Oryza Sativa Ssp. valmistatud traditsioonilise jahutava riisipulbri (bedak Sejuk) elujõulisus ja antioksüdantsed toimed. Indica ja Oryza Sativa Ssp. Japonica UVB-indutseeritud B164A5 melanoomirakkudel

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Ahmad Rohi Ghazali1*, Raveena Vaidheswary Muralitharan1, Chan Kam Soon1, Tharsini Salyam1, Nurul Najihah Ahmad Maulana1, Ummul Aqeela Balqees Mohamed Thaha1, Rasyidah Mohamad Halim1, Sajidah Kohhmahhmah, Tanfli Handhi1, Noordham1, Muhamadhi1, Noordham

Abstraktne

Taust:Traditsiooniline jahutav riisipulber (bedak sejuk) on kääritatud riisi baasilkosmeetilinemida kantakse paikselt nahale üleöö näomaskina. Kasutajate tunnistuste kohaseltbedak sejukkaunistab ja valgendab nahka, mistõttu saab neid eeliseid kasutada potentsiaalse melanoomi kemopreventiivse ainena.

Eesmärk:Seetõttu oli selle uuringu eesmärk välja selgitada selle mõjubedak sejukvalmistatud Oryza sativa ssp. indica (Indica) ja Oryza sativassp. japonica (Japonica) UVB-indutseeritud B164A5 melanoomirakkudel ja tuvastada kaantioksüdantmõlemat tüüpi bedak sejuki võimsused.

Meetodid:Indica ja Japonica bedak sejuki optimaalne annus rakkude töötlemiseks määrati MTT testi abil. Siisantioksüdantmõlemat tüüpi võimsusedbedak sejukmäärati FRAP testi abil.

Tulemused:MTT testist leiti, et Indica ja Japonica bedak sejuk ei näidanud rakkudele tsütotoksilist toimet. Seetõttu ei ole IC50 võimalik saada ja raviks valiti kaks suuremat annust, 50 ja 100 g/l. FRAP testis näitas Indica bedak sejuk 50 ja 100 g/l juures FRAP väärtusi 0,003 ± 0,001 ug AA (askorbiinhape)/g bedak sejuki kohta ja 0,004 ± 0,0003 ug AA/gbedak sejuk. Kui Japonica bedak sejukil 50 g/l oli sama FRAP väärtus kui Indica bedak sejukil 100 g/l juures. Mis puutub Japonica bedak sejuk 100 g/L, siis see näitas kõige kõrgematantioksüdantmahtuvus FRAP väärtusega {{0}}.01 ± 0,0007 ug AA/g bedak sejuki kohta, mis oli statistiliselt oluline (p < 0,05) võrreldes teiste testitud kontsentratsioonidega.

Järeldus:Kokkuvõtteks Japonicabedak sejukon kõrgemantioksüdantvõimsus võrreldes Indica bedak sejukiga, kuigi mõlemad ei ole rakkude suhtes tsütotoksilised. Sellest hoolimata tuleb enne bedak sejuki kui potentsiaalsete melanoomi kemopreventsiooni ainete väljatöötamist teha täiendavaid uuringuid.

Märksõnad:Bedak sejuk- fermenteeritud riis - kääritatudkosmeetika- Oryza sativa Indica- Oryza sativa Japonica

Klõpsake selleksantioksüdandiks on cistanche ekstrakt ja cistanche deserticola ma

Sissejuhatus

Inimkeha suurim organ on nahk, mis moodustab 16 protsenti inimese kehakaalust. Naha epidermis toimib kaitsekihina, mis eraldab organismid väliskeskkonnast. See on ülioluline keskkonnastressitegurite, näiteks ultraviolettkiirguse (UV) vastu võitlemisel. Kui UV-valgus tungib läbi epidermise, moodustavad keratinotsüütides olevad melaniini pigmendid keratinotsüütide tuumade kohal kaitsekatte. See kaitseb nahka UV-valguse läbitungimise eest ning neutraliseerib tekkinud reaktiivseid hapniku liike (D'Orazio et al., 2013; Aluwi et al., 2016; Woolridge Cooper, 2018).

Suurem kokkupuude UV-valgusega on aga hüperpigmentatsiooni ja nahakahjustuste peamine põhjus (Chan et al., 2014; American Cancer Society, 2020). Päikese UV-kiirgus, mis läbistab nahka, on UVA ({2}} protsenti) ja UVB-kiirgus (5–10 protsenti), kusjuures nahakahjustuse ulatus sõltub iga kiire lainepikkusest. UVA-kiirtel on pikemad lainepikkused (320–400 nm), mis tungivad sügavale pärisnahasse ja põhjustavad vabade radikaalide, eriti ROS-i moodustumist. Mis puutub UVB-kiirtesse, siis lühemate lainepikkustega (280–320 nm), mis tungivad ainult epidermise kihini, kahjustavad kiired DNA-d, mis omakorda põhjustavad mutatsioone. See ROS-i moodustumise ja mutatsioonide kombinatsioon aitab lõpuks kaasa nahavähi tekkele (Sander et al., 2003; Pfeifer ja Besaratinia, 2012; D'Orazio jt, 2013; Kamarulzaman jt, 2017; Pavel jt, 2017). 2017; Nagapan jt, 2018).

Nahavähi tüüp, mis tekib UV-kiirguse liigse kokkupuute tõttu, on melanoom. Melanoom tekib siis, kui melanotsüüdid kasvavad DNA mutatsioonide tõttu kontrolli alt välja. Kuigi melanoom moodustab vaid vähem kui 10 protsenti kõigist nahavähkidest, põhjustab see enamiku nahavähiga seotud surmajuhtumeid. Seda võib seostada melanoomi suure metastaatilise potentsiaaliga ja resistentsusega ravi suhtes (Pfeifer ja Besaratinia, 2012; American Cancer Society, 2020). Seetõttu on melanoomi kemopreventsiooni strateegiad selle haigusega võitlemiseks sobivamad (Chhabra et al., 2017).

Kooskõlas melanoomi kemopreventsiooni strateegiatega on idee kasutada kohalikkukosmeetilineilmus toode, mis võib vähendada ROS-i teket ja mutatsioone inimese nahal. See toode, traditsiooniline jahutav riisipulber, rohkem tuntud kuibedak sejukMalaisias on traditsiooniline fermenteeritud riisipõhine kosmeetikatoode. Riisiterad, mida on varasemates uuringutes bedaki sejuki saamiseks kääritatud, on Oryza sativa ssp. indica (Indica) ja Oryza sativa ssp. japonica (Japonica) (Dzulfakar et al., 2015a). Indica riisiterad on pikad, lamedad, õhukesed, purunevad kergesti ja neil on kõrge amüloosisisaldus, samas kui Japonica riisiterad on lühikesed, ümarad, ei purune kergesti ja neil on madal amüloosisisaldus (Ricepedia, nd). Bedak sejuk kui riisitera kääritamise saadus on veepiiskade või koonusekujuliste pastillide kujul. Kui need pastillid segada veega ja kanda nahale üleöö näomaskina, annab see jahutava efekti. Seda on toetanud põlvest põlve kasutajate tunnistused, et bedak sejuk on võimeline nii kaunistama kui ka valgendama nahka (Dzulfakar et al., 2015b; Dzulfakar et al., 2016c; Johar et al., 2018). Neid tunnistusi ei ole aga kunagi laboris testitud, eriti selle mõju kohta nii normaalsetele kui ka pahaloomulistele naharakkudele.

Seetõttu oli meie uuringu eesmärk välja selgitada selle mõjubedak sejukvalmistatud Indica ja Japonica riisi alamliikidest, kasutades UVB-indutseeritud B164A5 melanoomirakke, samuti tuvastadesantioksüdantmõlemat tüüpi bedak sejuki võimsused.

Materjalid ja meetodid

Indica ja Japonica bedak sejuki valmistamine

Thebedak sejukvalmistatud Indica ja Japonica riisi alamliikidest saadi Inseneri- ja ehituskeskkonna teaduskonnast, Universiti Kebangsaan Malaysia, 43600 Bangi, Selangor. Bedak sejuki valmistamiseks leotati Indica ja Japonica riisiterad kraanivees vahekorras 1:1 (mass/maht) eraldi suletud mahutites, mida ei steriliseeritud. Seejärel lasti riisiteradel toatemperatuuril 14 päeva loomulikul käärimisel läbida. 14. päeval filtreeriti riisiterad musliinlapiga ja leotati uuesti uues veekogus (mass/maht). Riisiterade leotamist korrati kuus korda iga 14 päeva järel, viies üldise leotamisprotsessi 84 päevani. 84 päeva pärast koguti igast riisi alamliigist saadud riisipasta ja kuivatati ahjus, et saada bedak sejuki pulbriline vorm (Dzulfakar et al., 2016a). Seejärel hoiti bedaki sejukit kuni edasise kasutamiseni külmikus 4oC juures. Enne katseid lahustati bedak sejuk destilleeritud vees ja filtreeriti steriliseerimiseks läbi 0,22 µm Millipore süstalfiltri.

Rakukultuur

Hiire melanoomi rakuliin B164A5 osteti Euroopa autentitud rakukultuuride kollektsioonist (ECACC). Rakke kultiveeriti Dulbecco modifitseeritud kotkasöötmes (DMEM), mis oli rikastatud 10 protsendi veise loote seerumi (FBS), 1 protsendi penitsilliini ja streptomütsiini seguga (Pen/Strep, 10, 000 IU/ml), glükoosi ja L-ga. glutamiin. Seejärel inkubeeriti rakke niisutatud atmosfääris 37 oC juures 5% CO2 atmosfääris. Kui rakkude konfluentsus jõuab 80 protsendini, rakud subkultuuriti (Public Health England, nd). Enne analüüside läbiviimist joonistati B164A5 rakkude kasvukõver. Kasvukõveralt saadi 24-tunnine kahekordistumise aeg, kusjuures seda leidu toetas Danciu et al. (2013) uuring.

MTT analüüs

Mõlemat tüüpi tsütotoksilisusbedak sejukB164A5 rakke hinnati 3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiidi (MTT) rakkude elujõulisuse testiga vastavalt Mosmanni (1983) meetodit väikeste muudatustega. 200 µL 5 x 104 rakku külvati 96-süvendiga lamedapõhjalisele plaadile ja inkubeeriti 24 tundi niisutatud atmosfääris 37oC juures 5 protsenti CO2. Pärast 24-tunnist inkubeerimist sööde visati ära ja asendati 200 µL PBS-ga. Seejärel eksponeeriti rakke 36,4 sekundiks UVB-kiirgusele 30 mJ/cm2 (Lin et al., 2002). Kohe pärast UVB-ga kokkupuudet visati PBS ära ja rakke töödeldi mõlemat tüüpi bedak sejukiga kontsentratsioonides 6,25, 12,5, 25, 50 ja 100 g/l. Positiivse kontrolli osas töödeldi rakke menadiooniga seerialahjendatud kontsentratsioonides 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 ja 1 mM vastavalt Basri et al., (2015) andmetele, samas kui negatiivseks kontrolliks olid töötlemata rakud. Pärast töötlemist inkubeeriti rakke veel 24 tundi. Pärast inkubatsiooniperioodi lisati igasse süvendisse 20 ui 5 mg/ml MTT lahust ja inkubeeriti 4 tundi. Seejärel visati igast süvendist 190 ui segu ära ja lisati 200 ui DMSO-d ning inkubeeriti 15 minutit. Lõpuks loksutati plaati 5 minutit ja neeldumisnäidud võeti 570 nm juures, kasutades mikroplaadilugejat. Rakkude elujõulisuse protsent arvutati järgmise valemi abil: rakkude elujõulisus ( protsenti )= (töödeldud rakkude keskmine OD)/(negatiivse kontrolli keskmine OD) × 100

Raudmetalli redutseeriva antioksüdandi võimsuse (FRAP) test

Theantioksüdantmõlemat tüüpi võimsusedbedak sejukmäärati FRAP testiga, nagu on kirjeldanud Benzie ja Strain (1996). See on meetod antioksüdantse toime hindamiseks raua (Fe3 pluss) redutseerimise kaudu raudioonideks (Fe2 pluss) madala pH juures, mille tulemuseks on värvilise raudtripüridüültriasiini kompleksi moodustumine. Esiteks valmistati FRAP tööreaktiiv värskelt, segades atsetaatpuhvri (30 mM, pH 3,6), raud(III)kloriidi (FeCl3) lahust (20 mM) ja TPTZ lahust (10 mM) vahekorras 10:1:1. . Valmistatud FRAP tööreaktiivi hoiti seejärel veevannis temperatuuril 37 °C ja kaitstuna valguse eest. Sellele järgneb raud(II)sulfaadi (FeSO4) kalibreerimiskõvera koostamine, kasutades seeriaviisiliselt lahjendatud kontsentratsioone vahemikus 100–1, 000 µM. Positiivse kontrollina kasutati askorbiinhapet ja selle valmistamiseks kasutati seerialahjendatud kontsentratsioone vahemikus 3,125–50 µg/ml, pimedas (Hasiah et al., 2011). Mis puutub katseetappidesse, lisati 96-süvendiplaadi neile eraldatud süvenditesse 50 µl FeSO4, askorbiinhapet ja mõlemat tüüpi bedak-sejuki. Seejärel lisati igasse süvendisse 175 µl soojendatud FRAP tööreaktiivi. Seejärel inkubeeriti plaati 37 °C juures 5 minutit. Lõpuks võeti neeldumisnäidud lainepikkusel 595 nm, kasutades mikroplaadilugejat ja FRAP väärtused väljendati askorbiinhappe ekvivalentse antioksüdandi võimena (AEAC) (Gashahun ja Solomon, 2019).

cistanche pulber

Statistiline analüüs

Andmete esitamiseks kasutati tarkvara SPSS v25. Iga kolme sõltumatu katse (n=3) katseandmed väljendati keskmisena ± SEM. Keskmiste võrdlemiseks kasutati ühesuunalist ANOVA testi. Kasutatud alfa oli 0.05 ja p-väärtust < 0,05="" peeti="" statistiliselt="">

Tulemused

Indica ja Japonica bedak sejuki tsütotoksilisus

Mõlemat tüüpi tsütotoksilisusbedak sejukhinnati UVB-indutseeritud B164A5 melanoomirakkude suhtes MTT testiga. Menadioon, mida kasutati positiivse kontrollina, näitas tsütotoksilisust IC50 väärtusega 0.04 ± 0,02 mM (joonis 1). Iga menadiooni kontsentratsioon oli statistiliselt oluline (p < 0,05)="" võrreldes="" negatiivse="" kontrolliga.="" kui="" indica="" ja="" japonicabedak="" sejuk="" ei="" näidanud="" tsütotoksilisust,="" siis="" ic50="" väärtusi="" ei="" saadud.="" mõlemat="" tüüpi="" bedak="" sejuki="" rakkude="" elujõulisus="" vähenes="" alguses,="" kuid="" suurenes="" kontsentratsiooni="" suurenedes="" järk-järgult="" (joonised="" 2="" ja="" 3).="" lisaks="" ei="" olnud="" mõlemat="" tüüpi="" bedak="" sejuki="" kõik="" kontsentratsioonid="" negatiivse="" kontrolliga="" võrreldes="" statistiliselt="" olulised="" (p=""> 0,05). Tulemused näitasid, et mõlemad bedak sejuki tüübid ei olnud UVB-indutseeritud B164A5 melanoomirakkude suhtes tsütotoksilised.

Indica ja Japonica bedak sejuki antioksüdantsed omadused

Mõlemat tüüpi bedak sejuk as vähendavad võimalusedantioksüdandidmäärati FRAP testiga. FRAP väärtused väljendati askorbiinhappe ekvivalendi antioksüdantide võimena (AEAC) ühikutes µg AA (askorbiinhape)/g bedak sejuki. Indica bedak sejuki 50 ja 100 g/l FRAP väärtused olid 0.003 ± {{ 17}}.001 ja 0,004 ± 0,0003 µg AA/g bedak sejuki kohta (joonis 4). Japonica bedak sejuki puhul olid FRAP väärtused 50 ja 100 g/l puhul 0,004 ± 0,0003 ja 0,01 ± 0,0007 µg AA/gbedak sejukvastavalt, näidates annusest sõltuvat viisi (joonis 4).

Kui võrreldi Indica bedak sejuki FRAP väärtusi 50 ja 100 g/l kohta, ei olnud see statistiliselt oluline (p=0,803). Võrreldes olid aga Japonica bedak sejuki FRAP väärtused 50 ja 100 g/l kohta statistiliselt olulised (p=0,006). Lisaks oli Japonica bedak sejuki FRAP väärtus 100 g/l kohta, mis näitas suurimat antioksüdantset võimet, statistiliselt oluline, võrreldes Indica FRAP väärtustega.bedak sejuknii 50 (p=0,001) kui ka 100 g/l (p=0,003) jaoks.

Arutelu

Viimasel ajal on looduslike toodete kasutamine nahahoolduses kasvanud. Enamiku nende looduslike toodete olemasolu on tõestatudantioksüdantlisaks naha kaitsele UV-valguse eest (Abdul Wahab et al., 2014). Üks näide sellisest tootest on bedak sejuk, fermenteeritud riisi baasil valmistatud kosmeetikatoode. Põlvkondade kaupa,bedak sejukpastillid segatakse veega ja kantakse paikselt nahale üleöö näomaskina (Dzulfakar et al., 2016c; Johar et al., 2018).

Riisiterade kääritamisel bedak sejuk’i saamiseks osalevad tavaliselt lisaks hallitusele ja pärmile ka piimhappebakterid (LAB) (Dzulfakar et al., 2015a; Dzulfakar et al., 2016b). Kasutaminekosmeetilinetooted, mis sisaldavad seda LAB-kääritatud riisi komponenti, põhjustavad toote paisumist ja siledust ning nahale kandmisel märja tunde (Sawaki et al., 2010). Sarnasest kogemusest on teatanud kabedak sejukkasutajatele, kusjuures bedak sejuki kasutamine tekitab laheda tunde (Dzulfakar et al., 2015a). Samuti on huvitav seos naha ja LAB-i kääritamise vahel, kusjuures riisiterade kääritamisel kasutatav LAB-leotusvesi sisaldab piimhapet ja teisi aminohappeid, mis aitavad kaasa naha niisutamisele. Need eelised muudavad LAB-i leotusvee kasulikuks kosmeetikatoodete allikana. Seega võib substraadi või söötme, nagu riisiterad, ja LAB-tüvede kombinatsioon põhjustada kosmeetilisi efekte, nagu antioksüdantne toime, pH reguleerimine ja rakustressi vältimine (Izawa ja Sone, 2014). Need eelised on kooskõlas melanoomi kemopreventsiooni strateegiatega. Bedak sejuki mõju pahaloomulistele naharakkudele tuleb aga laboris veel uurida. Seega on potentsiaalse melanoomi kemopreventsiooni aine eeluuringuna UVB-indutseeritud hiire melanoomirakud B164A5 sobiv vähimudel.

Esiteks leiti MTT testis, et Indica ja Japonicabedak sejukei olnud tsütotoksilised UVB-indutseeritud B164A5 melanoomirakkude suhtes. Siiski märgiti, et bedak sejuki madalamate kontsentratsioonide korral vähenes rakkude elujõulisus, millele järgnes rakkude elujõulisuse suurenemine bedak sejuki kõrgemate kontsentratsioonide korral. Rakkude elujõulisuse vähenemine võib olla tingitud asjaolust, et UVB-kiired on rakkude, antud juhul B164A5 rakkude suhtes tsütotoksilised (Pavel et al., 2017). Samal ajal ei piisanud bedak sejuki madalamatest kontsentratsioonidest UVB-indutseeritud rakkude arvu suurendamiseks. Sellest hoolimata ei langenud rakkude elujõulisuse langus alla 50 protsendi ja seega ei olnud mõlemat tüüpi bedak sejuki puhul võimalik saada IC50. Selle tulemusena valiti järgmise analüüsi raviannusteks kaks suuremat annust, 50 g/l ja 100 g/l.

FRAP-testis leiti, et Japonica bedak sejukil oli kõrgemantioksüdantvõrreldes Indica omagabedak sejuk. Erinevusi võib seletada asjaoluga, et japonica riisiterasid kasvatatakse Aasia parasvöötmes ja külmemates piirkondades, indica riisiterasid aga kogu troopilises Aasias (Garris et al., 2005). Keskkonnatemperatuur mängib taimede antioksüdantsetes aktiivsustes olulist rolli ning külmema ilmaga kasvatatud taimedel on tugevam antioksüdantne toime kui taimedel, mida kasvatati soojema ilmaga. Seda antioksüdantse aktiivsuse suurenemist võib seostada rohkemate fütokemikaalide tootmisega, kuna taimed kogevad külmema ilmaga stressi (Kumar et al., 2017).

On ka teisi fermenteeritud riisitooteid, mis on näidanud paljutõotavaid tulemusi. Esiteks on Galactomyces'i fermentfiltraat (GFF), mis on Galactomyces'i pärmiga riisi kääritamise kõrvalsaadus. GFF ekstrakt sisaldab ainulaadset vitamiinide, mineraalide, väikeste peptiidide ja oligosahhariidide segu, mida kasutataksekosmeetilinenahahooldustoodete koostisained. Väljavõte on näidanudantioksüdantomadused, kaitstes normaalseid inimese epidermaalseid melanotsüüte (NHEM) oksüdatiivse stressi eest (Woolridge Cooper, 2018). Need GFF-i leiud olid sarnasedbedak sejukselles uuringus.

Riisikliidel on ka tugev antioksüdantne toime, mis põhjustab tsütotoksilisust melanotsüütide suhtes. Kuid kui riisikliid on kääritatud, on riisikliide ekstrakti tsütotoksilisus B16F1 rakkude suhtes kõrvaldatud. See näitab, et riisi aju kääritamine andis uusi kasulikke bioloogiliste funktsioonidega ühendeid, kuigi täpsed ühendid on veel välja selgitamata (Chung et al., 2009).

Lõpuks riisi leotusvesi pulbristbedak sejuksisaldab tegelikult aminohappeid, mis võivad olla kasulikud kosmeetilistes rakendustes. Indica bedak sejukis ja selle leotusvees on tuvastatud 16 aminohapet 17-st. Glutamiinhape oli kõrgeim aminohappe kontsentratsioon nii Indica bedak sejukis kui ka selle leotusvees (Johar et al., 2018). Glutamiin (glutamiinhappe derivaat) lisaks arginiinile, türosiinile ja lüsiinile, mida tuvastatakse bedak sejukis ja selle leotusvees, on kosmeetikatööstuses kasutatavate peamiste aminohapete hulgas (Ha et al., 2018). Pealegi, aminohapped seeskosmeetilinetooted toimivad kuiantioksüdandid(Ivanov et al., 2013) ja aminohapete sisaldus Indica bedak sejukis oli palju suurem võrreldes selle leotusveega. Seega oli bedak sejuki kasutamine aminohapete sisalduse osas leotusveega võrreldes efektiivsem (Johar et al., 2018).

Kokkuvõttes Indica ja Japonicabedak sejuktuleb täiendavalt uurida, enne kui saab väita, et neil on potentsiaal melanoomi kemopreventsiooni vahendina, mis on võimeline (1) ennetama melanoomi, (2) ennetama pahaloomulise melanoomi teket pahaloomuliste kahjustuste eelsetest kahjustustest või (3) ennetama melanoomi kordumist. pärast edukat melanoomiravi (Chhabra et al., 2017).