith, AM, Platt, DJ, Fernandez, E., Miner, JJ, Diamond, MS, 2016. Zika viiruse patogeneesi hiiremudel. Cell Host Microbe 19, 720–730. Lee, LJ, Komarasamy, TV, Adnan, NAA, James, W., Rmt Balasubramaniam, V., 2021. Peida ja otsima: Zika viiruse ja peremeesorganismi immuunvastuse koosmõju. Esiosa. Immunol. 12, 750365.

Leier, HC, Weinstein, JB, Kyle, JE, Lee, JY, Bramer, LM, Stratton, KG, Kempthorne, D., Navratil, AR, Tafesse, EG, Hornemann, T., Messer, WB, Dennis, EA, Metz, TO, Barklis, E., Tafesse, FG, 2020. Ülemaailmne lipiidide kaart määratleb Zika viiruse replikatsiooni jaoks olulise võrgu. Nat. Commun. 11 3652.

Li, A., Wang, W., Wang, Y., Chen, K., Xiao, F., Hu, D., Hui, L., Liu, W., Feng, Y., Li, G., Tan, Q., Liu, Y., Wu, K., Wu, J., 2020. NS5 konservatiivne sait on vajalik Zika viiruse jaoks, et piirata RIG-I signaalimist. Esiosa. Immunol. 11, 51.

Li, C., Deng, YQ, Wang, S., Ma, F., Aliyari, R., Huang, XY, Zhang, NN, Watanabe, M., Dong, HL, Liu, P., Li, XF, Ye, Q., Tian, ​​M., Hong, S., Fan, J., Zhao, H., Li, L., Vishlaghi, N., Buth, JE, Au, C., Liu, Y., Lu , N., Du, P., Qin, FX, Zhang, B., Gong, D., Dai, X., Sun, R., Novitch, BG, Xu, Z., Qin, CF, Cheng, G. , 2017. 25- Hüdroksükolesterool kaitseb peremeesorganismi Zika viirusnakkuse ja sellega seotud mikrotsefaalia eest hiiremudelis. Immunity 46, 446–456.

Liu, CI, Liu, GY, Song, Y., Yin, F., Hensler, ME, Jeng, WY, Nizet, V., Wang, AH, Oldfield, E., 2008. Kolesterooli biosünteesi inhibiitor blokeerib Staphylococcus aureuse virulentsuse . Teadus 319, 1391–1394.

Liu, SY, Aliyari, R., Chikere, K., Li, G., Marsden, MD, Smith, JK, Pernet, O., Guo, H., Nusbaum, R., Zack, JA, Freiberg, AN, Su, L., Lee, B., Cheng, G., 2013. Interferooniga indutseeritav kolesterooli-25-hüdroksülaas inhibeerib laialdaselt viiruse sisenemist 25- 25-hüdroksükolesterooli tootmise kaudu. Immunity 38, 92–105.

Luo, J., Yang, H., Song, BL, 2020. Kolesterooli homöostaasi mehhanismid ja reguleerimine. Nat. Rev Mol. Cell Biol. 21, 225–245.

Luu, W., Hart-Smith, G., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2015. Kolesterooli sünteesi terminaalsed ensüümid DHCR24 ja DHCR7 interakteeruvad füüsiliselt ja funktsionaalselt. J. Lipid Res. 56, 888–897.

Ma, J., Ketkar, H., Geng, T., Lo, E., Wang, L., Xi, J., Sun, Q., Zhu, Z., Cui, Y., Yang, L., Wang, P., 2018. Zika viiruse mittestruktuurne valk 4A blokeerib RLR-MAVS signaaliülekande. Esiosa. Microbiol. 9, 1350. Moebius, FF, Fitzky, BU, Lee, JN, Paik, YK, Glossmann, H., 1998.

Inimese delta{0}}steroolreduktaasi molekulaarne kloonimine ja ekspressioon. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1899–1902.

Munoz-Jordan, JL, Laurent-Rolle, M., Ashour, J., Martinez-Sobrido, L., Ashok, M., Lipkin, WI, Garcia-Sastre, A., 2005. Alfa/beeta-interferooni signaalimise inhibeerimine flaviviiruste NS4B valgu poolt. J. Virol. 79, 8004–8013.

Munoz-Jordan, JL, Sanchez-Burgos, GG, Laurent-Rolle, M., Garcia-Sastre, A., 2003. Inhibition of interferon signaling by dengue virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 14333–14338.

Petersen, J., Drake, MJ, Bruce, EA, Riblett, AM, Didigu, CA, Wilen, CB, Malani, N., Male, F., Lee, FH, Bushman, FD, Cherry, S., Doms, RW, Bates, P., Briley Jr., K., 2014. Andide viirusnakkuse korral on vajalik peamine raku steroolide regulatsioonirada. PLoS patog. 10, e1003911.

Pierson, TC, Diamond, MS, 2020. Tekkivate flaviviiruste jätkuv oht. Nat. Microbiol. 5, 796–812. Prabhu, AV, Luu, W., Li, D., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2016a. DHCR7: oluline ensüümi lüliti kolesterooli ja D-vitamiini tootmise vahel. Prog. Lipid Res. 64, 138–151.

Prabhu, AV, Luu, W., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2016b. Kolesterooli poolt vahendatud 7-dehüdrokolesteroolreduktaasi lagunemine viib tasakaalu kolesteroolilt D-vitamiini sünteesile. J. Biol. Chem. 291, 8363–8373. Randall, G., 2018. Lipiidide tilkade metabolism dengue viirusnakkuse ajal. Trends Microbiol. 26, 640–642.

Rasmussen, SA, Jamieson, DJ, Honein, MA, Petersen, LR, 2016. Zika viirus ja sünnidefektid – põhjusliku seose tõendite läbivaatamine. N. Ingl. J. Med. 374, 1981–1987.

Reboldi, A., Dang, EV, McDonald, JG, Liang, G., Russell, DW, Cyster, JG, 2014. Põletik. 25-Hüdroksükolesterool pärsib interleukiini{2}} põhjustatud põletikku I tüüpi interferoonist allavoolu. Teadus 345, 679–684.

Riedl, W., Acharya, D., Lee, JH, Liu, G., Sherman, T., Chiang, C., Chan, YK, Diamond, MS, Gack, MU, 2019. Zika viirus NS3 jäljendab rakulist { {2}}sidumismotiiv RIG-I- ja MDA{5}}vahendatud kaasasündinud immuunsuse antagoniseerimiseks. Rakuperemees mikroob 26, 493–503 e496.

Rodgers, MA, Villareal, VA, Schaefer, EA, Peng, LF, Corey, KE, Chung, RT, Yang, PL, 2012. Lipiidide metaboliitide profileerimine tuvastab desmosterooli metabolismi C-hepatiidi viiruse uue viirusevastase sihtmärgina. J. Am. Chem. Soc. 134, 6896–6899. Savidis, G., Perreira, JM, Portmann, JM, Meraner, P., Guo, Z., Green, S., Brass, AL, 2016. IFITM-id inhibeerivad Zika viiruse replikatsiooni. Cell Rep. 15, 2323–2330.

Schneider, WM, Chevillotte, MD, Rice, CM, 2014. Interferooniga stimuleeritud geenid: peremeesorganismi kaitsemehhanismide kompleksne võrk. Annu. Rev. Immunol. 32, 513–545.