Milline ravimtaim suurendab luutihedust? Cistanche (CPhG) suurendab osteogeneesi SIRT2-C/EBP-AREG raja kaudu

 

 

Osteoporooson tavaline ortopeediline haigus, mis mõjutab keskealiste ja eakate inimeste tervist ning selle esinemissagedus on viimastel aastatel näidanud tõusutrendi [1]. 2015. aastal oli Hiinas 2,69 miljonit osteoporootiliste luumurdudega patsienti ning 2035. aastaks peaks see arv ületama 4,8 miljonit. Ravikulud ulatuvad kümnete miljardite jüaanideni, koormates oluliselt perekondi ja ühiskonda [2]. Uuringud [3] näitavad, et osteoporoos on seotud osteoblastide diferentseerumisega. Tasakaal luu moodustumise ja luu resorptsiooni vahel on luukoe taastumise ja luu kvaliteedi säilitamiseks ülioluline. Vähenenud osteogenees ja kiirenenud luu resorptsioon on patoloogilised mehhanismid, mis põhjustavad osteoporoosi. Osteoblastid vastutavad luumaatriksi sünteesi, sekretsiooni ja mineralisatsiooni ning seega luu moodustumise, kasvu, resorptsiooni ja ainevahetuse eest [4]. Osteoporoosi ravi nõuab osteoblastide diferentseerumise ja proliferatsiooni soodustamist ning nende funktsioonide parandamist. Seetõttu on osteoblastide diferentseerumise mehhanismide selgitamine eriti oluline. Praegu kasutatakse kliinilises ravis peamiselt farmakoloogilisi sekkumisi, nagu antiresorptiivsed ravimid (bisfosfonaadid, selektiivsed östrogeeniretseptori modulaatorid, kaltsitoniin, D-vitamiini toidulisandid) ja anaboolsed ained (paratüroidhormooni analoogid). Pikaajaline ravi võib aga põhjustada annusest sõltuvaid kõrvaltoimeid. Tavalised seedetrakti reaktsioonid on iiveldus, oksendamine ja kõhulahtisus. Kuigi tõsiste tüsistuste, nagu lõualuu osteonekroos ja äge neerukahjustus, üldine esinemissagedus on väike, peavad arstid hoolikalt jälgima nende riski konkreetsetes populatsioonides (nt kasvaja luumetastaasidega patsiendid) [5].

Cistanche (Cistanche deserticola/tubulosa) omab traditsioonilist hiina meditsiini funktsiooni – toniseerib neeru yang’i ning toidab essentsi ja verd. Kaasaegsed farmakoloogilised uuringud [6] on näidanud, et Cistanche suudab reguleerida luu ainevahetust, soodustades osteoblastide aktiivsust ja pärssides osteoklastide aktiivsust. Sellel on madal toksilisus ja vähe kõrvaltoimeid. Rottidel, kellel on eemaldatud munasarjad, võib Cistanche ekstrakt vähendada luuhõrenemist ja ennetada osteoporoosi. Uuringud [7] on leidnud, et Cistanche fenüületanoidglükosiididel (CPhG-d), mis on Cistanche koguglükosiidide peamised aktiivsed koostisosad, on ainulaadne toime luude metabolismi reguleerimisel, osteoblastide aktiivsuse suurendamisel ja osteoklastide aktiivsuse pärssimisel. Siiski ei ole teateid selle kohta, kas CPhG-d reguleerivad osteogeenset diferentseerumist SIRT2-C / EBP-AREG-telje kaudu. Selles uuringus uuritakse CPhG-de mõju ja mehhanisme osteogeensele diferentseerumisele, eesmärgiga pakkuda teoreetilist tuge ja rakenduslikku alust CPhG-de kasutamiseks osteoporoosi ravis.

1 Materjalid ja meetodid

1.1 Materjalid ja instrumendid

CPhG-d (ehhinakosiid 40% või suurem, akteosiid/verbaskosiid 15% või suurem, fenüületanoidglükosiidide kogusisaldus 80% või suurem, partii nr. 20240211) ostetiXinjiang Hotan Dicheng Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd. Sobiv kogus CPhG-sid lahustati 10 ml rakukultuuri söötmes. Pärast täielikku lahustumist filtriti lahus kaks korda läbi 0,22 μm mikropoorse membraani. CPhG-sid sisaldav osteogeenne või osteoklastiline induktsioonikeskkond valmistati kontsentratsioonides 50, 100 ja 200 μmol/L. Kõik CPhG-sid sisaldavad söötmed valmistati enne kasutamist värskelt.

Xinjiang Hotan Dicheng Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd Cistanche ekstrakti spetsifikatsioon

Calcein-AM, proteiinkinaas B (AKT), fosforüülitud proteiinkinaas B (p-AKT), CCAAT / võimendajat siduv valk (C/EBP), Sirtuin 2 (SIRT2), osteopontiin (OPN), Runtiga seotud transkriptsioonifaktor 2 (RUNX2) ja osteokaltsiini (OCN) osteti Hiinast Betechnologyies (Shange) antikehad. CO2 inkubaator ja reaalajas kvantitatiivne PCR instrument osteti ettevõttelt Bio-Rad (USA). iMarki mikroplaadilugeja osteti ettevõttest Eppendorf (Saksamaa). Lipofectamine 3000 transfektsioonireaktiiv osteti firmast Thermo Fisher Scientific (USA). QuikChange Lightning saidipõhise mutageneesi komplekt osteti ettevõttest Agilent (USA).

Cistanche Ratio ja nimekirjad müügiks

 

1.2 Katseloomad ja rühmitamine

Sichuani ülikooli laboriloomade keskusest osteti kuuskümmend emast C57BL/6 hiirt. Kõik loomaprotokollid kiitis heaks Southwesti meditsiiniülikooli loomaeetika komitee (20230718-022).

CPhG-de sekkumismõjude selgitamiseks osteoporoosile loodi klassikaline ovariektoomia (OVX) mudel. Kaheksanädalased hiired jaotati juhuslikult kolme rühma: võlts (võrdse mahuga rasvkoe eemaldamine ainult munasarjade ümbert), OVX (kahepoolne ovariektoomia) ja OVX + CPhG (kahepoolne ovariektoomia + CPhG-d sondiga). Pärast intraperitoneaalset anesteesiat naatriumpentobarbitaaliga (50 mg/kg) viidi steriilsetes tingimustes läbi võltsoperatsioon või kahepoolne munasarjade eemaldamine. Sekkumised algasid 24 tundi pärast operatsiooni. OVX + CPhG-de rühm sai CPhG-sid sondiga (lahustatuna 0,5% naatriumkarboksümetüültselluloosi lahuses, 300 mg·kg−1·d−1); OVX ja Sham rühmad said sondiga võrdses koguses kandjat. Sekkumised kestsid 8 nädalat. Kehakaalu jälgiti kord nädalas. Kaks kuud pärast operatsiooni hinnati luu moodustumise kiirust topeltkaltseiini märgistamise abil ja reieluud allutati mikro-CT-skaneerimisele (parameetrid: 50 kV, 200 μA, eraldusvõime 10 μm), et kvantitatiivselt analüüsida luu mahu fraktsiooni (BV/TV), trabekulaarset paksust (Tb.Sp) ja trabekulaarset eraldumist (Tb.Sp). 60. operatsioonijärgsel päeval (kokku 8-nädalane sekkumine) surmati kõik hiired.

 

1.3 Rakkude katsed ja rühmitamine

Hiire pre-osteoblasti rakuliin MC3T3-E1 osteti ettevõttelt Guangzhou CytoNiche Biotechnology Co., Ltd. Rakke kasvatati DMEM-is, mis sisaldas 10% veise loote seerumit ja 1% penitsilliini-streptomütsiini.

Et analüüsida CPhG-de mõju MC3T3-E1 osteogeensele diferentseerumisele ja SIRT2-C/EBP-AREG teljele, jagati mõned kultiveeritud MC3T3-E1 rakud juhuslikult kontrollrühmaks (NC) ja CPhG-de rühmaks. NC-rühma kultiveeriti standardses osteogeenses induktsioonisöötmes, CPhG-rühma aga osteogeenses söötmes, mis sisaldas 50 μmol / l CPhG-sid.

Kontrollimaks, kas SIRT2 mõjutab C/EBP ekspressiooni MC3T3-E1 rakkudes, jagati veel üks partii MC3T3-E1 rakke juhuslikult kontrolliks (metsikut tüüpi MC3T3-E1 ilma CPhG-deta), SIRT2 KD (stabiilne SIRT2 knockdown MC3T3-E1), kontrolliks + CPhCPlhd-G. MC3T3-E1, mida on töödeldud 50 μmol/L CPhG-dega, ja SIRT2 KD + CPhG-dega (SIRT2 knockdown MC3T3-E1 töödeldud 50 μmol/L CPhG-dega). SIRT2 KD ja SIRT2 KD + CPhGs rühmade puhul saavutati SIRT2 knockdown Lipofectamine 3000-ga segatud siRNA transfekteerimisega; SIRT2 mRNA tasemeid mõõdeti qRT-PCR abil. Kontroll- ja kontroll + CPhGs rühmade jaoks transfekteeriti NC-siRNA ja mõõdeti SIRT2 mRNA tasemeid.

C/EBP deatsetüülimise rolli kinnitamiseks osteogeense diferentseerumise soodustamisel määrati ülejäänud MC3T3-E1 rakud WT (kontroll), K102R mutandi, K211R mutandi ja CPhGs-ga töödeldud (EX) rühmadesse. WT rakke hoiti standardses osteogeenses induktsioonisöötmes. K102R ja K211R rühmade jaoks kavandati atsetüülimiskoha mutantsed praimerid C/EBP kodeeriva järjestuse alusel. Kasutades mallina metsiktüüpi pcDNA3.1-FLAG-C/EBP ja QuikChange Lightning komplekti, konstrueeriti pcDNA3.1-FLAG-C/EBP (K102R ja K211R) mutandid. EX-rühma kultiveeriti osteogeenses söötmes, mis sisaldas 50 μmol / l CPhG-sid.

 

Milline ravimtaim suurendab luutihedust

1.4 Western blot analüüs ja immunosadestamine valgu ekspressiooniks

PVDF membraane inkubeeriti primaarsete antikehadega üleöö temperatuuril 4 °C, millele järgnes HRP-ga konjugeeritud sekundaarne antikeha (kitse küülikuvastane IgG, 1:5000) toatemperatuuril 1 tund. Valguribad visualiseeriti kemoluminestsentskujutise süsteemi abil ja -tubuliin (1:1000) toimis suhtelise kvantifitseerimise sisekontrollina. Analüüsiks kasutati ImageJ tarkvara. Immunosadestamiseks kasutati Pierce IP lüüsipuhvrit. Ekstrakte inkubeeriti koos vastavate antikehadega üleöö 4 kraadi juures, seejärel valgu A/G agaroosigraanulitega 4 tundi 4 kraadi juures. Valgu A/G helmed-antikeha-antigeeni kompleksid sadestati ja pesti, seejärel elueeriti SDS proovipuhvris 95 kraadi juures 5 minutit. Sihtvalgud tuvastati Western blot analüüsiga.

 

1.5 Kvantitatiivne reaalajas PCR (qRT-PCR) mRNA ekspressiooniks

Kogu RNA ekstraheeriti TRIzol reagendiga. Optilist tihedust 260 ja 280 nm juures mõõdeti ultramikro-UV-nähtava spektrofotomeetriga. RNA kontsentratsioon arvutati OD 260 nm juures ja puhtust hinnati OD260/OD280 suhte järgi. cDNA sünteesiti, kasutades HiFiScript cDNA sünteesikomplekti (Vazyme, Nanjing, Hiina). qRT-PCR viidi läbi Ultra SYBR segu abil reaalajas PCR-süsteemis. Praimeri järjestused:

OCN, edasi 5'-TCTGACCTCACAGATGCCAAG-3', tagurpidi 5'-AGGGTTAAGCTCACACTGCT-3';

OPN, edasi 5'-CACATGAAGAGCGGTGAGTCT-3', tagurpidi 5'-CCCTTTCCGTTGTTGTCCTG-3';

RUNX2, edasi 5'-GGGACTGTGGTTACCGTCAT-3', tagurpidi 5'-ATAACAGCGGAGGCATTTCG-3';

C/EBP , edasi 5'-CTTCAGCCCGTACCTGGAG-3', tagurpidi 5'-GGAGAGGAAGTCGTGGTGC-3';

GAPDH, edasi 5'-TGGCCTTCCGTGTTCCTAC-3', tagurpidi 5'-GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA-3'.
Sisekontrollina kasutati GAPDH-d ja suhteline ekspressioon arvutati 2-ΔΔCt meetodi abil.

 

1.6 Alizarin Red S (ARS) värvimine

Pärast rakukultuuri loputati rakke PBS-ga ja fikseeriti 4% paraformaldehüüdiga 30 minutit. Neid värviti toatemperatuuril 1% ARS-i lahusega (pH 4,2) 20 minutit, seejärel pesti korduvalt ultrapuhta veega, kuni taust oli selge. Pärast pildistamist lahustati mineraliseeritud sõlmed kvantifitseerimiseks 10% tsetüülpüridiiniumkloriidi lahusega ja neeldumist mõõdeti 562 nm juures.

 

1.7 Statistiline analüüs

Statistilised analüüsid viidi läbi SPSS 25.0-ga. Mõõtmisandmed on väljendatud keskmisena ± standardhälbena. Normaalselt jaotatud andmete puhul kasutati mitme grupi võrdlemiseks ühesuunalist ANOVA-d, millele järgnes paaripõhiseks võrdlemiseks Tukey post hoc test. Mittetavaliselt jaotunud andmete jaoks kasutati Mann-Whitney U testi. AP väärtust < 0,05 peeti statistiliselt oluliseks.

Strateegiline märkus B2B ostjatele, kes otsivad usaldusväärseid taimseid lahendusi osteoporoosi raviks

Märksõna fookus: Cistanche ekstrakt, Cistanche fenüületanoidglükosiidid (CPhG-d), ehhinakosiid, akteosiid/verbaskosiid, osteoblastide diferentseerimine, osteoporoosi ravimtaimede ekstrakti tarnija, luu tervisele mõeldud toitained, GMP Cistanche tehas, Xinjiang Cistanche.

Miks Cistanche/CPhG-d? Ülaltoodud translatsiooniline põhjendus tõstab esile CPhG-de kahepoolset toimet, mis soodustab osteoblastide aktiivsust ja pärsib osteoklastide aktiivsust, toetades nende kasutamist luutervise preparaatides, mis on suunatud osteogeneesile, luumassile ja mikroarhitektuurile.

Hankimine ja kvaliteet: ostjad, kes vajavad ühtseid CPhG-de spetsifikatsioone (nt ehhinakosiid 40% või suurem, akteosiid 15% või võrdne, fenüületanoidglükosiidide kogusisaldus 80% või suurem), otsige GMP-sertifikaadiga, suuremahulisi ja jälgitavaid tarneahelaid.

 

Valdkonna juhtiva Cistanche tarnija tutvustus

Kui hindate osteoporoosile keskendunud taimeekstraktide tarnijaid, on Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd (WECISTANCHE) kõrgeim partner, kellega arvestada.WECISTANCHEon pühendunud müügiettevõteXinjiang Hotan Dicheng Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltdja grupi peakorter asub Xinjiangis Hotanis. Vastavalt nende ettevõtte profiilile:

Mastaap ja päritolu: asutati 2003. aastal, peakontor asub Luopu maakonnas Hotanis, Xinjiangis (Cistanche'i tuum), 200 000 aakri suurune Cistanche baas ja maailma suurim Cistanche töötlemistehas.

Integrated supply chain: Seed breeding base (~20,000 acres), cultivation base (>85 000 aakrit), 15 000 tonni värsket Cistanche'i kogumist ja ladustamist ning GMP tehast, mis suudab töödelda 20 000 tonni värsket Cistanche'i ja muid taimi.

Sertifikaadid ja kvaliteet: National Health Food GMP töökoda, Hiina SC, HACCP, IOIA/NOP orgaanilised sertifikaadid ja 14 Cistanchega seotud leiutise patenti (sealhulgas membraanide eraldamise tehnoloogia).

 

Xinjiang Hotan Dicheng Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd

Teadus- ja arendustegevuse tugevus:Prof Pengfei Tu (Pekingi ülikool) juhtimisel ja pikaajaline koostöö Pekingi ülikooli TCM kaasaegse uurimiskeskuse, Shanghai Jiao Tongi ülikooli, Shenyangi meditsiiniülikooli, Xinjiangi meditsiiniülikooli, Kyoto farmaatsiaülikooli ja Kinki ülikooliga.

Kasutusala: ekstraktid ja valmisvormid, mis sobivad TCM-i keetmiseks, funktsionaalseks toiduks, tervisetoodeteks, toidulisanditeks, ravimiteks ja nahahoolduseks.

Xinjiang Hotan Dicheng Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd

Sotsiaalne vastutus:Tunnustatud panus kõrbestumise kontrolli alla ja vaesuse leevendamisse Xinjiangis; suuremahulised Cistanche toodete annetused COVID-19 ajal.

Luude tervise jaoks mõeldud CPhG-de tehniliste dokumentide, hinnapakkumiste või privaatsete kaubamärkide / originaalseadmete tootjate jaoks võtke ühendust WECISTANCHE'ga:

Veebisait:https://www.xjcistanche.com/about-us

Meil:wallence.suen@wecistanche.com
 

Aadress:No.1, 26. korrus, 1. üksus, hoone 6, nr 133 Sheng'ani tänav, kõrgtehnoloogia piirkond, Chengdu, Sichuan, Hiina (pilootvabakaubandustsoon)