Kogu genoomi järjestamine neuroloogiliste korduvate laienemishäirete diagnoosimiseks Ühendkuningriigis: retrospektiivne diagnostiline täpsus ja tulevane kliiniline valideerimisuuring

Rohkem informatsiooni:ali.ma@wecistanche.com

Kokkuvõte

Taust

Korduva laienemise häired mõjutavad umbes 1 inimest 3000-st ja on kliiniliselt heterogeensed haigused, mis on põhjustatud lühikeste tandem-DNA korduste laienemisest. Geneetiline testimine on sageli asukohaspetsiifiline, mille tulemuseks on ebatüüpiliste kliiniliste ilmingutega inimeste aladiagnoosimine, eriti pediaatrilistel patsientidel, kellel pole varasemat positiivset perekonna ajalugu. Terve genoomi järjestamist kasutatakse üha enam teiste haruldaste geneetiliste häirete esmavaliku testina ja meie eesmärk oli hinnata selle toimivust haigete diagnoosimisel.neuroloogilinekorduvad laienemishäired.

meetodid

Hindasime tagasiulatuvalt kogu genoomi järjestuse diagnostilist täpsust, et tuvastada kõige levinumad korduva laienemise lookused, mis on seotudneuroloogilinetulemused (AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, C9orf72, CACNA1A, DMPK, FMR1, FXN, HTT ja TBP), kasutades Inglismaa riiklikus tervishoiuteenistuses võetud proove patsientidelt, kellel kahtlustatineuroloogilinehäired; Võrdlusstandardina kasutati varasemaid PCR-testi tulemusi. Terve genoomi järjestamise kliinilist täpsust korduvate laienemiste tuvastamiseks uuriti perspektiivselt varem geneetiliselt testitud ja diagnoosimata patsientidel, kes värvati aastatel 2013–2017 Ühendkuningriigis 100 000 genoomiprojekti, kellel kahtlustati, et neil on geneetiline haigus.neuroloogilinehäire (perekondlikud või varajased ataksia vormid, neuropaatia, spastiline parapleegia, dementsus, motoorsete neuronite haigus,parkinsonistliikuminehäired, vaimupuue või neuromuskulaarsed häired). Kui kogu genoomi järjestamise abil tehti korduv laienduskõne, kasutati tulemuse kinnitamiseks PCR-i.

Leiud

Kogu genoomi järjestamise diagnostilist täpsust korduvate laienemiste tuvastamiseks hinnati 793 PCR-testiga, mis olid varem NHS-is läbi viidud 404 patsiendil. Terve genoomi järjestamine klassifitseeris õigesti 215 221 laienenud alleelist ja 1316 1321 laiendamata alleelist, näidates 97,3 protsendilist tundlikkust (95 protsenti CI 94,2–99,0) ja 99,6 protsenti spetsiifilisust (99,1–99). ·9) 13 haigusega seotud lookuses võrreldes PCR-testi tulemustega. 100 000 Genoomide projektis osalenud 11 631 patsientide proovides tuvastas kogu genoomi järjestamine 81 korduvat laienemist, mida testiti ka PCR-ga: 68 kinnitati korduva laienemisena kogu patogeensuse vahemikus, 11 mitte. -patogeensed vahepealsed laiendused või permutatsioonid ja kaks neist olid laiendamata kordused (vale avastamise määr 16%).

Tõlgendamine

Meie uuringus näitas kogu genoomi järjestamine korduvate laienemiste tuvastamiseks kõrget tundlikkust ja spetsiifilisust ning selle tulemusel tuvastatineuroloogilinekorduvad laienemishäired varem diagnoosimata patsientidel. Need leiud toetavad kogu genoomi järjestamise rakendamist kliinilistes laborites patsientide diagnoosimiseks, kellel onneuroloogilineesitlus, mis on kooskõlas korduva laienemishäirega.

Rahastamine

Meditsiiniuuringute nõukogu, tervishoiu ja sotsiaalhoolekande osakond, National Health Service England, National Institute for Health Research ja Illumina.

Sissejuhatus

Vaatamata hiljutistele edusammudele haruldaste geneetilise aluse mõistmiselneuroloogilinehäirete korral jääb kuni 70 protsenti selliste häiretega patsientidest geneetiliselt diagnoosimata.1–3 Osaliselt on selle põhjuseks keeruliste ja korduvate geneetiliste variantide, sealhulgas korduvate laienemiste testimise tehnilised väljakutsed; selline laienemine mõjutab hinnanguliselt umbes 1 inimest 3000-st (lisa p 1) ja on enam kui 40 neurogeneetilise häire,4 sealhulgas Huntingtoni tõve ja fragiilse X sündroomi peamine põhjus. Korduva laienemise häired on kliiniliselt ja geneetiliselt heterogeensed ning korduv laienemine võib olla seotud erinevate haigustega. Näiteks võivad C9orf72 laienemised avalduda kas amüotroofse lateraalskleroosi või frontotemporaalse dementsusena.5 Korduv laienemine erinevates lookustes võib samuti anda sarnaseid fenotüüpseid tunnuseid, mistõttu on nende kliiniliselt raske eristada: korduvad laienemised vähemalt kümnes spinotserebellaarse ataksia geenis esinevad sageli täiskasvanuna. algav ataksia6 ning C9orf72 ja AR korral võivad mõlemad põhjustada motoorsete neuronite haigusi.7,8

Korduvad laienemishäired on põhjustatud korduvate lühikeste tandem-DNA järjestuste arvu suurenemisest ja iga häire patogeensusläved on lookusespetsiifilised. Laienduse suurus varieerub vähem kui 30 kordusest (nt CACNA1A-s) mitme tuhande kordusühikuni (nt FMR1, DMPK, C9orf72 ja FXN puhul, mis võivad ulatuda kuni 5 kb suuruseni). Korduvad laienemised näitavad molekulaarset ebastabiilsust, mis võib põhjustada muutusi korduste suuruses (tavaliselt pikeneb) põlvkondade ja kudede lõikes.4 Nendes tingimustes põhjustab korduste arvu suurenemine sageli haiguse varasemat algust ja järjest raskemat haigust. 4 Korduvad ekspansioonihäired lastel võivad avalduda multisüsteemsete sündroomidena ilma spetsiifiliste fenotüübiliste tunnusteta9 ja seetõttu on nende häiretega lapsed tõenäolisemalt aladiagnoositud, kui perekonnas ei esine korduvat ekspansioonihäiret, kui siis, kui see on olemas.10– 12

Korduvate laienemiste laboratoorne hindamine piirdub tavaliselt üksiku lookuse sihipärase molekulaarse hindamisega, mis juhindub kahtlustatavast kliinilisest diagnoosist, kasutades PCR-põhiseid või Southern blot meetodeid,13 mis võib olla kulukas ja aeganõudev. Lisaks võivad nende häirete erinevate ja kattuvate fenotüüpsete tunnuste tõttu haigusega seotud korduvad ekspansiooni lookused jääda testimata.14

Terve genoomi järjestamine on kujunemas haruldaste haigustega patsientide jaoks esmavaliku diagnostiliseks vahendiks15, kuid kuni viimase ajani arvati, et sellel on piiratud võime hinnata korduvaid laienemisi sisaldavaid lookusi.16 Bioinformaatika edusammud on aga teinud võimalikuks haiguste tuvastamise. -põhjustab korduvaid laienemisi järgmise põlvkonna sekveneerimisandmetest.17–22 Siin kirjeldame kogu genoomi järjestamise lähenemisviisi diagnostilist hindamist korduvate laienemiste tuvastamiseks, kasutades retrospektiivseid PCR-andmeid, ja selle kliinilist valideerimist 100 000 genoomi projektis osalenud patsientidel. oli kahtlustatav neuroloogiline häire, mida ei olnud varasemate geenitestidega diagnoositud.

meetodid

Uuringu ülesehitus ja osalejad

See kogu genoomi järjestuse hindamine korduvate laienemiste tuvastamiseks hõlmas nii diagnostilise täpsuse kui ka kliinilise täpsuse hinnanguid. Diagnostilist täpsust hinnati patsientide andmete põhjal, keda oli eelnevalt PCR-iga testitud neuroloogilisi haigusi põhjustavate korduvate laienemiste suhtes.4 Patsiendid tuvastati kahest allikast: 100 000 genoomiprojektist ja Cambridge'i ülikooli haiglates asuvast genoomilaboratooriumist ( Cambridge, Ühendkuningriik). Mõlema patsientide rühma puhul olid riikliku tervishoiuteenistuse (NHS) laborid patsiendiproovidega PCR-testi teinud osana rutiinsest kliinilisest hindamisest: projekti 100000 genoomi proovide puhul tehti PCR-testid enne projekti värbamist. University College London Hospital Neurogenetics Laboratory (London, Ühendkuningriik); proovid PCR-iga kinnitatud korduva laienemisega saadi patsientidelt, keda testiti Cambridge'i genoomilaboris. Patsiendid, kellel olid korduvate ekspansioonihäirete PCR-positiivsed ja PCR-negatiivsed testitulemused, määrati meie uuringusse kaasamiseks laboriandmete süsteemide kaudu; kõik patsiendid olid andnud kirjaliku teadliku nõusoleku oma proovi kasutamiseks kvaliteedi tagamise ning uurimis- ja koolituseesmärkidel osana kliiniliste teenuste optimeerimisest ja valideerimisest.

Iga proovi kogu genoomi järjestamine viidi läbi ühes kahest laborist: Genomics England (Hinxton, UK) 100 000 genoomiprojekti proovi jaoks (n=254) ja Illumina Clinical Services Laboratory (ICSL; San Diego, CA, USA) proovide jaoks, mis on saadud Cambridge'is asuvast genoomilaborist (n{3}}). Üldiselt kasutati seda andmekogumit uuringu diagnostilise täpsuse osas ning see koosnes 404 patsiendi PCR-i ja kogu genoomi järjestamise andmetest, hõlmates 13 lookust, mis esindavad kõige sagedasemaid neuroloogilisi korduva laienemise häireid: 11 lookust, mis on seotud ataksia ja hilise diagnoosiga. algavad neurodegeneratiivsed häired (HTT, AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, TBP, C9orf72 ja FXN), üks intellektipuudega (FMR1) seotud lookus ja üks müotoonilise düstroofiaga (DMPK) seotud lookus. Iga lookuse kohta olid PCR testi andmed kättesaadavad vähemalt ühe laiendatud alleeli kohta (lisa p 24).

Kliinilist täpsust hinnati, uurides korduvate laienemiste vastavust, mis tuvastati kogu genoomi järjestamisega, kahtlustatava kliinilise diagnoosiga pärast PCR kinnitust patsientidel, kellel kahtlustatakse geneetilisi neuroloogilisi häireid (ataksia perekondlikud või varajased vormid, neuropaatia, spastiline parapleegia, dementsus). , motoorsete neuronite haigus,parkinsonistliikumishäired, intellektipuue või neuromuskulaarsed häired), kes värvati 100 000 genoomi projekti aastatel 2013–2017. 100000 genoomi projekt on Ühendkuningriigi programm, mille eesmärk on hinnata kogu genoomi järjestamise väärtust patsientidel, kellel on haruldaste haiguste ja vähi diagnoosimisvajadused rahuldamata. Pärast Ida-Inglismaa Cambridge Southi teadusuuringute eetikakomitee (viide 14/EE/1112) eetilist heakskiitu projektile 100000 genoomi, sealhulgas andmete analüüsimiseks ja diagnostiliste leidude tagastamiseks patsientidele, värbasid need patsiendid tervishoiutöötajad ja teadlased 13 genoomimeditsiini keskust Inglismaal ja nad osalesid projektis, kui nad või nende eestkostja andsid kirjaliku nõusoleku oma proovide ja andmete kasutamiseks uurimistöös, sealhulgas selles uuringus. Probandid ja võimaluse korral ka teised pereliikmed registreeriti vastavalt konkreetsete haruldaste haiguste seisundite jaoks kehtestatud abikõlblikkuse kriteeriumidele (lisa lk 5–11). Patsiendid värvati 100 000 genoomi projekti pärast NHS-i standardset geneetilist testimist, nagu on näidatud abikõlblikkuse kriteeriumides. Standardsed kliinilised algandmed registreeriti, kasutades inimese fenotüüpimise ontoloogiat (HPO)23, võrreldes haigusspetsiifiliste andmemudelitega.24 Koguti ka pereliikmete haigusseisund võrreldes probandi kliinilise näidustusega testimiseks.

Geneetiliselt diagnoosimata haigusega patsientide põhjuslike korduvate laienemiste tuvastamiseks testisime patsiente, kellel kahtlustatakse geneetilisi häireid, mis olid kooskõlas korduva laienemise haigusega. Patsiendid valiti nende haiguse ja HPO terminite vastavuse alusel korduva laienemisega seotud häiretega. Patsientide kogu genoomi järjestuse andmeid küsitleti, et otsida laiendusi teatud korduste komplektides, kasutades nelja erinevat korduslaienduspaneeli vastavalt nende kliinilistele omadustele (lisa p 5). Nendele paneelidele lisamiseks valitud korduvad laienemised on kõige levinumad neuroloogilisi haigusi põhjustavad korduva laienemise lookused. Patsiente, kelle kliinilised tunnused võivad ühilduda enam kui ühe korduva laienemishäirega, testiti mitmel paneelil. Kui korduv laienduskõne tehti kogu genoomi järjestamise abil, viidi läbi kinnitav testimine PCR-iga.

Iga kinnitatud korduva laienemisega patsiendi puhul teavitati kohalikku arsti võimalikust diagnostilisest tulemusest ja hinnati korduva laienemise panust patsiendi kliinilistesse tunnustesse. Korduvate laienduste jaoks, mis selgitasid täielikult või osaliselt patsiendi kliinilisi tunnuseid, väljastati diagnostiline aruanne vastavalt kohalikele standardprotseduuridele.

Protseduurid

Meie uuringu diagnostilise täpsuse osas kasutatud NHS-i ajalooliste proovide puhul oli korduvaid laiendusi eelnevalt testitud PCR-i amplifikatsiooni ja fragmentide analüüsi abil. Suurte C9orf72 laienduste jaoks viidi läbi Southern blotting. Meie uuringu kliinilise täpsuse osas testiti NHS-i geenilaborites säilitatud proovides PCR-iga kogu genoomi järjestamisega tuvastatud korduvaid laienemisi projekti 100 000 genoomide projekti patsientidel. Täiendavad üksikasjad, sealhulgas praimerite järjestused, on toodud lisas (lk 2–3, 25–26).

DNA valmistati ette kogu genoomi sekveneerimiseks, kasutades TruSeq DNA PCR-vaba raamatukogu ettevalmistamist ja 150 bp või 125 bp paarisotsa sekveneerimine viidi läbi kas HiSeq 2000 või HiSeq X platvormidel Genomics Englandi suure läbilaskevõimega genoomide rajatises ja ICSL-is. . Genoomid järjestati keskmise sügavusega 35× (31× kuni 37×; lisa p 27). Lühikese tandemkordusega genotüpiseerimine viidi läbi, kasutades tarkvarapaketi ExpansionHunter versiooni 3.1.2.25,26 Lühidalt, ExpansionHunter joondab järjestuse lugemised ümber eelnevalt määratletud lühikeste tandemkorduste komplekti, et hinnata indiviidi mõlema alleeli suurust (lisa p 3).

ExpansionHunteri väljund sisaldab hinnangut iga hinnatud lookuse korduvate elementide arvu, üldise suuruse ja usalduspiirangu kohta. Meditsiinipatoloogia assotsiatsiooni ja Ameerika patoloogide kolledži juhised soovitavad suure läbilaskevõimega sekveneerimisvariantide rutiinsel hindamisel variantide kõnesid visuaalselt kontrollida.27

Lühikesi tandemkordusvariante ei saa aga tavapäraste visualiseerimisvahenditega, nagu Integrative Genomics Viewer, piisavalt visualiseerida.28 Iga genotüübikõne aluseks olevate kogu genoomi järjestamise andmete uurimiseks kasutati graafiku visualiseerimise tööriista, mis võimaldab haplotüüpide ja vastava lugemisvaia otsest visualiseerimist. ExpansionHunteri genotüüpidest (lisa lk 3, 15). Pileup graafiku visuaalne kontroll viidi läbi kõigi kogu genoomi järjestamise lühikeste tandem-korduskutsete puhul, et kinnitada, et ExpansionHunteri ennustus alleelide kohta sisaldus täielikult igas lugemises (st kordusjärjestus oli väiksem kui järjestuse lugemise pikkus); monoalleelse või bialleelse paisumise olemasolu kinnitamiseks; oletatavate valepositiivsete kõnede tuvastamiseks; ja valenegatiivsete alleelide tuvastamiseks bialleelsetes korduvates ekspansioonides, nagu FXN (lisa lk 4, 16).

ExpansionHunter hindab korduse suurust kogu genoomi järjestusandmete põhjal, analüüsides järjestuse lugemisi, mis sisaldavad täielikult või osaliselt lühikest tandemkordust. Kui lühike tandem-kordusalleel on lugemispikkusest lühem, ennustab ExpansionHunter täpse suuruse; kui lühike tandem-kordusalleel on lugemispikkusest pikem, hindab ExpansionHunter korduse suurust CI-s, sõltuvalt lookuse järjestuse koostisest, sekveneerimise sügavusest ja sekveneerimise kvaliteedist.

Statistiline analüüs

Me klassifitseerisime kordused laiendatuks kogu genoomi järjestamisega, kui ExpansionHunteri ennustatud suurus oli suurem kui eelmutatsiooni piirväärtus, või mittelaiendatuks, kui prognoositav suurus oli alla piiri (lisa p 28).

Tundlikkus ja CI-d kogu genoomi järjestuse korduse laienemise tuvastamiseks arvutati laiendatud kordustega alleelide osakaaluna varem PCR-ga kinnitatud laiendatud kordustega alleelide hulgas. Spetsiifilisus hinnati laiendamata alleelide osakaaluna varem testitud laiendamata korduste hulgas PCR abil. Statistiliste valemite täielik kirjeldus on toodud lisas (p 1).

PCR-i korduste suuruste võrdlemiseks kogu genoomi järjestamise järgi antud kordussuuruste hinnangutega võrreldi PCR-iga kvantifitseeritud alleele ExpansionHunteri ennustatud korduste suurustega alleelide jaoks, mis on lühemad kui lugemispikkus kõigis 13 lühikeses tandem-korduslookus. Kooskõla arvutati ExpansionHunteri ennustatud korduste suuruste protsendi järgi, mis olid kooskõlas PCR-i kvantifitseeritud suurusega, võttes arvesse PCR-i viga pluss või miinus üks kordus. Statistiline analüüs viidi läbi kasutades R statistilise tarkvara versiooni 3.6.3.

Rahastamisallika roll

Uuringu kavandamist, patsientide registreerimist, andmete kogumist ja järjestamist juhtisid Genomics Englandi töötajad ja akadeemilised teadlased. Illumina töötajad viisid kogu genoomi järjestamise diagnostilise täpsuse uuringu kavandatud komponendina läbi 150 patsiendi proovi sekveneerimise ja töötasid välja ExpansionHunteri. Genomics Englandi töötajad, akadeemilised teadlased ning kaasautorid RTH, ED ja MAE analüüsisid ja tõlgendasid 100 000 Genomes Projecti värvatud patsientide korduvaid laienemisi. Rahastamisallikatel ei olnud mingit rolli andmete tõlgendamisel ega aruande kirjutamisel.

Tulemused

Kogu genoomi järjestuse diagnostilist täpsust korduvate laienemiste tuvastamiseks hinnati 793 PCR-testiga, mis olid varem NHS-is läbi viidud 404 patsiendil (64 patsienti testiti rohkem kui ühe korduse suhtes; joonis 1). Nendest testidest 183 klassifitseeriti laiendatud kordusega ja 610 mitte korduva laienemiseta PCR abil, mis andis kokku 221 laienenud ja 1321 laiendamata individuaalset alleeli 13 haiguse lookuses (lisa lk 24, 28). Terve genoomi järjestamine klassifitseeris PCR-testi tulemustega võrreldes õigesti 215 221 laienenud alleelist ja 1316 laiendamata alleelist (lisa lk 27, 29), mille esialgne tundlikkus oli 97,3 protsenti (95 protsenti CI 94,2–99). ·0) ja spetsiifilisus 99,6 protsenti (99,1–99,9; tabel 1). Pärast kõigi kõnede visuaalset korrigeerimist lugemise kvaliteedi põhjal suurenes tundlikkus 99,1 protsendini (96,8–99,9) ja spetsiifilisus 100 protsendini (99,7–100; joonis 2A, tabel 1). Laiendatud alleelide visualiseerimine võimaldas tuvastada valepositiivseid tulemusi ja ümber klassifitseerida kõik vale-negatiivsed alleelid FXN-is, millest ainult üks alleel klassifitseeriti bialleelsete ekspansioonidega proovides õigesti laiendatuks (lisa lk 17, 18).

Korduspikkus kvantifitseeriti PCR-iga 509 PCR-testis, milles uuriti 945 alleeli 13 korduva ekspansiooni lookuse vahel. Korrelatsioonid ExpansionHunteri ja PCR vahel järjestuse lugemise pikkusest (st 150 bp) lühemate ja suuremate korduste puhul on näidatud lisas (lisa p 19). Kõrget vastavust täheldati lugemispikkusest lühemate korduste puhul, PCR ja ExpansionHunteri vaheline kokkulepe oli 92,7 protsenti (836/902). Täheldati lookuse varieeruvust, kusjuures ExpansionHunteri ja PCR-i vaheline vastavus ATXN2, ATXN7, CACNA1A ja HTT puhul oli suur ning DMPK või TBP puhul madal (lisa p 30). ExpansionHunter alahindas lugemispikkusest suuremate alleelide pikkusi, mis mõjutas DMPK, FMR1 ja FXN helistamise täpsust (joonis 2B, lisa lk 19, 31).

Kuigi ExpansionHunter suutis õigesti tuvastada suured laienenud alleelid FMR1, DMPK, C9orf72 ja FXN puhul (lisa p 29), kippusid prognoositud suuruse hinnangud olema väiksemad kui PCR-ga saadud hinnangud, kuna korduse suurus suurenes patogeensuse vahemikus, mis mõjutas võime eristada suuri ja väikeseid laiendusi DMPK-s, C9orf72-s ja FXN-is või täislaiendusi ja permutatsioone FMR1-s (lisa p 31). Näiteks lookuste, mille PCR-hinnatud korduse pikkus oli FMR1-s suurem kui 200 kordust ja mis klassifitseeriti täismutatsiooniks, oli ExpansionHunteri hinnangul keskmine korduse suurus 92,6 (SD 17,8; lisa p 31).

Et testida korduva laienemise tuvastamise võimet kogu genoomi järjestamise abil, et lahendada varem testitud ja geneetiliselt diagnoosimata patsientide diagnoos, testisime 11 631 kahtlustatava geneetilise neuroloogilise häirega patsienti, kes võeti tööle 100 000 genoomi projekti (joonis 1). Kogu genoomi järjestuse andmeid hinnati nelja erineva korduslaienduspaneeli abil vastavalt patsiendi kliinilistele tunnustele. Kõigi nelja paneeliga testitud patsientide arv on näidatud tabelis 2.

Üldiselt tuvastasime ja visuaalselt kinnitasime korduvad laienemised 105 patsiendi proovides (tabel 2, lisa lk 20, 33). Neist 81 proovi oli saadaval kinnitava testimise jaoks PCR-iga ja 68 proovi puhul kinnitati korduv paisumine (0·6 protsenti): paneelis A 45 (1,2 protsenti ) 3692-st, kaheksa ({ {18}}·3 protsenti ) 2743-st paneelis B, viis (0,6 protsenti ) 860-st paneelis C ja kümme (0,1 protsenti ) 6731-st paneelis D. Kolmteist 81 laienduskõnest ei kinnitatud patogeensete korduvate laienemistena (vale avastamise määr 16 protsenti). Neist kaks olid ATXN1 ja ATXN2 laiendamata alleelid, neli olid FMR1 keskmise suurusega kõned (lisa p 21) ja seitse olid FMR1 permutatsioonid.

Tabelis 3 on toodud 68 patsiendi kliinilised üksikasjad, kellel on PCR-iga kinnitatud korduv laienemine, sealhulgas nende kliinilised esitused, tuvastatud korduv laienemine ja korduva laienemise panus patsiendi kliinilistesse tunnustesse; Lisas on loetletud HPO terminid, ExpansionHunteri hinnanguline korduste suurus ja diagnostikaaruanne (lk 33).

Laienemist täheldati patsientidel, kellel esines suur hulk kattuvaid kliinilisi esitlusi, mida testiti paneeliga A (tabel 3, lisa p 22), sealhulgas ATXN2 korduv ekspansioon levodopale reageeriva varajase algusega Parkinsoni tõvega ja anamneesis progresseeruva väikeaju ataksiaga patsiendil. ja AR laienemine neljal patsiendil, kellel on kliiniliselt diagnoositud Charcot-Marie-Toothi ​​tõbi, sealhulgas ühel geneetiliselt kinnitatud demüeliniseeriva neuropaatiaga (st Charcot-Marie-Toothi ​​tõve tüüp 1, patsient 42; lisa lk 33). Patogeensete korduvate laienemistega patsientidel täheldati mitmesuguseid varasemaid kliinilisi diagnoose.

Näiteks seitsmel amüotroofse lateraalskleroosi või muu motoorsete neuronite haigusega patsiendil tuvastati AR (n=4) ja C9orf72 (n=3) laienemine. Päriliku ataksia kahtlusega patsientidel tuvastasime lookuste laienemise, mida ei olnud värbamise ajal hinnatud NHS-i rutiinse diagnostilise töö osana, sealhulgas ATN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, FXN, TBP ja HTT. tabel 3). Samuti tuvastasime korduvad laienemised patsientidel, kellel olid kliinilised tunnused, mis on kooskõlas alternatiivsete korduvate ekspansioonihäiretega, sealhulgas C9orf72 laienemine varajase algusega ja perekondliku Parkinsoni tõve korral (patsient 24, tabel 3) ja korduvad laienemised HTT vähenenud läbitungimisvahemikus (38 kordust) kahel õel, kellel on liikumishäired, dementsus, depressioon ja kõneraskused (patsiendid 44 ja 45), rõhutades nende korduvate laienemishäiretega kaasnevat diagnostilist väljakutset.

Kaheksal B-paneeliga testitud lapsel leiti CAG-i korduv laienemine (joonis 3), millest seitse selgitasid täielikult patsiendi kliinilisi tunnuseid. Kuuel patsiendil ei olnud informatiivset perekonna ajalugu ja neile ei pakutud värbamise ajal kliinilise hindamise osana korduvat laienemistesti (patsiendid 48–53; tabel 3, lisa p 33). Neist kahel lapsel olid suured HTT-laiendid (90–100 CAG-i kordust). Märkimisväärne on see, et üks laps oli pärinud kordumise haigelt vanemalt, kelle perekonnas polnud Huntingtoni tõbe esinenud. Perekonnatestid jätkuvad, kuid laiendatud perekonnas on tuvastatud vähenenud penetratsiooni alleel, mis näitab, et kordus oli ühe põlvkonna jooksul laienenud üle 60 kordusühiku (patsient 52). Selle artikli kirjutamise ajal ei ilmnenud kellelgi perekonnas mingeid märke Huntingtoni tõvest ning vanemate jaoks on käimas geneetiline nõustamine ja testimine. Kahel alla 5-aastasel lapsel esines ATXN7 korduv suur laienemine ja neil oli keeruline mitmesüsteemne haigus. Ühel neist lastest (patsient 50) ilmnes nende vanemal kõnniprobleemid 2 aastat pärast 100 000 genoomi projektiga liitumist. Samamoodi leiti 10-aastasel intellektipuudega tüdrukul ATXN2 korduv 99-laienemine, hoolimata asjaolust, et mõlemad vanemad olid haigusjuhtumiteta, ja 18-aastasel dementsusega tüdrukul tuvastati 99- {19}}korrake laiendamist ATN1-s (lisa lk 33).

DMPK-s (paneel C) tuvastati viis laienemist, sealhulgas lihasdüstroofia kliinilise diagnoosiga lapsel ja emal, kahel distaalse müopaatia kahtlusega õel-vennal ja kaasasündinud müopaatiaga noorukil (patsiendid 54–58). FMR1 laienemised (paneel D) tuvastati üheksal poisil ja ühel tüdrukul ning fragiilse X sündroomi diagnoos selgitas täielikult või osaliselt olemasolevaid kliinilisi tunnuseid (patsiendid 59–68).

Arutelu

Korduvate laienemishäirete diagnoosimine on tervishoius keeruline heterogeensete ja kattuvate kliiniliste tunnuste ja mittespetsiifiliste kliiniliste leidude tõttu, mis võivad vanuse kasvades ja iga järgmise põlvkonna jooksul süveneda. Korduvad ekspansioonihäired on pärilike neuroloogiliste haiguste levinumate põhjuste hulgas.4 Sellegipoolest võivad patsiendid olla aladiagnoositud, kas ebapiisava geneetilise testimise tõttu või seetõttu, et põhjuslikke geneetilisi variante pole veel avastatud. Testimismeetodid on praegu killustatud ja patsientidel võidakse testida vale korduva laienemise lookust29 või nad saavad teise klassi variandi molekulaarse testi, kuna kliinilised tunnused kattuvad teiste neuroloogiliste geneetiliste häiretega.30

Terve genoomi järjestamist on kasutatud mitmes keskkonnas haruldaste neuroloogiliste häirete esmavaliku diagnostilise testina, kuid varem arvati, et sellel on madal võime tuvastada korduvaid laienemisi.16 Kogu genoomi korduvate laienemiste tuvastamiseks on välja töötatud mitmeid tööriistu. sekveneerimine uurimiskeskkonnas,31 kuid ühtegi neist lähenemisviisidest ei ole rakendatud terve genoomi järjestamise andmetele, mis on kogutud suurelt arvult patsientidelt ühes tervishoiuteenuses. Esitame tõendeid selle kohta, et kogu genoomi järjestamisest korduvate laienemiste tuvastamiseks loodud algoritm suudab usaldusväärselt hinnata kõige levinumaid haigusi põhjustavaid korduvaid laienemisi ja lahendada varem geneetiliselt diagnoosimata juhtumeid suurel neuroloogiliste häiretega patsientide rühmal. Meie tulemused näitavad, et kogu genoomi järjestamine suudab eristada laiendamata ja laiendatud alleele, millel on kõrge tundlikkus ja spetsiifilisus 13 korduva laienemislookuse vahel (mida saab visuaalse kontrolliga veelgi parandada), saab täpselt arvutada lugemispikkusest väiksemate alleelide suuruse. , ning võib alahinnata FMR1, DMPK, FXN ja C9orf72 suurte laienduste suurust.

Kui kogu genoomi järjestamise abil korduvate laienemiste tuvastamist hinnati positiivsete ja negatiivsete tulemuste põhjal, mis saadi kliinilistes diagnostilistes genoomilaborites, kasutades kuldstandardseid meetodeid, leiti vähemalt 97,3 protsenti tundlikkust ja 99,6 protsenti spetsiifilisust. Lisaks näitasime, et nii spetsiifilisust kui ka tundlikkust saab parandada lugemisvaia käsitsi kureerimisega, mis võimaldab tuvastada valepositiivseid tulemusi ja valenegatiivsete alleelide ümberklassifitseerimist bialleelsete laiendustega proovides. FMR1 suhtes testitud 6731 patsiendist (paneel D) ennustati 124 kõne laiendamist. Suutsime visuaalse kontrolli käigus välistada 97 tõenäolise valepositiivsusena. See näitab, et ühel 54-st terve genoomi järjestamise testist on FMR1 kõne, mida tuleks potentsiaalse valepositiivse kõne kõrvalejätmiseks visuaalselt kontrollida. Käimas on töö ExpansionHunteri genotüpiseerimismeetodi täiustamiseks, et vähendada FMR1 valepositiivsete kõnede arvu.

We show that repeat sizing is accurate for repeats smaller than the sequencing read lengths, and therefore that most non-expanded and premutation CAG repeat expansion disorder alleles can be sized accurately. These results are consistent with other studies showing a strong correlation between whole genome sequencing and PCR quantification of repeat lengths smaller than the sequencing read length.19,25,26 Whole genome sequencing expansion detection is limited in its sizing of alleles considerably larger than the read length, such as in Fragile X syndrome. We note that all FMR1 repeats previously classified by PCR as fully expanded (ie, >200 repeats) were classified by whole genome sequencing as permutation (50–200 repeats) in this study. Repeat size estimation for repeats larger than the read length is particularly important for loci in which the length of the repeat correlates with the disease clinical features. This includes DMPK, for which small expansions (50–150 repeats) cause mild myotonic dystrophy type 1 and large expansions (>1000 kordust) põhjustavad raskemat haigust ja spinotserebellaarset ataksia tüüp 36 (NOP56), mille puhul üle 650 korduse laienemist peetakse patogeenseks ja korduste suurusi 15–650 peetakse vahepealseteks ja ebakindla tähtsusega variantideks.

Tuvastatud on üle 40 korduva laienemislookuse; paljud neist lookustest tuvastati alles hiljuti ja neid seostatakse nüüd varem seletamatute seisunditega, sealhulgas väikeaju ataksia koos neuropaatiaga ja vestibulaarne arefleksia sündroom (RFC1) 32 ja müoklooniline epilepsia (SAMD12).33 Kõige levinumad neuroloogilisi haigusi põhjustavad korduva laienemise lookused olid valitud meie uuringu jaoks positiivsete ja negatiivsete kontrollproovide olemasolu põhjal.

Siin esitatud leiud viitavad sellele, et ExpansionHunter peaks suutma klassifitseerida laiendamata ja laienenud alleele täpselt iga korduva laienemise lookuse korral, kui laiendamata alleelid on lugemise pikkusest väiksemad (st 150 aluspaari). Kuigi enamikul korduvatel laienemislookustel on alleelid, mis on laiendamata väiksemad kui 150 aluspaari, võib mõne lookuse puhul, mille puhul laiendamata alleeli suurus on 150 aluspaari lähedal (nt NOTCH2NLC)34, olla seda lähenemisviisi kasutades keerulisem genotüüpida. Lookuste puhul, kus laiendatud kordus on lugemise pikkusest oluliselt suurem, võib kogu genoomi järjestamine tuvastada patogeenseid laienemisi (nt NOP56,35 RFC120,32). Arenevad kaualoetavad sekveneerimistehnoloogiad võivad pakkuda täiendavaid lähenemisviise suurte laienduste genotüpiseerimiseks.36

Korduvate laienemiste hindamine kogu genoomi järjestuse abil 11 631 diagnoosimata patsientidel, kes võeti tööle 100 000 genoomiprojekti, andis 68 patsienti, kellel olid selgitavad leiud. Patsiendid värvati 100 000 genoomide projekti pärast tavapärast geneetilist testimist; seetõttu näitab selles kohordis tuvastatud korduvate laienemiste osakaal diagnostilise saagise tõusu standardsest NHS-testist, mis hõlmab korduva laienemise häirete, nagu FXN või DMPK, lookusespetsiifilist testimist. Pange tähele, et mõnda diagnoosi ei kahtlustatud patsiendi kliiniliste tunnuste põhjal, sealhulgas kuuel pediaatrilisel patsiendil, kellel ei olnud teadaolevalt korduva laienemishäire perekonna ajalugu. Selles uuringus kirjeldatud pediaatriliste patsientide kogu genoomi järjestamisega ennustatud keskmised korduva laienemise suurused on oluliselt suuremad kui täiskasvanutel, mis on kooskõlas ootusega, et suuremad laienemised on seotud varasema ja raskema algusega, isegi lastel. Vaja on täiendavat tööd, kuid see leid viitab sellele, et vanusest sõltuv ja korduvast suurusest sõltuv patogeensuse hindamine võib toetada pediaatrilist diagnoosi, vähendades täiskasvanueas tekkivate riskialleelide tuvastamise võimalikku ohtu, mis toob kaasa soovimatute ennustavate testide tegemise lastel.

Meie tulemused võimaldavad luua kliinilise diagnostilise töövoo kogu genoomi järjestamiseks (lisa p 23). Soovitame visuaalselt kontrollida kõiki laiendatud kõnesid, et tuvastada valepositiivseid tulemusi ja bialleelseid laienemisi, mille puhul on tuvastatud ainult üks laiendatud alleel (nt FXN). Soovitame laboritel kasutada ExpansionHunterit, et hinnata laienemise olemasolu ilma suurushinnangut järgimata ja teha kinnitav PCR-test testimise töövoo standardkomponendina.

Haruldased pärilikud haigused hõlmavad laias valikus kliinilisi tunnuseid, mis muudab lookusepõhise genoomse testimise ebatõhusaks, raskeks ja kulukaks. Esitame tõendeid selle kohta, et kliinilise astme kogu genoomi järjestamist, mis võimaldab diagnoosida mitmeid haruldasi neuroloogilisi haigusi, mis tavaliselt esinevad ühe aluse, indeli või koopiaarvu variandiga, saab nüüd laiendada korduvatele laienemistele. Kuna kogu genoomi järjestamine annab ühe testi, mis võimaldab tuvastada kõige tavalisemaid korduvaid laienemisi, samuti võimaldab samaaegselt testida punktmutatsioone ja koopiate arvu variante nende haigusseisunditega seotud geenides, pakub see võimalust tuvastada enamiku nende heterogeensete häiretega patsiente. kellel ei ole diagnoositud lookuse-spetsiifilise testimise abil. Nende häirete arenevate ravimeetodite ajastul võib varajane avastamine muutuda ülioluliseks.37 Need tulemused toetavad kogu genoomi järjestuse rakendamist korduvate laienemiste tuvastamiseks kliinilistes diagnostikalaborites – lähenemisviis, mis on juba lisatud NHS England National Genomic. Testikataloog,38 diagnoosimata haruldaste neuroloogiliste haiguste uurimiseks.

Viited

1 Ngo KJ, Rexach JE, Lee H jt. Diagnostiline ülemmäär väikeaju ataksia ja sellega seotud neuroloogiliste häirete korral eksoomide sekveneerimiseks. Hum Mutat 2020; 41: 487–501.

2 Lynch DS, Koutsis G, Tucci A jt. Pärilik spastiline parapleegia Kreekas: varem uurimata populatsiooni iseloomustus järgmise põlvkonna järjestuse abil. Eur J Hum Genet 2016; 24: 857–63.

3 Graziola F, Garone G, Stregapede F jt. Sihtotstarbelise järgmise põlvkonna sekveneerimisgeenipaneeli diagnostiline saagikus lastel algavate liikumishäirete jaoks: 3-aastane kohortuuring. Front Genet 2019; 10: 1026.

4 Paulson H. Korduvad paisumishaigused. Handb Clin Neurol 2018; 147: 105–23.

5 Gossye H, Engelborghs S, Van Broeckhoven C, van der Zee J. C9orf72 frontotemporaalne dementsus ja/või amüotroofne lateraalskleroos. Seattle, WA: Washingtoni ülikool, 2015.

6 Klockgether T, Mariotti C, Paulson HL. Spinotserebellaarne ataksia. Nat Rev Dis Primers 2019; 5:24.

7 Shakkottai VG, Fogel BL. Kliiniline neurogeneetika: autosoomne domineeriv spinotserebellaarne ataksia. Neurol Clin 2013; 31: 987–1007.

8 La Spada A. Lülisamba ja bulbarlihaste atroofia. In: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, toim. GeneReviews. Seattle, WA: Washingtoni ülikool, 1999.

9 Gousse G, Natural H, Touraine R jt. 7. tüüpi spinotserebellaarse ataksia surmav vorm, mis algab lapsepõlves. Arch Pediatr 2018; 25: 42–44.

10 Ansorge O, Giunti P, Michalik A jt. Ataksiini-7 agregatsioon ja ubikvitinatsioon infantiilses SCA7-s 180 CAG kordusega. Ann Neurol 2004; 56: 448-52.

11 Ramocki MB, Chapieski L, McDonald RO, Fernandez F, Malphrus AD. 2. tüüpi spinotserebellaarne ataksia, mis ilmneb lapsepõlves kognitiivse regressiooniga. J Child Neurol 2008; 23: 999–1001.

12 Mitchell N, LaTouche GA, Nelson B, Figueroa KP, Walker RH, Sobering AK. Lapsepõlves tekkinud spinotserebellaarne ataksia 3: keele düstoonia kui varane ilming. Treemor Muu hüperkineetiline Mov 2019; avaldati Internetis 13. septembril.

13 Bird TD. Müotooniline düstroofia tüüp 1. In: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, toim. GeneReviews. Seattle, WA: Washingtoni ülikool, 2019.

14 Aydin G, Dekomien G, Hoffman S, Gerding WM, Epplen JT, Arning L. SCA8, SCA10, SCA12, SCA36, FXTAS ja C9orf72 korduvate laienemiste sagedus SCA patsientidel, kes on kõige levinumate SCA alatüüpide suhtes negatiivsed. BMC Neurol 2018; 18:3.

15 Turro E, Astle WJ, Megy K jt. Haruldaste haigustega patsientide kogu genoomi järjestamine riiklikus tervishoiusüsteemis. Loodus 2020; 583: 96–102.

16 Ashley EA. Täppismeditsiini poole. Nat Rev Genet 2016; 17: 507–22.

17 Liu HY, Zhou L, Zheng MY jt. Terve genoomi järjestuse diagnostiline ja kliiniline kasulikkus haruldaste haigustega diagnoosimata Hiina perede rühmas. Sci Rep 2019; 9: 19365.

18 Mousavi N, Shleizer-Burko S, Yanicky R, Gymrek M. Profiling the genome-wide landscape of tandem repeat expansions. Nucleic Acids Res 2019; 47: e90.

19 Tankard RM, Bennett MF, Degorski P, Delatycki MB, Lockhart PJ, Bahlo M. Tandemkorduste laienemise tuvastamine lühilugemisandmetega järjestatud kohortides. Am J Hum Genet 2018; 103: 858–73.

20 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Bennett MF jt. Laiendatud korduste bioinformaatikapõhine tuvastamine: mittereferentse intronilise pentameeri laienemine RFC1-s põhjustab CANVAS-i. Am J Hum Genet 2019; 105: 151–65.

21 Gross AM, Ajay SS, Rajan V jt. Koopiaarvu variandid kliinilises genoomi järjestuses: haruldaste ja diagnoosimata haiguste kasutuselevõtt ja tõlgendamine. Genet Med 2019; 21: 1121–30.

22 Trost B, Engchuan W, Nguyen CM jt. Autismi korral laienenud tandem-DNA korduste genoomi hõlmav tuvastamine. Loodus 2020; 586: 80–86.

23 Robinson PN, Kohler S, Bauer S, Seelow D, Horn D, Mundlos S. Inimese fenotüübi ontoloogia: tööriist inimese pärilike haiguste annoteerimiseks ja analüüsimiseks. Am J Hum Genet 2008; 83: 610–15.

24 Genoomika Inglismaa. Haruldaste haiguste kliiniliste andmete mudelid. 2018. https://www.genomicsengland.co.uk/?wpdmdl=5500 (vaadatud 4. augustil 2021).

25 Dolzhenko E, van Vugt JJFA, Shaw RJ jt. Pikkade korduvate laienemiste tuvastamine PCR-vabadest kogu genoomi järjestuse andmetest. Genome Res 2017; 27: 1895-903.

26 Dolzhenko E, Deshpande V, Schlesinger F jt. ExpansionHunter: järjestusgraafikupõhine tööriist lühikeste tandemkorduspiirkondade variatsioonide analüüsimiseks. Bioinformaatika 2019; 35: 4754–56.

27 Roy S, Coldren C, Karunamurthy A jt. Standardid ja juhised järgmise põlvkonna sekveneerimise bioinformaatika torujuhtmete valideerimiseks: molekulaarpatoloogia assotsiatsiooni ja Ameerika patoloogide kolledži ühine soovitus. J Mol Diagn 2018; 20: 4–27.

28 Robinson JT, Thorvaldsdottir H, Winckler W jt. Integreeriv genoomika vaataja. Nat Biotechnol 2011; 29: 24–26.

29 Schneider SA, van de Warrenburg BPC, Hughes TD et al. Huntingtoni tõve sarnase esituse fenotüübiline homogeensus SCA17 perekonnas. Neuroloogia 2006; 67: 1701–03.

30 Schneider SA, Bird T. Huntingtoni tõbi, Huntingtoni tõve sarnasused ja healoomuline pärilik korea: mis on uut? Mov Disord Clin Pract 2016; 3: 342–54.

31 Bahlo M, Bennett MF, Degorski P, Tankard RM, Delatycki MB, Lockhart PJ. Hiljutised edusammud korduvate laienduste tuvastamisel lühikese lugemisega järgmise põlvkonna sekveneerimisega. F1000Res 2018; 7: 736.

32 Cortese A, Simone R, Sullivan R jt. Intronilise korduse bialleelne laienemine RFC1-s on hilise algusega ataksia tavaline põhjus. Nat Genet 2019; 51: 649–58.

33 Ishiura H, Doi K, Mitsui J jt. Introonsete TTTCA ja TTTTA korduste laienemine täiskasvanud healoomulise perekondliku müokloonilise epilepsia korral. Nat Genet 2018; 50: 581–90.

34 Ishiura H, Shibata S, Yoshimura J jt. Mittekodeerivad CGG korduvad laienemised neuronaalse intranukleaarse inklusioonihaiguse, okulofarüngodistaalse müopaatia ja kattuva haiguse korral. Nat Genet 2019; 51: 1222–32.

35 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Pope K jt. Spinotserebellaarse ataksia 36 kiire diagnoosimine kolme põlvkonna perekonnas, kasutades lühiloetavaid kogu genoomi järjestusandmeid. Mov Disord 2020; 35: 1675–79.

36 Mantere T, Kersten S, Hoischen A. Meditsiinigeneetikas esile kerkiv pikalt loetud järjestus. Front Genet 2019; 10: 426.

37 Ellerby LM. Korduvad laienemishäired: mehhanismid ja ravi. Neuroteraapia 2019; 16: 924–27.

38 Riiklik tervishoiusüsteem. Riiklik genoomitestide kataloog: haruldaste ja pärilike haiguste testimiskriteeriumid. oktoober 2021.