Cistanche Salsa tubulosiid B päästab PC12 neuronaalsed rakud 1-metüül-4-fenüülpüridiiniumioonide poolt põhjustatud apoptoosist ja oksüdatiivsest stressist

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Guoqing Zheng, Xiaoping Pu, Li Lei, Pengfei Tu, Changling Li

Abstraktne:

NeuroprotektiivCistanche'i tubulosiidi B mõju, üks hiinlastest eraldatud fenüületanoidetaimne ravim Cistanche salsa, uuriti 1-metüül-4-fenüülpüridiiniumioonide (MPP pluss) poolt indutseeritud apoptoosi ja oksüdatiivset stressi PC12 neuronaalsetes rakkudes. MPP-ga töödeldud PC12 rakud – läbisid apoptootilise surma, mis määrati MTF-testi, voolutsütomeetria ja DNA agaroosgeelelektroforeesiga; reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) rakusisest akumulatsiooni mõõdeti DCFH-DA värvimisega laserskaneeriva konfokaalse mikroskoopiaga (LSCM). Samaaegne ravi tuhulosid B-ga nõrgendas märkimisväärselt MPP＋-indutseeritud tsütotoksilisust, DNA fragmentatsiooni ja ROS-i rakusisest akumulatsiooni. Need tulemused näitavad tugevalt, et tubulosiid B hoiab ära MPP-indutseeritud apoptoosi ja oksüdatiivse stressi. Tubulosiidi B võib kasutada kuiParkinsoni tõve vastaneagendid.

Sissejuhatus

Patoloogiliselt iseloomustab juhuslikku Parkinsoni tõbe (PD) tavaliselt katehhoolamiinergiliste neuronite, eriti substantia nigra pars compacta (SNc) dopamiinergiliste neuronite kadu ja iseloomulike intraneuronide esinemine| mõjutatud ajupiirkondades, mida nimetatakse Lewy kehadeks. Vaatamata mitmesugustele teguritele, mis on seotud PD patogeneesiga, on PD initsiatsiooni ja progresseerumisega seotud mehhanismid endiselt ebakindlad. Kuigi PD põhjus on endiselt lahendatud, viitavad mitmed tõendid kindlalt oksüdatiivse stressi osalusele, mis lõpuks viib. neuronite surma või apoptoosini vabade radikaalide liigse tekke tõttu [1], [2], [3]. Seda hüpoteesi toetab veelgi asjaolu, et nigraalne dopamiinergiline süsteem võib toota kõrgel tasemel vabu radikaale ja sellel on suhteliselt madal antioksüdatiivse kaitsesüsteemi tase. Nii in vivo kui ka in vitro uuringud näitasid l-metüül-4-fenüül-l,2,3,6-tetrahüdropüridiini (MPTP) aktiivse metaboliidi MPP＋ oksüdatiivset stressi vahendatud neurotoksilisust dopamiinergilistel neuronitel [4 ], [5]. Oksüdatiivse stressi poolt liigselt toodetud vabade radikaalide kaasamine neurodegeneratiivsete häirete, nagu PD, lähima põhjusena viitab antioksüdantide pöördelisele rollile. Tubulosiid B (joonis l) oli üks fenüületanoidühenditest, mis eraldatiCistanche salsa. Varasemad uuringud on leidnud, et paljud fenüületanoidid, sealhulgas tubulosiid B, näitasid tugevat vabade radikaalide püüdmise aktiivsust [6], [7].

Arvestades neid leide, uurisime käesolevas uuringus tubu]nside B mõju MPP pluss-indutseeritud neurotoksilisusele in vitro, kasutades sümpaatilise närvi feokromotsütoomi rakuliini PC12, mida on aastate jooksul edukalt kasutatud neuronaalse funktsiooni uurimiseks [8], [9].

Parkinsoni tõve vastu võitlemine:cistanche

Materjalid ja meetodid

Materjalid

Tubulosiid B alatesCistanche salsapakkus lahkelt dr Li Lei (Pekingi ülikooli farmaatsiateaduste kooli loodustoodete osakond, Peking, Hiina). Ühendi puhtus oli HPLC analüüsi järgi üle 98%. Dulbecco modifitseeritud Eagle'i sööde (DMEM), hobuseseerum ja vasikaloote seerum osteti ettevõttelt GIBCO BRL, 1-metüül~-fenüülpüridiiniumioon (MPP pluss), polü-L-lüsiin, 3-(4, 5 -dimetüültiasool-2 -üül)-2, 5- difenüültetrasooliumbromiid (MTT), propiidiumjodiid (PI), RNaas A, proteinaas K ja 2,7'-diklorofluorestseiindiatsetaat (DCFH-DA) osteti firmalt Sigma.

Rakukultuur

PCI2 rakke hoiti DMEM-is, millele oli lisatud 10 protsenti hobuseseerumit, 5 protsenti vasikaloote seerumit, 100 U/ml penitsilliini ja 100 ug/ml streptomütsiini. Rakke kultiveeriti 37 kraadi juures niisutatud inkubaatoris, mida aereeriti 95% õhu ja 5% CO2-ga. Kõik katsed viidi läbi 24-48 h pärast rakkude külvamist. Rakud koguti rutiinselt 0,25-protsendilise trüpsiniseerimisega, kui rakud lähenesid subkonfluentse staadiumile ja plaaditi 25 cm kultiveerimiskolbidesse, mis olid jagatud suhtega 1:8.

Rakkude elujõulisuse analüüs

Rakkude elujõulisus määrati modifitseeritud MTT testi abil, nagu eelnevalt kirjeldatud [10]. Lühidalt, PC12 rakud külvati 96-süvendiplaatidele tihedusega I × 104 rakku süvendi kohta. Kultuure kasvatati 48 tundi ja seejärel vahetati sööde vastu, mis sisaldas erinevas kontsentratsioonis tubulnside B või MPP＋. Pärast kuni 48-tunnist ja 72-tunnist inkubeerimist lisati 96-süvendiplaatidele MTr lahus (5 mg/ml DMEM-s) ja rakkudel lasti inkubeerida 4 tundi 37 kraadi juures. Pärast söötme eemaldamist solubiliseeriti raku- ja värvikristallid 200 µl DMSO lisamisega ja neeldumist mõõdeti 570 nm juures (võrdlusseade 540 nm) mudeli 550 mikroplaadilugejaga (Bio-Rad). Rakkude elujõulisust analüüsiti ka trüpaansinise välistamismeetodi abil. Rakud koguti, sadestati õrnalt ja värviti 3 vihmaks 0,6-protsendilise trüpaansinise lahusega. Seejärel hinnati mittevärviliste rakkude protsenti kümnel juhuslikult valitud mikroskoobiväljal. Positiivse ravimina kasutati 100 ng／ml epidermaalset kasvufaktorit (EGF).

Apoptoosi tuvastamine voolutsütomeetria abil

Apoptootilised rakud tuvastati voolutsütomeetria abil, kasutades propiidiumjodiidi (PI) [11]. Lühidalt, umbes 1 × 106 rakku, mida inkubeeriti uuritavate ainetega, koguti tsentrifuugimisega ja pesti üks kord PBS-ga. Rakud fikseeriti 70% etanooliga 24 tundi - 20 kraadi juures ja pesti üks kord PBS-ga. Seejärel resuspendeeriti rakud 300 µl PBS-is, mis sisaldas 0,5 mg/ml RNaasi ja 0,5 mg/ml PI-d. Pärast edasist 30-minutilist pimedas inkubeerimist viidi läbi voolutsütomeetria FACScaniga (Becton Dickinson, Heidelberg, Saksamaa).

Rakendasime Moore'i protokolli [12], mis eraldas ainult fragmenteeritud DNA ja katsed normaliseeriti, kasutades igast katserühmast võrdset arvu kultuure. Lühidalt, 3 × 106 neuronit igast töödeldud proovist pesti Hanki tasakaalustatud soolalahuses (1000g 10 minutit) ja katseklaasi põhja moodustunud pelletid homogeniseeriti. 1 ml lüüsipuhvriga (10 mM Tris, pH 7,4, 5 mM EDTA, 1% Triton X{11}}) 20 minutit jääl. Pärast tsentrifuugimist 11, 000 g 20 vihmaga 4 kraadi juures eemaldati fragmenteeritud DNA-d sisaldavad supernatandid ja digereeriti 20 mg/ml RNaas A-ga 37 kraadi juures 1 tund ja 0,1 mg/ml proteinaas K-ga 56 kraadi juures. veel 1 h. Fragmenteeritud DNA ekstraheeriti fenooli ja kloroformiga ning tsentrifuugiti 10, 000g juures 1 vihma jooksul temperatuuril 4 °C. Vesifaas viidi uude Eppendorfi katsutisse, segati 2 mahuosa jääkülma etanooliga ja seejärel asetatakse DNA sadestamiseks vähemalt 1 tunniks temperatuurile -20. Pärast tsentrifuugimist temperatuuril 15, 000g 20 minutit temperatuuril 4 kraadi, supernatandid eemaldati ja DNA pelleteid pesti üks kord 80% etanooliga (15 000 g 15 minutit 4 kraadi juures), kuivatati õhu käes ja lahustati 20 µl TE-s. puhver pH 7,6 juures. Seejärel elektroforeesiti kogu proovi 1,5% agaroosgeelil 1 tund 85 V juures. Geeli uuriti ja pildistati Ultra Violet Products Gel Documentation System (GELDOC-2000, Bio-Rad, USA) abil.

Intratsellulaarse ROS-i moodustumise mõõtmine

Intratsellulaarsete peroksiidide moodustumist tuvastati konfokaalse skaneeriva lasermikroskoobiga, kasutades mittefluorestseeruvat ühendit 2"7"-diklorofluorestseiindiatsetaati (DCFH-DA) [13], mis esterdatakse rakkudes endogeensete esteraaside toimel ioniseeritud vabaks happeks, 2 ;7"-diklorofluorestseiin. 2",7-Diklorofiuorestsiin on hüdroantioksüdantide toimel oksüdeeritav fluorestseeruvaks 2"7"-diklorofluorestseiiniks (DCF). Rakke inkubeeriti 10 μM DCFH-DA-ga 30 minutit 37 kraadi juures. Kultuure pesti kaks korda Hanki tasakaalustatud soolalahusega ja pildistati samas söötmes. Pildistamine viidi läbi konfokaalse skaneeriva lasermikroskoobiga, DCF ergutati lainepikkusel 488 nm ja emissioonifilter oli 510 nm barjäärfilter. Õige võrdluse tagamiseks kasutati kõigi vaatluste jaoks samu võtteparameetreid. Lahtrite keskel määrati optimaalne vertikaalne asend ja seejärel skaneeriti väli kiiresti. Kuna valgustus ergastuslainepikkusel 488 nm põhjustas selle värvaine oksüdeerumise tõttu suurenenud fluorestsentsi, eksponeeriti iga väli valgusega täpselt sama kaua. Stimuleerimata rakkude algväärtusi kasutati kontrollväärtustena, et võrrelda neid MPP-ga töödeldud rakkudega tubulosiid B juuresolekul või puudumisel. Pärast skaneerimist kvantifitseeriti keskmine suhteline fluorestsentsi intensiivsus 15-20 neuronaalsetes rakukehades mikroskoobivälja kohta neljas punktis. eraldi kultuurid ravitingimuste kohta.

cistanche

Statistiline analüüs

Kõik saadud väärtused väljendati keskmistena ± SD. Rühmadevaheliste erinevuste statistiline olulisus määrati Studenti t-testiga; Arvutatud p väärtused alla 0,05 loeti statistiliselt oluliseks.

Tulemused

Nagu on näidatud joonisel 2, põhjustas MPP pluss annusest sõltuva PCI2 rakkude elujõulisuse vähenemise. Seevastu EGF, hästi tuntud neurotroofne faktor, kaitses oluliselt rakkude elujõulisust 100 ng/ml MPP juures. Tubulosiid B (5, 10, 50 või 100 ug-ml) juuresolekul nõrgenesid ka tsütotoksilised toimed. ), kuigi väiksema toimega kui võrdlusravim (joonis 3). Tubulosiid B avaldas nendel kontsentratsioonidel annusest sõltuvat tsütoprotektiivset toimet ja ühend üksi ei põhjustanud mingit ilmset tsütotoksilisust (andmeid pole näidatud). 200 µM MPP plussiga töödeldud PCI 2 rakkude DNA ekstrakti geelelektroforees 48 tundi näitas DNA redelit. apoptoosi klassikaline tunnus, tubulosiid B, annustes 10 ja 100 µg·ml, põhjustas DNA redeli moodustumise (joonis 4) ja joonis 5 näitab PC12 rakkudes indutseeritud apoptootilise rakusurma voolutsütomeetrilise analüüsi tüüpilisi histogramme. tubulosiidi B juuresolekul või puudumisel. Rakutsükli profiili kvantifitseerimine PI-ga näitas subdiploidsete omadustega rakkude arvu (M1 piirkond), mis viitab apoptootilisele DNA fragmentatsioonile. Töötlemata rakkudes oli apoptootiline subdiploidne fraktsioon minimaalne kuni 5–94% 10 000 rakust (joonis 5 A). Pärast 48-tunnist kokkupuudet MPP-ga suurenes apoptoosi protsent 43°02;j-ni (joonis 5 B). Rakukultuurile lisatuna inhibeeris tubulosiid B annusest sõltuval viisil MPP-indutseeritud apoptoosi. Kontsentratsioonil 10 ug·ml-1 ei olnud tubulosiidi B kaitse statistiliselt oluline, kuid 50 ja 1 00ug·ml-1, vastavalt 45 ja 63% vähenemine. täheldati, mille tulemusena suurenes ellujäämisrakkude protsent (joonis 5D, E).

Intratsellulaarse ROS-i kogunemist saab tuvastada DCFH-DA．PC12 rakkude kasutamisega, mida töödeldi 200 uM MPP＋ 48 tunni jooksul, mis näitas pärast DCFH-DA värviga värvimist rakus intensiivset fluorestsentsi (joonis 6). Samaaegne ravi tubulosiidiga B (annustes 10 ja 100 ug·ml) inhibeeris MPP＋一 indutseeritud ROS-i tootmist (vähendatud protsent oli vastavalt 24,52 ja 55．63%).

Arutelu

PD patogenees hõlmab tugevat oksüdatiivset stressi, vähenenud antioksüdantide taset ja mitokondriaalseid defekte. kõik teadaolevalt kutsuvad esile apoptoosi mitmes rakusüsteemis. Eelkõige on näidatud, et vabad radikaalid põhjustavad neuronites aktiivse rakusurma[14]. MPTP tekitab pöördumatu ja raske parkinsonismilaadse sündroomi, mis põhjustab inimestel nigrostriataalsete dopamiinergiliste neuronite selektiivset degeneratsiooni. Seda neurotoksiini on kasutatud PD loommudelite loomiseks[15]. Monoamiini oksüdaas B muudab MPTP MPP-ks, mis koguneb mitokondritesse. kus see inhibeerib mitokondriaalset kompleksi I ja neid mitokondriaalseid päevi. funktsioon põhjustab apoptoosi[16]. Seetõttu on MPP pluss 一 indutseeritud neurotoksilisust dopamiinergilistes neuronites laialdaselt kasutatud PD etioloogilise mudelina neuroprotektiivsete ainete skriinimisel.

Käesolevas uuringus näitasime, et tubulosiid B vähendas PC12 rakkudes MPP pluss indutseeritud rakusurma oksüdatiivse stressi tõttu. Lisaks näitasime, et tubulosiid B kaitses annusest sõltuval viisil ka MPP pluss indutseeritud DNA redeli vastu. ja apoptoos, mõõdetuna DNA geelelektroforeesi ja voolutsütomeetrilise analüüsi abil. Lisaks pärssis samaaegne töötlemine tubulosiidi B kõrgemate kontsentratsioonidega MPP-indutseeritud ROS-i tootmist. Seega on tubulosiid B näidanud multifunktsionaalset neuroprotektiivset toimet. Tubulosiid B toimega võivad olla seotud mitmed mehhanismid, eraldi või koos. Antioksüdantne toime on võimalik tubulosiid B-vahendatud neuroprotektsiooni mehhanism. Xiong Q leidis, et tubulosiid B avaldas tugevat vabade radikaalide püüdmise aktiivsust 1,1-difenüül-2-pikrüülhüdrasüülradikaali ja ksantiin]ksantiinoksüdaasi tekitatud superoksiidi aniooni radikaali suhtes [6].

Hiljuti on teatatud, et mitmetel fenüületanoididel on vabu radikaale püüdvad omadused ja need kaitsevad oksüdatiivse stressi põhjustatud toksiliste vigastuste eest. MPP pluss toodetud ROS, nagu vesinikperoksiid, superoksiidi anioon ja hüdroksüülradikaal, kahjustavad kergesti bioloogilisi molekule, mis võib lõpuks viia apoptootilise või nekrootilise rakusurma. Seega võib tubulosiid B-l olla otsene eemaldav toime ROS-i vastu. Kuigi meie andmed ei määra täpset kohta, kus tubulosiid B toimib ROS-i akumulatsiooni pärssimiseks, viitavad need siiski sellele, et neuroprotektiivne mehhanism hõlmab antioksüdantide radade stimuleerimist. Tubulosiidi B molekulaarstruktuuri uuring näitab ka, et sellel on tugev võime vabade radikaalide eemaldamiseks (isiklik suhtlus).

Asjakohased võivad olla ka muud mehhanismid. Näiteks võib tubulosiid B olla võimeline neutraliseerima MPP toksilisust, pärssides mitokondriaalse läbilaskvuse üleminekupooride avanemist ja düsfunktsiooni. Lisaks tuleks kaaluda ka seda, kas tubulosiid B-l on otsene kasvu soodustav toime neuronaalsetele rakkudele. Tubulosiidi B neuroprotektiivse toime täpne mehhanism jääb ebaselgeks. Selle neuroprotektiivse toime täieliku pildi selgitamiseks on vaja täiendavaid uuringuid.

Kokkuvõttes on Cistanche salsaekstraktist pärit tubulosiid B-l ilmne kaitsev toime MPP pluss-indutseeritud apoptoosile ja oksüdatiivsele stressile. Selle neuroprotektiivne toime MPP ＋ toksilisuse vastu võib olla oluline ja viitab sellele, et sellel võib olla terapeutiline potentsiaal PD ennetamisel ja ravis.

PD ravi: cistanche

Viited

7. Xiong Q, Tezuka Y, Kaneko 1", Li H, Tran LQ Hase K, Namba T, Kadota S. Lämmastikoksiidi inhibeerimine fenüületanoididega aktiveeritud makrofaagides. Eur J Pharmaco12000; 400:137–44

8. Greene LA, Tischler AS. Närvi kasvufaktorile reageerivate neerupealiste feokromotsütoomi rakkude noradrenergilise kloonliini loomine. Proc Nat Acad Sci 1976; 73:2424-8

9. Yao Z, Drieu K, Szweda LI, Papadopoulos V. Vabad radikaalid ja lipiidide peroksüdatsioon ei vahenda amüloidist põhjustatud neuronaalse rakusurma. Brain Res 1999; 847: 203- 10

10. Yamamoto T, Yuyama K, Nakamura K, Kato T, Yamamoto H. Lämmastikoksiidi toksilisuse kineetiline iseloomustus PC12 rakkudele: NO vabanemise poolestusaja mõju. Eur J Pharmacol 2000; 397:25-33

11. Nicoletti l, Migliorati G, Pagliacci MC, Grignani E Riccardi C. Kiire ja lihtne meetod tümotsüütide apoptoosi mõõtmiseks propiidiumjodiidiga värvimise ja voolutsütomeetria abil. J Immunol Methods 1991; 139: 271-9

12. Moore KJ, Matlashewski C. Leishmania do nova rakusisene infektsioon pärsib makrofaagide apoptoosi. J Immunol, 1994; 152: 2930- 7

13. Mark RJ, Keller JN, Kruman I, Mattson MP. Põhiline FGF nõrgendab amüloidpeptiidist põhjustatud oksüdatiivset stressi, mitokondriaalset düsfunktsiooni ja Na ＋-K ＋-ATPaasi aktiivsuse halvenemist hipokampuse neuronites. Brain Research 1997; 756: 205-14

14. Merad-Boudia M, Nicole A, Santiard-Baron D, Saille C, CeballosPicot L Mitokondriaalne kahjustus kui varane sündmus apoptoosi protsessis, mis on põhjustatud glutatiooni kadumisest neuronaalsetes rakkudes: olulisus Parkinsoni tõvega. Biochem Pharmaco11998; 56: 645-55

15. Langston JW, Ballard P, Tetrud JW, Irwin I. Krooniline parkinsonism inimestel, mis on tingitud meperidiini analoogsünteesi produktist. Teadus 1983; 219:979-80

16. Mizuno Y, Sone N, Suzuki K, Saitoh T. Uuringud 1-me etüül-4-fenüülpüridiiniumioonide (MPP＋) toksilisuse kohta hiire aju mitokondritele. J Neurol Sci 1988; 86: 97-110