Trihhosantide viljalihast eraldatud koostisosade valgendav toime

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Rongchao Zhang, 1, 2 Xiuqin Hu, 1 Bo Zhang, 1 ZhenWang, 1 Chunxiang Hao, 1 Jie Xin, 1 ja Qingmei Guo 2

Abstraktne: Valgendaminekosmeetikaturul on helge tulevik ja traditsioonilise Hiina meditsiini puhtad looduslikud valgendavad tooted on alati olnud uurimistöö leviala. Selles uuringus eraldati ja puhastati esimest korda Hiina meditsiini valgendav toimeaine Trichosanthesi viljaliha ning sellevalgendaminemehhanismi selgitati. Nende eraldamiseks ja puhastamiseks kasutati kromatograafilisi meetodeid, nagu silikageel, ODS ja HPLC. Antioksüdandi aktiivsuse mõõtmiseks kasutati B16 rakke,türosinaasaktiivsus ja melaniini eemaldamise aktiivsus. Kokku eraldati 20 ühendit, sealhulgas p-hüdroksübensaldehüüd (1), salitsüülhape (2), vanillhape (3), isovanillhape (4), protokatehhuaat (5), trans-kaneelhape (6), {{9 }}kumaarhape (7), trans-feruulhape (8), drekslerool-B (9), tsükloheksanool3-palmitaat (10), 5-atsetoksümetüül-2-furaldehüüd (11), 5-hüdroksümetüülfurfuraal (12), diosmetiin (13), apigeniin (14), krüsoberüül (15), luteoliin (16), 4'-hüdroksüskutellariin (17), kvertsetiin (18), 3',{{31} }dihüdroksü-7-(-D-glükopüranosüüloksü)-4′-metoksüflavoon (19) ja tsiprofloksatsiin-7-O- -D-glükosiid (20). Nende hulgas on ühenditel 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ja 20 hea antioksüdantne parandav toime; ühenditel 3, 4, 5, 6 ja 7 on kõrge musta värvi inhibeerimine; ühenditel 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ja 20 on ilmne türosiinoksüdaasi inhibeeriv toime. 1e tulemused panid aluse Trichosanthes tselluloosi ressursside edasisele arendamisele ja kasutamisele ning loovad aluse ka looduslikuvalgendaminekosmeetika.

Cistanche herbaonlooduslik valgendav koostisosa.

1. Sissejuhatus

Trichosanthes kirilowii Maxim. on mitmeaastane ronitaim kõrvitsaliste ( Cucurbitaceae ) sugukonnast. Selle puuvilju, seemneid, koort ja juurt kasutatakse tavaliselt traditsiooniliste Hiina ravimitena. Pikemat aega visatakse Trichosanthes'i viljaliha sperma Trichosanthis'e ja Pericarpium Trichosanthis'e tootmisel ja töötlemisel sageli ära, mille tulemuseks on märkimisväärsed jäätmed. Praegu keskenduvad trihhosantide viljaliha aruanded peamiselt suhkru, aminohapete, vitamiinide ja muude toitainete sisalduse võrdlusele [1–4]. Trichosanthesi paberimassi keemilise koostise kohta pole aruannet. Seetõttu on vaja süstemaatiliselt uurida paberimassi keemilisi koostisosi.

Samal ajal ei ole kosmeetika koos majanduse kiire arenguga mitte ainult palju tarbivad elustiilitooted, vaid on muutunud ka naiste populaarseimaks "vajaduseks". Paljud klassikalised hiina meditsiini raamatud või materiaalmeditsiinid on kirja pannud, et trikosanteedi viljalihal on funktsioonvalgendamineja kortse eemaldav toime [5–7]. Meie uurimisrühma varasemad tulemused näitavad, et Trichosanthesi viljaliha veeekstrakt oli kõrgemtürosinaasinhibeeriv toime ja türosinaasi inhibeerimise määr oli umbes 70 protsenti. 1 tavalinevalgendamineKontrollainetena kasutati C-vitamiini (VC) ja arbutiini [8]. Esialgselt on tõestatud, et Trichosanthes viljaliha ekstraktil oli teatud valgendav toime, pärssides türosinaasi aktiivsust. Seetõttu on väga oluline uurida Trichosanthesi viljaliha keemilisi koostisosi ja valgendamismehhanismi.

ThevalgendamineMehhanismi võib kokku võtta, kuna see pärsib melaniini sünteesi ja kiirendab melaniini ülekannet. 1e inmelanotsüütide melaniini moodustumise protsess on järgmine:türosinaasoksüdeerib türosiini polümorfseks BA-ks (DOPA); Seejärel oksüdeeritakse see dopakinooniks.Pärast mitmeid metaboolseid reaktsioone tekib melaniin.Türosinaas on ainus kiirust piirav ensüüm reaktsiooniprotsessis ja selle aktiivsus määrab sünteesitava melaniini koguse. Kui türosinaasi aktiivsus suureneb, suureneb melaniini süntees; kui türosinaasi aktiivsus on inhibeeritud, väheneb melaniini süntees [9]. Türosinaasi 1e aktiivsel keskusel on kahekordne vase aktiivne sait ja iga vase ioon ühineb 3 histidiinijäägiga, millel on vastavalt 1 või 2 valentsi. Seetõttu võib antioksüdantse toimega redutseerimine interakteeruda türosinaasi aktiivse saidi vaseaatomiga või vähendada melaniini sünteesi protsessi vaheühendit, et pärssida melaniini moodustumist[10, 11]. Lisaks võib valgendavat rolli mängida ka küpsete melanotsüütide keratinotsüütidesse ülemineku pärssimine.

Toime määramiseks kasutatakse rakukultuuri tehnoloogiatvalgendamineaktiivsed koostisosad pealtürosinaasaktiivsus ja melaniini tootmine melanotsüütides in vitro. 1e hiire melanoomi rakuliin (B16 rakud) pärineb hiire nahamelanoomi rakkudest ja selle põhistruktuur, eriti seoses melaniini sünteesiga, on põhimõtteliselt sama, mis inimese normaalsetel melanoomirakkudel. Kuna inimese primaarseid naha melanoomirakke on väga raske kasvatada, saab hiiremudelit kasutada testrakuna, et määrata kindlaksvalgendamineaktiivsed koostisosad. Seetõttu kasutati B16 rakke antioksüdantse aktiivsuse, türosinaasi aktiivsuse ja melaniini eemaldamise aktiivsuse mõõtmiseks ning valgendavad aktiivsed komponendid ja nendega seotud mehhanism määrati eelnevalt. 1ersults pani aluse Trichosanthesi paberimassi ressursside edasisele arendamisele ja kasutuselevõtule ning loob aluse ka loodusliku valgendava kosmeetika väljatöötamisele.

2. Katsed

2.1. Materjalid.

Trichosanthes trihosanthis koguti Hebao taimsete ravimite istutusbaasist Pinyinis, Jinan. 1e proovid tuvastas Shandongi traditsioonilise hiina meditsiini ülikooli professor QingmeiGuo. Pärast koore ja seemnete eemaldamist saadi viljaliha osa. Pärast külmkuivatamist paberimass purustati, segati ja lõpuks pandi edasiseks kasutamiseks eksikaatorisse.

värske tsitanchekoosehhinakosiidmõjusid

2.2. Rakkude elujõulisus.

B-16 rakud (hiire melanoomirakud) osteti ettevõttest KeyGEN ja neid hoiti DMEM söötmes, millele oli lisatud 10 protsenti veiseloote seerumit (FBS), temperatuuril 37 kraadi niisutatud atmosfääris 5 protsenti CO2-ga. 1en, külvati B-16rakud 96-süvendiga plaatidele (10 × 104 rakku süvendi kohta) 24-tunniseks inkubeerimiseks.

2.3. Erinevate ekstraktide valmistamine.

Trichosanthes kirilowii viljaliha tooraineks oli 4,5 kg. 1e paberimassi leotati kolm korda 10-kordses koguses 95% etanoolis. 1eekstraktid ühendati ja kontsentreeriti mahuni ligikaudu 3,0 l. Anetüülatsetaadi ekstrakt saadi etanooliekstrakti dispergeerimisel 15 1 vees, ekstraheerides seda etüülatsetaadiga, kuni ekstrakt oli värvitu. 1e ekstraktid ühendati ja kontsentreeriti alandatud rõhul.

Etüülatsetaadi ekstrakt segati silikageeliga (100–200 mesh) vahekorras 1:2 (ekstrakt: silikageel, v/ v). 1 lahusti aurustati ja geel jäeti alles. 1e klaaskromatograafia kolonn (8{{30}} mm × 1200 mm) pakiti 200–300 mešši silikageeli ja D101-ga makropoorse vaiguga ja seejärel kolonni elueeriti etüülatsetaadi, petrooleetriga (10 protsenti, 25 protsenti, 50 protsenti, 75 protsenti ja 100 protsenti) ja metanooliga, etüülatsetaadiga (5 protsenti, 10 protsenti, 25 protsenti, 50 protsenti). , 75 protsenti ja 100 protsenti ), et koguda iga voogu. Lõpuks koguti iga fraktsioon ja konfigureeriti järgmised kontsentratsioonid: 0,003125 mg/ml, 0,00625 mg/ml, 0,0125 mg/ml, 0,025 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0. ml, 1,0 mg/ml ja 2,0 mg/ml ning seejärel kasutati kultiveeritud rakkude töötlemiseks. Töötlemise lõpus lisati igasse süvendisse 20 μL MTT lahust (5 mg/ml). 1e rakke inkubeeriti 20 minutit 37 kraadi juures. 1 supernatant visati ära ja igasse süvendisse lisati 100 µl DMSO-d. 1e neeldumine mõõdeti 490 nm juures. 1 katset korrati 3 korda. 1e ellujäämismäär arvutati järgmiselt:

ellujäämisprotsent=(katserühma tühirühm)/(kontrollrühm - tühi rühm) × 100 protsenti .

Iga fraktsiooni optimaalne kontsentratsioon (C1) arvutati vastavalt funktsionaalsele suhtele ellujäämise määra ja iga fraktsiooni kontsentratsiooni vahel. C1 lahjendati 2, 4, 6 ja 8 korda, et saada vastavalt kontsentratsioonid C2, C3, C4 ja C5. 1e erinevad viljaliha ekstraktid on näidatud tabelis 1.

Tabel 1: Trichosanthesi viljaliha polaarsed ekstraktid ja optimaalne kontsentratsioon.

2.4. Valgendamise eksperiment

2.4.1. Antioksüdantide test.

Rakkude elujõulisuse määramiseks kasutati MTT testi (MTT komplekt, Kaiji Biology). 1en, B-16 rakud külvati 96-süvendiga plaatidele (10 × 104 rakku süvendi kohta) 24 tundi ja töödeldi erinevate ekstraktide või ühenditega 24 tundi. Pärast töötlemist sööde visati ära ja pesti kaks korda PBS-ga. 1en, lisati 0,05 protsenti H2O2 ja rakke kultiveeriti 4 tundi. Pärast seda inkubeeriti B-16 rakke 20 µL MTT lahuses (5 mg/mL) 37 kraadi juures 4 tundi. 1en, kultuuri supernatant eemaldati ja jääk lahustati 100 ui DMSO-s. 1e neeldumine tuvastati 490 nm juures, kasutades mikroplaadilugejat (Tecan Trading AG). 1ekatset tehti paralleelselt 3 korda.

2.4.2. Melaniini tootmise pärssimine.

Melaniini tootmine määrati melaniinisisalduse rakkude tuvastamise teel NaOH pürolüüsi abil [12]. Rakud külvati 96-augukultuuriplaatidele 24 tundi rakutihedusega 10 × 104 rakku süvendi kohta.1en, rakke töödeldi erinevate ekstraktide või ühenditega 24 tundi. Pärast seda eemaldati rakukultuuri supernatant (300 µL) ja jääk lahustati NaOH-s (1 ml, 1,0 mol/L) 24 tundi toatemperatuuril. 1 neeldumine mõõdeti 475 nm juures, kasutades mikroplaadilugejat (Tecan Trading AG). 1e katsed viidi läbi paralleelselt 3 kordusega. 1e IC50 määrati GraphPad Prism 5 tarkvaraga (GraphPad Software, Inc., San Diego, California) ja positiivse kontrollina kasutati arbutiini (IC50 =15,6 µL).

2.4.3. Türosinaasi aktiivsuse määramine.

Rakukultuuri supernatant eemaldati ja jääk lahustati Tritonx-100-s (90 µL) jatürosinaas(10 µL, 1,0 mg/mL, Sigma, T3824 25 ku). Pärast segamist inkubeeriti segu 37 kraadi juures 30 minutit. 1e neeldumist mõõdeti 475 nm juures, kasutades mikroplaadilugejat (Tecan Trading AG). 1ekatset tehti paralleelselt 3 korda. 1e IC50 määrati GraphPad Prism 5 tarkvaraga (GraphPadSoftware, Inc., San Diego, California) ja positiivse kontrollina kasutati arbutiini (IC50 =15,6 µL).

2.5. Ekstraheerimine ja isoleerimine. Etüülatsetaadi ekstrakt lahustati metanoolis ja kolonn täideti 200–300 mešši silikageeliga, mis tasakaalustati petrooleetriga. 1en, gradientelueerimine, mis koosneb petrooleetrist ja etüülatsetaadist vahekorras 2:1, 1:1 ja 1:2; etüülatsetaat; etüülatsetaat ja metanool vahekorras 2:1, 1:1 ja 1:2; ja metanooli kasutati koos TLC-ga, et saada ühendid A (11,5 g), B (10,4 g), C (12,1 g), D (5,2 g) ja E (6,1 g).

A eraldati polüamiidkolonnkromatograafiaga, kasutades elueerimislahustina diklorometaani ja metanooli vahekorras 2:1, 1:1 ja 1:2. 1e eluaati jälgiti TLC abil. Sama retentsiooniteguriga (rf ) laigud kombineeriti ning saadi A1 ja A2. 1en, A1 valmistati TLC abil, kasutades ilmutusainena diklorometaani ja metanooli vahekorras 1:1, ja puhastati mitu korda geelikolonnis. Lõpuks saadi ühend 1 (17 mg) ja ühend 2 (27 mg). A2 puhastati kolonnkromatograafiliselt silikageelil, kasutades eluendina diklorometaani ja metanooli vahekorras 1:1 ja 1:2. Saadi ühend 3 (11 mg), ühend 4 (12 mg) ja ühend 5 (23 mg). B eraldati pöördfaasilise C18 keskmise rõhuga kromatograafiaga (RP-C18), kasutades metanooli ja vett gradientelueerimisel järgmiselt: 0 protsenti ,10 protsenti, 15 protsenti, 20 protsenti, 25 protsenti, 30 protsenti, 35 protsenti , 40 protsenti , 50 protsenti , 75 protsenti , 90 protsenti ja 100 protsenti . 1e voolukiirus oli 10 ml·min-1. Sama rf-ga 1e voolufraktsioonid ühendati ning saadi B1 ja B2. B1 puhastati korduvalt geelikolonnis, kasutades elueerimislahustina metanooli. Ühendid (24 mg), 7 (21 mg) ja 8 (18 mg) saadi pärast korduvat elueerimist. B2 puhastati geelikolonnis ja metanooliga ning saadi ühend 9 (11 mg). C eraldati RP-C18-ga ja elueeriti metanooli ja veega voolukiirusega 10 ml·min-1. Sama rf-ga 1e voolufraktsioonid ühendati ja saadi C1, C2 ja C3. C1 valmistati geelikolonnis ja elueeriti metanooliga ning saadi ühend 10 (13 mg). C2 eraldati silikageelkolonniga ja elueeriti etüülatsetaadi ja metanooliga, gradientelueerimisega vahekorras 2:1, 1:1 ja 1:2. C2 puhastati preparatiivse vedelfaasi ekstraheerimisega ning ühendid 11 (15 mg) ja 12 Saadi 14 mg (14 mg). C3 eraldati polüamiidkolonnis, elueeriti metanooli ja veega ning puhastati HPLC-ga. Saadi ühendid 13 (34 mg), 14 (42 mg) ja 15 (38 mg). D eraldati RP-C18-ga ja elueeriti metanooli ja veega.1e voolukiirus oli 10 ml·min-1. Ühendid 16 (36 mg), 17 (19 mg) ja 18 (37 mg) saadi HPLC abil. Ühendid 19 (29 mg) ja 20 (34 mg) saadi gradientelueerimisega, kasutades etüülatsetaati ja metanooli vahekorras 1:1 ja 1:2, millele järgnes 100% metanool silikageelikolonnis.

herba epimedium sagittatum nahal

3. Tulemused ja arutelu

3.1. Aktiivsete ekstraktide määramine (E1–E11).

Arvutati iga ekstrakti 1e optimaalne kontsentratsioon (nimelt C1) ja see on näidatud tabelis 1. 1e antioksüdantkatse näitab, et kõigil ekstraktidel on antioksüdantne parandav toime, kuid võrreldes VC-ga on iga rühma antioksüdantne toime nõrk. E1, E3, E4, E7 ja E11 antioksüdantne aktiivsus vähenes suureneva kontsentratsiooni korral, nagu on näidatud joonisel 1. 1e melaniini inhibeerimise test näitas, et kõik Trichosanthes kirilowii viljaliha polaarsed komponendid inhibeerisid melaniini sünteesi. Eelkõige oli melaniini inhibeerimise määr E2, E3 ja E4 puhul oluliselt kõrgem kui positiivse kontrolli arbutiini puhul, nagu on näidatud joonisel 2. 1e tulemusedtürosinaasaktiivsus näitab, et kõik Trichosanthes kirilowi ​​viljaliha polaarsed komponendid inhibeerisid türosinaasi aktiivsust ja inhibeerimise suundumus oli sarnane melaniini inhibeerimisega. 1e türosinaasi aktiivsuse inhibeerimine oli oluliselt kõrgem E2, E3, E4 ja E8 puhul kui positiivse kontrolli puhul. Üldiselt on petrooleetri ekstraktidel türosinaasi madal inhibeeriv toime. Etüülatsetaadi ekstraktidel 1e on tugev türosinaasi, eriti etüülatsetaadi polaarsete komponentide inhibeeriv toime. 1e n-butanooli ekstraktidel on samuti suur türosinaasi inhibeeriv toime, nagu on näidatud joonisel 3.

3.2. Monomeerkomponentide eraldamine ja identifitseerimine.

20 ühendit eraldati silikageeli ja ODS-kromatogrammi kolonnide ning preparatiivse HPLC abil. NMR ja MS andmete analüüsi põhjal selgitati välja nende struktuurid.1e 20 ühendit on toodud tabelis 2 ning monomeeride spetsiifilised analüütilised andmed on toodud lisas 1.

3.3. Tõhusate ühendite valideerimisanalüüs

3.3.1. Antioksüdantsete ühendite valideerimisanalüüs.

E1, E2, E3, E4 ja E5 omavad antioksüdantset toimet. Ülaltoodud komponentidest eraldatud 1e põhiühendid olid drekslerool-B (ühend 9), tsükloheksanool 3-palmitaat (ühend 10), 5-atsetoksümetüül-2-furaldehüüd (ühend 11), 5-hüdroksümetüülfurfuraal ( ühend 12), diosmetiin (ühend 13), apigeniin (ühend 14), krüsoberüül (ühend 15), luteoliin (ühend 16), 4'-hüdroksü-skutellariin (ühend 17), kvertsetiin (ühend 18), 3',{{ 25}}peamised ühendid olid glükosiidid, mis näitab, et glükosiididel on hea antioksüdantne toime. Fenoolhapped, nagu 5-atsetoksümetüül-2-furaldehüüd (ühend 11), 5-hüdroksümetüülfurfuraal (ühend 12), diosmetiin (ühend 13), apigeniin (ühend 14), krüsoberüül (ühend 15) ,luteoliin (ühend 16), 4'-hüdroksüskutellariin (ühend 17), kvertsetiin (ühend 18) ja 3',5-dihüdroksü-7-(-Dglükopüranosüüloksü)-4'-metoksüflavoon, neil on fenoolhüdroksüülrühma ja küllastumata kaksiksidemete tõttu ka hea antioksüdantne toime [26, 27]. 1e tulemused on näidatud joonisel 4.

Joonis 4: Trichosanthesi ekstraktide erinevate ühendite antioksüdantkatse rakkude ellujäämise määr ( protsenti )

3.3.2. Melaniini inhibeerivate ühendite valideerimisanalüüs.

E11, E12, E13, E16, E17 ja E18 pärsivad hästi melaniini sünteesi. Ülaltoodud komponentidest eraldatud 1e peamised ühendid on toodud tabelis 2. Vastavalt jaotises 2.4.2 toodud meetodile määrati iga ühendi mõju melaniini sünteesile. Iga ühendit hinnati järgmistel kontsentratsioonidel: 1000 ug/ml, 800 ug/ml, 400 ug/mL, 200 ug/mL ja 100 ug/ml. Iga mõõtmine viidi läbi kolmes korduses ja arvutati melaniini sünteesi inhibeerimise määr.

Protokatehhuaat (ühend 5), 5-atsetoksümetüül-2-furaldehüüd (ühend 11), 5-hüdroksümetüülfurfuraal (ühend 12), diosmetiin (ühend 13), p-hüdroksübensaldehüüd (ühend 1), salitsüülhape (ühend 2), vanillhape (ühend 3), isovanillhape (ühend 4), trans-kaneelhape (ühend 6), 4-kumaarhape (ühend 7), apigeniin (ühend 14), krüsoberüül (ühend 15) ), luteoliin (ühend 16), 4'-hüdroksüskutellariin (ühend 17), kvertsetiin (ühend 18), 3', 5-dihüdroksü-7-( -D-glükopüranosüüloksü)-4′ -metoksüflavoon (ühend 19), ofloksatsiin-7-O- -D-glükosiid (ühend 20) võivad pärssida melaniini tootmist [28]. Eelkõige on vanillhappel (ühend 3), isovanillhappel (ühend 4), protokatehhuaadil (ühend 5), trans-kaneelhappel (ühend 6) ja 4-kumaarhappel (ühend 7) kõrge melaniini inhibeerimine. 1e tulemused on näidatud joonisel 5.

3.3.3. Türosinaasi aktiivsust inhibeerivate ühendite kontrollimine ja analüüs.

E2, E3, E4, E7, E8 ja E9 omavad head pärssivat toimettürosinaastegevust. Peamised ülaltoodud komponentidest eraldatud ühendid 1e on toodud tabelis 2. Vastavalt jaotises 2.4.3 esitatud meetodile kasutati kontrollina arbutiini ja ühendi kontsentratsioon oli 1000 µg/mL, 800 µg/mL, 400 µg/mL. , 200 µg/mL ja 100 µg/mL. Iga mõõtmine viidi läbi 5 korda ja türosinaasi inhibeerimise määr arvutati. 1e tulemused on näidatud joonisel 6.

1e tulemused näitavad, et diosmetiin (ühend 13), apigeniin (ühend 14), krüsoberüül (ühend 15), luteoliin (ühend 16), 4'-hüdroksüskutellariin (ühend 17), kvertsetiin (ühend 18), 3',{{10} }dihüdroksü-7-(-D-glükopüranosüüloksü)-4′-metoksüflavoon (ühend 19), tsiprofloksatsiin-7-O- -D-glükosiid (ühend 20), p-hüdroksübensaldehüüd (ühend 1), salitsüülhape (ühend 2), vanillhape (ühend 3), isovanillhape (ühend 4), protokatehuaat (ühend 5), trans-kaneelhape (ühend 6), 4-kumaarhape (ühend 7) ) ja trans-feruulhappel (ühend 8) on kõik ilmnetürosinaasinhibeerivad tegevused.

Cistanche taim pärsib türosinaasi aktiivsust.

Kliki pildil ja vaata täpsemalt.

Hüdroksüülasendatud ühendid benseenitsüklis, nagu p-hüdroksübensaldehüüd (ühend 1), salitsüülhape (ühend 2), vanillhape (ühend 3), isovanillhape (ühend 4), protokatehuaat (ühend 5), trans-kaneelhape ( ühend 6), 4-kumaarhape (ühend 7), trans-feruulhape (ühend 8) ja flavonoidid avaldasid tugevat türosinaasi inhibeerimist ja para-asendatud ühendite inhibeerimise määr oli oluliselt kõrgem kui orto-asendatud ühenditel. . Näiteks p-hüdroksübensaldehüüdi inhibeeriv aktiivsus oli oluliselt kõrgem kui salitsüülhappel ja vanillhappe inhibeeriv aktiivsus oli oluliselt kõrgem kui isovanillhape. Veelgi enam, p-hüdroksübensaldehüüdi inhibeeriv toime oli oluliselt kõrgem kui salitsüülhappel, vanillhappel, isovanillhappel ja protokatehüüdil. Põhjuseks võib olla see, et nukleofiilsed rühmad on aktiivse keskuse ümbertürosinaas, nagu –SH, –NH2 ja –OH, hõivavad ruumi aktiivse keskpunkti ümber ja takistavad seega türosiinil aktiivset keskust rünnata. Lõpuks inhibeeriti melaniini süntees [28]. 1e o-dihüdroksüühendeid sisaldavate ühendite inhibeeriv toime oli tugevam kui parahüdroksüühenditel ja protokatehhuaadi inhibeeriv toime oli oluliselt kõrgem kui vanillihappel. 1e ülaltoodud nähtused esinevad ka flavonoidides. 7 ja 4' hüdroksüülrühma sisaldavate flavonoidide 1 inhibeerimismäär oli oluliselt kõrgem kui 7 ja 4' hüdroksüülrühmade asendamisel. Näiteks krüsoberüüli inhibeeriv aktiivsus oli oluliselt kõrgem kui diosmetiinil, samas kui diosmetiini inhibeeriv aktiivsus oli kõrgem kui 3′,5-dihüdroksü-7-(-D-glükopüranosüüloksü)-4 ′- metoksüflavoon ja tsiprofloksatsiin-7-O- -D-glükosiid. 3-hüdroksürühma sisaldavate flavonoidide 1 inhibeerimismäär oli märkimisväärselt kõrgem kui nendel ühenditel, mis ei sisalda 3-hüdroksürühma või kui 3-hüdroksü asendati. Näiteks oli kvertsetiini inhibeeriv aktiivsus oluliselt kõrgem kui 4'-hüdroksüskutellariini oma, kuid 4'-hüdroksüskutellariini inhibeeriv aktiivsus oli kõrgem kui kvertsetiini -3-o glükosiidil. Lisaks on koelliini inhibeeriv toime suurem kui apigeniinil, kuid madalam kui luteoliinil. Arvatakse, et B-tsükli asendajad, eriti hüdroksüülrühm, võivad võimendadatürosinaasinhibeeriv toime ja B-tsükli ortodihüdroksürühmal oli suurem inhibeeriv toime [29].