Yishen Qingli Heluo graanulid kroonilise neeruhaiguse ravis: võrgufarmakoloogia analüüs ja eksperimentaalne valideerimine

Taust:Krooniline neeruhaigus(CKD) peetakse ülemaailmseks rahvatervise probleemiks, mille haigestumus ja suremus on kõrge. Yishen Qingli Heluo graanul (YQHG) on esindajatraditsiooniline hiina meditsiin(TCM) abinõukroonilise neeruhaiguse kliiniline ravi. Selle uuringu eesmärk on uurida YQHG mehhanismi kroonilise neeruhaiguse korral võrgufarmakoloogia ja eksperimentaalse valideerimise kaudu.

Meetodid:Traditsioonilise Hiina meditsiini süsteemidYQHG aktiivsete ühendite skriinimiseks kasutati farmakoloogia (TCMSP) andmebaasi ja laiaulatuslikku kirjanduse kaevandamist. YQHG ja CKD asjakohaste sihtmärkide saamiseks kasutasime mitmeid bioinformaatilisi tööriistu ja veebiandmebaase. YQHG ja CKD ristumissihtmärke peeti kandidaatsihtmärkideks. Topoloogiliste analüüside jaoks konstrueeriti ja visualiseeriti ühendi-sihtmärgi, ürdikandidaadi ja valgu-valgu interaktsioonivõrgustikud. Bioloogiliste protsesside ja signaaliradade määramiseks viidi läbi GO ja KEGG rikastamisanalüüsid. Võrgufarmakoloogia usaldusväärsuse kontrollimiseks kasutati molekulaarset dokkimist. Lõpuks viidi läbi farmakoloogiline hindamine, et uurida YQHG mehhanismi kroonilise neeruhaiguse vastu 5/6 nefrektoomia mudelil.

Tulemused:Sõeluti seitsekümmend üheksa kandidaatsihtmärki, kümmet bioloogilist põhiprotsessi ja ühte peamist signaalirada (p53). PTGS2 tuvastati H-CT võrgu põhjal peamise sihtmärgina. Molekulaarne dokkimine näitas, et kvertsetiin, kaempferool ja luteoliin olid kolm parima sidumisaktiivsusega võtmeühendit. Lisaks võivad IL6 ja kvertsetiin moodustada stabiilse kompleksi, millel on kõrge seondumisafiinsus (−7,29 kcal/mol). In vivo katsed näitasid, et YQHG parandas neerufunktsiooni ja fibroosi 5/6 nefrektoomiaga rottidel. Lisaks täheldati neerukoes PTGS2, IL6 ekspressiooni vähenemist ja p53 suurenenud ekspressiooni. Eelkõige kujundati ümber YQHG-ga ravitud rottide soolestiku mikrobiota, mida iseloomustas Firmicutes / Bacteroidota vähenenud suhe.

Järeldus: meie tulemused ennustasid ja kinnitasid YQHG potentsiaalseid sihtmärkeCKDterviklikust vaatenurgast ja andis väärtusliku suuna YQHG edasiseks uurimiseks.

Märksõnad:Yishen Qingli Heluo graanul, võrgufarmakoloogia,krooniline neeruhaigus, 5/6 nefrektoomia, soolestiku mikrobiota

SAAN 25% EHHINAKOOSIIDI JA 9% AKTEOSIIDIGA LOODUSLIK ORGAANILINE KISTANŠEKSTRAKT NERENFEKTSIOONIDE PUHUL

Sissejuhatus

Krooniline neeruhaigus(CKD) tunnistatakse üha enam ülemaailmseks rahvatervise probleemiks, mille haigestumus (8724 inimest 100,000 inimese kohta) ja suremus (15,9 100,000 inimese kohta) on kõrge.1 Riskitegurid ja haigusviisid kahjustada neerufunktsiooni, on mitmekesised ja halvasti selgitatud. Järelikult on kroonilise neeruhaiguse progresseerumise edasilükkamiseks saadaval vähe strateegiaid, kusjuures enamik praeguseid ravistrateegiaid on keskendunud proteinuuria vähendamisele ning vererõhu ja kusihappesisalduse vähendamisele. Näiteks reniin-angiotensiini süsteemi inhibiitorid on peamised terapeutilised ravimid kroonilise neeruhaiguse raviks proteinuuria vähendamise ja neerufunktsiooni kaitsmise seisukohast.2,3 Siiski teatati uuringust, et need ravimid ei pruugi aidata ära hoidaCKD progresseeruminejuurdelõppstaadiumis neeruhaigus(ESRD);4 lisaks võivad need põhjustada mitmeid kõrvaltoimeid, nagu seerumi kaaliumi-, kreatiniini- ja vähiriski suurenemine.5–8 Praegu on neeruasendusravi saavate inimeste arv ületanud 2,6 miljonit ja eeldatavasti 2030. aastaks kahekordistub maailmas 5,4 miljonini.9 Kui krooniline neeruhaigus areneb ESRD-ks, ei too see patsientidele mitte ainult majanduslikku koormust, vaid mõjutab suurel määral ka nende elukvaliteeti. Sellest tulenevalt on tungiv vajadus uurida potentsiaalseid terapeutilisi ravimeid, et vältida ja ravida selles valdkonnas kroonilise neeruhaigusega.

Traditsiooniline hiina meditsiin (TCM) on tunnistatud potentsiaalseks kroonilise neeruhaiguse ravivõimaluseks selle tõestatud tõhususe, paljude rakenduste ja väheste kõrvaltoimete tõttu. Paljud juhtumid on näidanud, et TCM-i ravimtaimi peetakse tavapäraste kogemuste ja mitme sihtmärgiga omaduste tõttu alternatiivseks allikaks kroonilise neeruhaiguse progresseerumise edasilükkamiseks.10–12 Yishen Qingli Heluo graanuli (YQHG) töötas iseseisvalt välja Jiangsu provintsi Hiina meditsiini haigla. TCM-i ravim kroonilise neeruhaiguse kliiniliseks raviks. Kliinilised uuringud näitasid, et YQHG võib parandada kliinilisi sümptomeid ja vähendada seerumi kreatiniini (Scr) taset. Lisaks võib YQHG edasi lükata CKD3 progresseerumist CKD4-ks.13,14 Meie eelmine uuring näitas, et YQHG võib autofagiat, apoptoosi ja põletikulist vastust reguleerides nõrgendada neerukahjustusi.15 Enamiku graanulite kohta tehtud uuringute keskmes olid aga peamiselt mõned klassikalised signalisatsioonirajad, nagu MAPK, TGF- ja sellega seotud teed, mis oli terviklikkuse puudumine. Tõhusate süstemaatiliste meetodite puudumise tõttu minevikus on YQHG tõhusate ühendite, sihtmärkide ja vastavate farmakoloogiliste mehhanismide uurimine kroonilise neeruhaiguse vastu piiratud. Seetõttu on uuringud keskendunud YQHG monomeeri või aktiivse ühendi mehhanismile kroonilise neeruhaiguse ravis. YQHG on aga nagu erinevate instrumentide keerukas orkester. Seda, kuidas need 10 ürti koos täiusliku repertuaari esitamiseks töötavad, tuleb veel uurida. Seetõttu on oluline leida uusi viise, et mõista põhjalikult YQHG mehhanisme kroonilise neeruhaiguse vastu. Võrgufarmakoloogia on tipptasemel metoodika, mille pakkus esmakordselt välja Hopkins.16 See meetod on kooskõlas TCM-i tervikliku vaatega. Viimastel aastatel on seda laialdaselt kasutatud TCM-i mehhanismide selgitamiseks krooniliste haiguste, sealhulgas kroonilise neeruhaiguse ravis.17–19

Selles uuringus kasutasime esmalt võrkfarmakoloogia lähenemisviisi vahendina YQHG aktiivsete ühendite uurimiseks ja selle aluseks oleva toimemehhanismi uurimiseks kroonilise neeruhaiguse ravis. Seejärel kasutati võrgufarmakoloogia usaldusväärsuse kontrollimiseks molekulaarset dokkimist. Lisaks kinnitasime YQHG nefroprotektiivset potentsiaali ja peamisi sihtmärke ekspressioone 5/6 nefrektoomiaga rottidel. Väärib märkimist, et varasemad uuringud on näidanud, et soolestiku mikrobiota mängis TCM-i ravitoimes olulist rolli.20–22 Soolestiku mikrobiota võib muuta TCM-i ürtide keemilist koostist, muutes selle biosaadavuse, bioloogilise aktiivsuse või toksilisuse erinevaks kui eelkäija. TCM-i ürdid võivad ka soolestiku mikrobiota mitmekesisust ja koostist ümber kujundada, et leevendada seotud haigusi.23 Seetõttu kasutatakse 16S rRNA sekveneerimist TCM-i ürtide, kroonilise neeruhaiguse ja soolestiku mikrobiota profiili vahelise seose analüüsimiseks, pannes aluse YQHG edasistele uuringutele. Selle uurimistöö analüüsiprotsessi üksikasjad on näidatud joonisel 1.

Materjalid ja meetodid

Võrgufarmakoloogia analüüsid

Aktiivsete ühendite ja nendega seotud sihtmärkide omandamine YQHG-s Iga YQHG ürdi ühendid saadi TCMSP andmebaasist (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) ja laiaulatusliku kirjanduse kaevandamise kaudu. Ühendid filtreeriti läbi ADME hindamissüsteemi, milles peamised parameetrid olid suukaudne biosaadavus (OB) ja ravimisarnasus (DL). OB suurem või võrdne 30% ja DL suurem või võrdne 0,18 olid TCMSP andmebaasi soovitatud ADME filtreerimismeetodi läviväärtused.24 TCMSP, STITCH (http://stitch.embl.de /), PubChemi (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) ja Swiss Target Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/) andmebaase kasutati igale YQHG aktiivsele ühendile vastavate sihtmärkide tuvastamiseks. . Tulemuste standardiseerimiseks kasutati Uniproti (https://www. uniprot.org/) andmebaasi.

YQHG kandidaatide püüdmine kroonilise neeruhaiguse ravis Kroonilise neeruhaigusega seotud sihtmärgid hangiti firmadelt GeneCards (https://www.genecards.org/), OMIM (http://www.omim.org/), DisGeNET (https://). www.disgenet.org/), TTD (http://db.idrblab.net/ttd/) ja MalaCards (https://www.malacards.org/) andmebaasid. Kõik kogutud CKD ja YQHG sihtmärgid liideti pärast Uniproti andmebaasi standardimist.

CKD-vastase YQHG sihtmärgid tuvastati Venni platvormi abil (//bioinformatics.psb.ugent.be/web tools/Venn/) ja tulemusi kasutati edasiseks analüüsiks.

Võrgu ehitus

(1) Compound-target (C-T) network of YQHG: The data of active compounds and their corresponding targets were imported into Cytoscape software (v3.6.0, Boston, MA, USA) to construct the C-T interaction network. The degree centrality, betweenness centrality, and closeness centrality were evaluated by the Network Analyzer plug-in of Cytoscape software. According to the three topological parameters of each node, the key active compound of YQHG was selected and analyzed. (2) Herb-Candidate target (H-CT) network of YQHG: The data of 10 herbs and candidate targets were imported into Cytoscape software to construct the H-CT interaction network. The pie chart was used to indicate the herb to which the candidate target (represented by circular nodes) belonged. (3) Protein-protein interaction (PPI) network of candidate targets: The visualization of PPI network was obtained by combining the STRING database (https://string-db.org/) and Cytoscape software. The species were limited to Homo sapiens, and the PPI confidence score>0.9 oli STRING andmebaasi soovitatud filtreerimisparameeter.25 Sõlmed ja servad tähistavad vastavalt kandidaatsihtmärke ja valgu-valgu interaktsioone PPI võrgus. Selles uuringus valiti välja peamised sihtvalgud ja identifitseeriti need parameetriga "Degree". Võrgu sõlmede topoloogilise tähtsuse hindamiseks kasutati kraadi, mille arvutas Cytoscape tarkvara Network Analyzer pistikprogramm.

GO ja KEGG raja rikastamise analüüs

GO bioloogilise protsessi võtmeterminite ja kandidaatsihtmärkide kriitiliste signaaliradade uurimiseks kasutati GO ja KEGG rikastamise analüüsiks R-paketti (clusterProfiler, versioon 4.1.0).26 Kohandatud P väärtus.<0.05 was considered statistically significant.

Molekulaarne dokkimine

Molekulaarse dokkimise uurimisel kasutati Autodock Vina 1.1.2 tarkvara, et määrata sidumisrežiim ja interaktsioonid YQHG võtmeaktiivsete ühendite ja rummuvalkude vahel, mis tuvastati PPI ja võrguanalüsaatori analüüside põhjal. See lähenemisviis hõlmas järgmisi põhietappe: (1) Ligandimolekuli valmistamine. Aktiivsete ühendite 3D-struktuurid laaditi alla mol2-vormingus TCMSP andmebaasist. AutodockTools 1.5.6 kasutati ligandi molekuli avamiseks, vesiniku lisamiseks, gasteigeri laenguks, ligandi juure tuvastamiseks, pööratava sideme otsimiseks ja määratlemiseks ning lõpuks pdbqt-vormingus salvestamiseks. (2) Retseptormolekuli valmistamine. Rummuvalkude 3D-struktuurid laaditi alla RCSB Protein Data Bankist (www.rcsb.org). Valgu üleslaadimiseks kasutati AutodockTools 1.5.6. Pärast kõigi vesinikuaatomite lisamist, Gasteigeri laengu arvutamist ja mittepolaarse vesiniku kombineerimist määratletakse see retseptorina ja salvestatakse pdbqt-vormingus. (3) Dokkimisparameetrite seadistamine. AutoGridi tööriist dokkimiskasti parameetrite (XYZ-koordinaadid ja ruudustiku suurus) määramiseks. Arvutuse täpsuse suurendamiseks määrati ammendavuse väärtuseks 20. (4) Täitmine ja väljund. Poolpaindlikuks dokkimiseks kasutati tarkvara Autodock Vina 1.1.2 ja lõplikuks dokkimiskonformatsiooniks valiti parim konformatsioon. (5) Analüüs ja visualiseerimine. Dokkimisrežiimi analüüsiks valiti parima sidumisafiinsusega konformatsioon. Valgu sidumisafiinsus oli alla –5 kcal/mol, mis viitab sellele, et valgul oli ühendiga teatud sidumisaktiivsus.27 Ühendi ja parima konformatsiooniga valgu dokkimistulemusi analüüsiti ja visualiseeriti PyMol tarkvaraga.

YQHG ettevalmistamine

YQHG (partii number 20051031) koosnes 10 üksikust TCM-graanulist: Angelicae Sinensis Radix (Danggui, DG), Achyranthis Bidentatae Radix (Niuxi, NX), Centella Asiatica (L.) Urban (Jixuecao, JXC), Polygonati, RjhizomaguH HJ), Smilacis Glabrae Rhixoma (Tufuling, TFL), Radix Rhei Et Rhizome (Dahuang, DH), Pyrrosiae Folium (Shiwei, SW), Hedysarum Multijugum Maxim (Huangqi, HQ), Serissa Japonica (Thunb.), Thunb (Liuyuexue, LYX) ), Polygoni Cuspidati Rhizoma Et Radix (Huzhang, HZ), mille tootis Jiangyin Tianjiang Pharmaceutical Co., Ltd. (Wuxi, Jiangsu, Hiina). Üksiku TCM-i graanuli ja vastava toorravimi suhted on loetletud tabelis 1. Kõik ülaltoodud graanulid kinnitas professor Wei Sun (Nanjingi Hiina meditsiini ülikool, Nanjing, Jiangsu, Hiina). Selles uuringus kasutati YQHG annuste arvutamiseks rottidel kaalupõhist ravimi annustamisvormingut (kg kohta).28 Arvutatuna täiskasvanud kehakaaluga 70 kg, oli rottide kliiniline ekvivalentdoos 2,8 g/kg, mis oli kasutatakse YQHG keskmise annusena. Väike annus ja suur annus selles uuringus olid vastavalt poole ja kaks korda suurem YQHG keskmisest annusest. YQHG ekstrakti stabiilsuse ja efektiivsuse kinnitamiseks viidi läbi UHPLC-MS.

5/6 nefrektoomia ja YQHG administratsiooni ehitamine

Isased Sprague Dawley (SD) rotid (nr 20210312Aazz0619000112, 6–8 nädalat vanad, 200–230 g) hankis Vital River Experimental Animal Co., Ltd. (Zhejiang, Hiina). Rotte hoiti Nanjingi Hiina Meditsiini Ülikooli spetsiifilises patogeenivabas katseloomade keskuses. Täpsemalt, rotid paigutati plastpuuridesse ja neile pakuti vabalt piisavalt standardset toitu ja vett. Ruumi, kus rotte kasvatati, keskkonnatingimused hõlmasid temperatuuri (22 ± 2 kraadi), niiskust (50 ± 10%) ja 12/12-tunnist valguse/pimeduse tsüklit. Kõik loomkatsed viidi läbi vastavalt Nanjingi Hiina Meditsiini Ülikooli loomade hooldamise ja kasutamise komitee poolt heaks kiidetud protokollile [loa number 202101A047]. Laboratoorsete loomade heaolu osas järgiti suuniseid Laboratory Animal Guidelines for Ethical Review of Animal Welfare (GB/T 35892–2018). Kõik operatsioonid viidi läbi sobiva anesteesia all ja loomade kannatuste vähendamiseks tehti kõik endast olenev.

CKD indutseeriti 24 rotil kaheetapilise 5/6 nefrektoomiaga, nagu eelnevalt kirjeldatud.29 Kahe operatsiooni protseduur oli järgmine: eemaldati 2/3 vasaku neeru parenhüümist (vältige neeru hilum) ja asetati seejärel kiiresti. želatiinkäsn sisselõike pinnale, et peatada verejooks 4–5 minutiks. Nädal hiljem tehti parempoolne ühepoolne nefrektoomia. Neeru pedikel ligeeriti steriilse 3–0 õmblusega ja seejärel resekteeriti parem neer. Kõhuõõnde loputati 0,9% steriilse soolalahusega, et vältida operatsioonijärgset kõhupiirkonna adhesiooni pärast kahte kirurgilist operatsiooni. Anesteesia esilekutsumine ja säilitamine (isofluraani tarbimine oli vastavalt 6 ml/h ja 3 ml/h) operatsiooni ajal viidi läbi Rodent Gas Anesthesia Machine (Yuyan-ABS) abil. Kontrollidena kasutati kuut rotti, kellele tehti näidisoperatsioon. CKD rotid jagati juhuslikult nelja rühma (n=6 iga rühma kohta). Sondiga kasutatavate ainete alarühmad ja päevadoos olid järgmised: I) mudelrühm (steriilne vesi); II madala doosiga YQHG rühm (1,4 g/kg YQHG); III) keskmise annusega YQHG (2,8 g/kg YQHG); IV) Suure annusega YQHG (5,6 g/kg YQHG). Katse ajal kaaluti kõiki rotte kaks korda nädalas ja ravimi annuseid kohandati vastavalt. Katse lõpus koguti rottidelt enne surmamist uriini- ja väljaheiteproovid. Edasiste uuringute jaoks koguti vereproovid ja neerukuded.

Reaktiivid

Scr, vere uurea lämmastiku (BUN) ja uriinivalgu kvantifitseerimise testikomplektid (C011-2-1, C013-2-1, C035-2-1) osteti ettevõttelt Nanjing Jiancheng Biotech Co., Ltd. (Nanjing, Jiangsu, Hiina). IL-6 ELISA komplekt (bsk00042) osteti ettevõttelt Nanjing Jinyibai Biotech Co., Ltd. (Nanjing, Jiangsu, Hiina). BCA valgu kontsentratsiooni analüüsi komplekt (PC0020) saadi ettevõttelt Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. (Peking, Hiina). PTGS2-vastane antikeha (ab179800), p53-vastane antikeha (ab227655), GAPDH-vastane antikeha (ab181602) ja kitse küülikuvastane IgG H&L (HRP) (ab6721) osteti ettevõttelt Abcam (Cambridge, UK).

Scr, BUN ja 24h uriinivalgu kvantifitseerimine

Scr, BUN ja 24h uriini valgu taset mõõdeti Scr, BUN ja uriini valgu kvantifitseerimisanalüüsi komplektide abil vastavalt juhistele. Nende hulgas viidi uriini valgu kvantifitseerimine läbi 24-tunnise uriini kogumisega metaboolsete puuridega päev enne rottide surmamist. Valem on järgmine: Uriini valk (mg/24h)=uriinivalgu kontsentratsioon (mg/L) × 24h uriini maht (L).

Neerukudede histopatoloogiline hindamine

Roti neerud loputati eeljahutatud PBS-ga (Solarbio) ja fikseeriti seejärel 4% paraformaldehüüdis (biosharp). Lõigud (4 μm) lõigati parafiiniga manustatud neerukoest ja värviti hematoksüliini ja eosiiniga (H&E) või Massoni trikroomiga (Masson) (Solarbio). Valgusmikroskoobi kujutised pildistati Digital Slide Scanneriga (tüübi spetsifikatsioon: Pannoramic DESK, P-MIDI, P25{11}}; ettevõte: 3D HISTECH; riik: Ungari; skaneerimistarkvara: Pannoramic Scanner). Glomerulaarse ja tubulointerstitsiaalse fibroosi pindala arvutamise etapid olid järgmised: Esiteks kasutati CaseViewer2.4 tarkvara glomerulaarse (tuubulointerstitsiaalse) piirkonna valimiseks 40-kordseks pildistamiseks. Proovige kogu vaateväli koega täita ja veenduge, et iga pildi taustvalgus oleks ühtlane. Teiseks viis tarkvara Image-Pro Plus 6.0 läbi pildianalüüsi, määras standardühikuks piksli ja iga lõigu jaoks valiti kaks vaatevälja. Lõpuks hinnati fibroosi pindala, st fibroosi pindala protsenti (%)=glomerulaarse (tuubulointerstitsiaalse) fibroosi pindala/glomerulaarse (tuubulointerstitsiaalse) pindala × 100%.

Soolestiku mikrobiota analüüs

Kõigi viie rühma rottide väljaheited (võlts, mudel, LD YQHG, MD YQHG, HD YQHG) koguti soolestiku mikrobiota analüüside jaoks. Soolestiku mikrobiota sekveneerimisega seotud neli peamist etappi olid järgmised: I) Genoomi DNA ekstraheerimine: väljaheidete kogu DNA ekstraheeriti EZNA® Soil DNA Kit (Omega Bio-tek) abil vastavalt tootja protokollidele. DNA kontsentratsiooni ja puhtust jälgiti 1% agaroosgeelil. II) PCR amplifikatsioon: 16S rRNA geeni V3-V4 piirkond amplifitseeriti, kasutades spetsiifilist praimerit (338F_806R) koos vöötkoodiga. PCR amplifikatsioon viidi läbi TransStart Fastpfu DNA polümeraasi komplekti kasutades. III) PCR-produktide kvantifitseerimine, segamine ja puhastamine: vaadake elektroforeesi esialgseid kvantifitseerimise tulemusi, PCR-produktide tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks kasutati QuantiFluor™ -ST testikomplekti (Promega) ning seejärel segati vastavad proportsioonid vastavalt järjestusnõuetele. iga näidis. Seejärel puhastati PCR-produktide segu GeneJET Gel Extraction Kitiga (Thermo Fisher Scientific). IV) Raamatukogu ettevalmistamine ja järjestamine: Profileerimine viidi läbi MiSeqi platvormil (Illumina, Inc., San Diego, CA). 16S rRNA sekveneerimisandmete filtreerimiseks kasutati lühikeste lugemiste kiiret pikkuse reguleerimist (FLASH, versioon 1.2.11). Operatiivsed taksonoomilised ühikud (OTU-d) valiti 97% sarnasuse piiriga ja puhastatud amplikonid sekveneeriti Illumina MiSeq platvormil ettevõttes Majorbio Biopharm Technology Co. Ltd. (Shanghai, Hiina) vastavalt standardprotokollidele.

Western Blot ja ELISA

Külmutatud neeruproovide koguvalk ekstraheeriti RIPA lüüsipuhvriga (Beyotime), mis sisaldas 1% PMSF-i (Beyotime). Valgu kontsentratsioon määrati vastavalt juhistele BCA valgukontsentratsiooni analüüsi komplektiga (Solarbio). Valgud eraldati SDS-PAGE geelidega ja kanti PVDF membraanidele (Solarbio). Pärast blokeerimist 5% BSA-ga (Solarbio) inkubeeriti membraane primaarsete antikehadega PTGS2 (1:1000), p53 (1:1000), GAPDH (1:10 000) 4 kraadi juures. üle öö. Seejärel pesti membraane TBST-ga (Solarbio) ja inkubeeriti 60 minutit toatemperatuuril Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) (1:20 000). Membraanid inkubeeriti Ultrasensitive ECL Detection Kitiga (Proteintech) 1–2 minutit ja seejärel tuvastati BIO-RAD ChemiDoc XRS+ geelkujutisesüsteemis (Bio-Rad, California, USA). Valguribade halli väärtusi analüüsiti Image Lab tarkvara (Bio-Rad) abil.

Neerukoele lisati PBS (1 ml/0,1 g) ja elektrohomogeniseeritud proovi tsentrifuugiti supernatandi kogumiseks. Seejärel kasutati IL-6 ekspressiooni tuvastamiseks vastavalt juhistele roti IL-6 ELISA komplekti.

Statistiline analüüs

Kõik andmed väljendati keskmisena ± SEM. Statistiliseks analüüsiks ja kujutiste koostamiseks kasutati GraphPad Prism 9.{1}} tarkvara (GraphPad, CA, USA). Andmete normaalsuse hindamiseks ühendasime QQ graafikud (täiendav joonis 1) Shapiro-Wilki testiga. Normaalselt jaotatud andmete jaoks kasutati ühesuunalist ANOVA-d, millele järgnes Tukey testi. Mittenormaalselt jaotunud andmete jaoks kasutati Kruskal-Wallise testi, millele järgnes mitteparameetriline Wilcoxoni auastme-summa test. lk<0.05 was considered statistically significant.

Wecistanche'i tugiteenus - Hiina suurim tsistanšeksportija:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Lisateabe saamiseks ostke:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

SAAN 25% EHHINAKOOSIIDI JA 9% AKTEOSIIDIGA LOODUSLIK ORGAANILINE KISTANŠEKSTRAKT NERENFEKTSIOONIDE PUHUL