Cistanche Deserticola lihava varre transkriptoomi kokkupanek ja geenide avastamine - Ⅱ

Kõigi väljendatud ärakirjade funktsionaalne klassifikatsioon, mis põhineb geeniontoloogial ja KEGG andmebaasidel

Gene Ontology (GO) annotatsioon saadi UniProti annotatsiooni ja identiteedi assotsiatsioonifailist. Kokku määrati 1745 funktsionaalsele terminile 20 907 transkripti, mis moodustasid 32, 69% kõigist ekspresseeritud järjestustest. Funktsionaalsetest GO-terminitest moodustasid suurema osa määramised bioloogilisele protsessile (1116, 63,95%), millele järgnesid rakukomponent (329, 18,85%) ja molekulaarne funktsioon (300, 17,20%). Ekspresseeritud transkriptide määratud funktsioonid hõlmasid laia valikut GO kategooriaid ning 10 kõige enam kommenteeritud transkriptsiooniga GO terminit on loetletud tabelis 3. Pakume kõik väljendatud transkriptide jaotust kolmes geeniontoloogia kategoorias (molekulaarfunktsioon, rakukomponent ja bioloogiline protsess) lisafailis (S3 Dataset). Seondumisfunktsioonide ja transferaasi aktiivsusega seotud GO terminid olid valdavalt esindatud molekulaarse funktsiooni kategoorias. Seoses seondumisfunktsioonidega oli kõige rohkem katioonide sidumine (4394 transkripti), millele järgnesid nukleotiidide/nukleosiidide sidumine (keskmiselt 3404 transkripti) ja valkudega seondumine (2422 transkripti). Transferaasi aktiivsuse rühmas on enim neid, kellel on ülekantavad fosforit sisaldavad rühmad (2256 transkripti, 65, 77%). Rakuliste komponentide kategoorias paiknesid transkriptid rohkem intratsellulaarses (keskmiselt 10 581 transkripti), samas kui bioloogiliste protsesside kategoorias osalesid transkriptid rohkem biopolümeeri metaboolses protsessis (keskmiselt 6683 transkripti), millele järgnes rakuprotsessi reguleerimine (4 841 transkripti). ), geeniekspressiooni (4678 transkripti) ja transporti (3512 transkripti).

LOODUSLIK TUBULOOS ALZHEIMERI HAIGUSE VÄLTIMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Ligniini ja PhG biosünteesis osalevate geenide kaevandamiseks otsiti KEGG andmebaasis 21 358 mitteliigset potentsiaalset valgujärjestust 13 taimeorganismi geenijärjestuste vastu ja need määrati 275 KEGG rajale vähemalt 5 tabamusega. Tabelis 4 on loetletud 10 parimat rada, millel on kõige rohkem joondatud järjestusi. Enamik radu osalesid primaarsetes metaboolsetes protsessides, nagu aminohapete või valkude metabolism (ko01230, ko04141 ja ko04120), süsivesikute metabolism (ko01200 ja ko00500) ning nukleotiidide või valgu metabolism. nukleosiidide metabolism (ko03018, ko00230 ja ko00240). Lisaks on olemas 27 sekundaarset metabolismiga seotud rada (joonis 2), nagu terpenoidi selgroo biosüntees, fenüülpropanoidi biosüntees, karotenoidide biosüntees, isokinoliini alkaloidide biosüntees ning tropaani, piperidiini ja püridiini alkaloidide biosüntees. Need tulemused näitavad täiendavat viidet sellele, et veres toimusid aktiivsed metaboolsed protsessidC. deserticolatüve kude. Kõik KEGG radadega seotud ekspresseeritud transkriptid olid loetletud täiendavas failis (S4 Dataset). Kuigi C. deserticola ja teiste taimede, näiteks riisi (S5 andmestik) vahel on mõningaid oluliselt muutunud teid, on meie selle uuringu peamine eesmärk paljastada kogu C. deserticola varre transkriptsiooniprofiil ja kujutada PhG-de biosünteesi sellega seotud radasid. millest võiks kasu olla kasvatamise juhtimisel.

Ligniini biosünteesis osalevaid ensüüme kodeerivad kandidaatgeenid

Ligniin on taimeriigis suuruselt teine ​​looduslik maapealne polümeer, mis moodustab kuni ühe kolmandiku taime rakuseintes leiduvast materjalist. Rakuseinte olulise komponendina aitavad ligniinid vett transportida, pakuvad mehaanilist tuge ja struktuuri terviklikkust ning kaitsevad patogeenide ja taimtoiduliste eest. Need ligniini rollid on väga väärtuslikud C. deserticola maa-aluse erektsiooni kasvu toetamisel kõrbes. Selles uuringus esitasime täieliku pildi C. deserticola ligniini biosünteesi radadest (joonis 3), kus ligniini monomeerid biosünteesitakse fenüülalaniinist läbi mitmete ensümaatiliste reaktsioonide, sealhulgas hüdroksüülimise, metüülimise, redutseerimise ja oksüdatiivse polümerisatsiooni protsessi. Ligniini biosünteesiga seotud ensüüme tuvastati vaskulaarkoes kolme peamiselt sünteesitud vormi (p-hüdroksüül-fenüül- (H), guajaatsüül- (G) ja syringüül- (S) ligniin) ja 5-hüdroksüül-guajaatsüülligniin, mis tuvastati ainult COMT (kofeiinhappe 3-O-metüültransferaas, EC 2.1.1.68) puudulikkusega (näiteks knock-down) taimedes.

Fenüülalaniini ammoniaaklüaas (PAL, EC 4.3.1.24) on esimene võtmeensüüm ligniini biosünteesi rajas (joonis 3), mis muudab fenüülalaniini kaneelhappeks mitteoksüdatiivse deamineerimise teel. Kokku sekveneeriti 6297 PAL-i lugemist ja 7 PAL-i transkripti koostati C. deserticola-s (tabel 5). Järjestuste sarnasuste võrdlemisel leidsime, et 4 neist (komp28550_c1_seq1/2/3/5) olid enam kui 95% sarnasused C. deserticola (gi|) teadaoleva mRNA järjestusega. 289595227|gb|ADD12041.1|), samas kui comp3}c1_seq4 ja comp25940_c0_seq1 sarnasused olid vastavalt 77% ja 82%. ORF-i ennustus näitas, et 5 transkriptil oli potentsiaali kodeerida valke ja need olid kantud aromaatse aminohappe lüaasi domeeniga (PF00221.14). Nende hulgas suutis ainult comp1}c1_sekv4 transkript kodeerida 718 aminohappejäägist koosnevat täielikku valgujärjestust. On teatatud, et enamikus taimeliikides kodeeris PAL-i väike mitmegeeniline perekond, näiteks 4 Arabidopsis thaliana, 5 Populus trichocarpa, 3 Scutellaria baicalensis ja 7 Cucumis sativus jne. Meie fülogeneetiline analüüs näitas, et neid oli 4 PAL-i kodeerivad geenid C-s.

deserticola ja panime neile nimeks vastavalt CdPAL1, CdPAL2, CdPAL3 ja CdPAL4 (S2 joonis 1). 4-kumaraat-CoA ligaas (4CL, EC 6.2.1.12) ja trans-tsinnamaat 4-monooksügenaas (CYP73A, EC 1.14.13.11) on kaks ensüümi, mis vastutavad kaneelhappe muundamise eest dikumarool-CoA-ks kahes vastupidises faasis. korraldusi. Need on ka selgroos ja nende ekspressiooni FPKM väärtused on vastavalt 39,57 ja 51,93.

Neli tüüpi ligniine biosünteesiti erinevatel radadel, mida kontrollisid kolm peamist ensüümi, tsinnamoüül-CoA reduktaas (CCR, EC 1.2.1.44), šikimaat o-hüdroksütsinnamoüültransferaas (HCT, EC 2.3.1.133) ja ferulaat{{1 {56}}}}hüdroksülaas (F5H, EC 1,14.-.-). CCR-ist teatati ligniiniraja kontrollpunktina [50, 51], mis katalüüsis X-CoA (X, sealhulgas dikumarool, kofeoüül, feruloüül, 5-hüdroksüül-feruloüül ja sinapoüül) Y-aldehüüdiks (Y sealhulgas p -puma, kofeoüül, koniferüül, 5-hüdroksüülkoniferüül ja snap), samal ajal kui HCT katalüüsis p-kumaroüül-CoA p-kumaroüülšikimiinhappeks/p-kumaroüülkiniinhappeks. Need kaks ensüümi, nagu lüliti, reguleerisid P-hüdroksüül-fenüülligniinide või ülejäänud kolme tüüpi ligniinide biosünteesi. F5H oli veel üks harulüliti, mis reguleeris süringüülligniini ja 5-hüdroksüülguajaatsüülligniini. Muud olulised ensüümid, sealhulgas kofeiinhappe 3-O-metüültransferaas (COMT, EC 2.1.1.68), kofeoüül-CoA O-metüültransferaas (CCoAOMT, EC 2.1.1.104) ja tsinnamüülalkoholdehüdrogenaas (CAD, EC 1.1.1.195). ) tuvastati ka väljendatuna. Üksikasjalik ekspressiooniteave on loetletud tabelis 6. Need selles uuringus tuvastatud ensüümigeenid on väärtuslik ressurss selle olulise ravimtaime funktsionaalsete genoomiuuringute jaoks. Tabelis 6 toodud ligniinide biosünteesi rajaga seotud 10 geeni valiti RT-qPCR kontrollimiseks, et kinnitada meie RNAseq tulemusi (joonis 4), ja nende kõrged korrelatsioonid (Pearson korrelatsioonikoefitsient: 0, 90343) näitasid meie transkriptoomianalüüsi suurt täpsust ja reprodutseeritavust. S1 Dataset loetleb selles analüüsis kasutatud praimerite järjestused.

LOODUSLIK TUBULOOS SUGUFUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Kandidaatgeenid, mis kodeerivad PhG-de biosünteesis osalevaid ensüüme

Fenüületanoidglükosiidid (PhG-d) on teadaolevalt C. deserticola peamised aktiivsed koostisosad, mis parandavad seksuaalset potentsi, eemaldavad vabu radikaale ja pidurdavad vananemist. PhG-de kolm keemilist komponenti on orgaaniline hape, sahhariid ja fenüületanooli aglükoon (joonis 3). Orgaanilised happed, sealhulgas kofeiinhape, feruulhape ja kumaalhape, on fenüülpropanoidi biosünteesiraja saadused. Sahhariidi komponendid, sealhulgas glükoos ja ramnoos, on süsivesikute ainevahetuse produktid, nagu tärklise ja sahharoosi metabolism, aminosuhkru ja nukleotiidsuhkru metabolism, fruktoosi ja mannoosi metabolism jne. Fenüületanooli osa biosünteesi rada pole aga veel selge. Siin pakkusime välja kaks võimalikku fenüületanooli biosünteesi rada, mis põhinevad meie järjestuse andmetel. Üks on teatatud kofeiinhappe või feruulhappe rada, mida tuntakse ka kaneelhappe rajana, mis on sarnane ligniini biosünteesi põhirajale. Teine põhineb fenüülalaniini metabolismi rajal (joonis 3), mille käigus fenüülalaniin fenüületanooliks saavutati teadaoleva Enrlichi raja abil, mis leiti esmakordselt pärmist sajand tagasi ja valideeriti petuunia lilledel, tomatil ja roosil. C. deserticola varres tuvastati neli ensüümi geeni, mis kodeerivad aspartaat/türosiinaminotransferaasi, histidiinfosfaataminotransferaasi ja primaarset amiini oksüdaasi, mis vastutavad fenüülalaniini fenüületanooliks muundamise eest. Fenüületanooli produkti võib täiendavalt oksüdeerida monooksügenaasi abil või metüülida metüültransferaasi toimel selle derivaatideks (fenüületanooli aglükooniks), mis osalevad PhG biosünteesis. Kokkuvõttes pakuti välja kaks oletatavat fenüületanooli aglükooni biosünteesi rada.C. deserticolakuid vajab veel edasist uurimist.

Arutelud

Viimastel aastatel on taimede genoomika uue põlvkonna sekveneerimistehnoloogia rakendamisel kiiresti arenenud, samas kui kõrbe ravimtaimede genoomikale on keskendunud vähesed uuringud. Kiiresti on vaja läbi viia genoomilised või transkriptoomilised uuringud, et mõista selle kohanemist põua ja soolsuskeskkonnaga ning peamiste bioaktiivsete komponentide biosünteesi rada. Mõnede meditsiinitaimede de novo transkriptoomi avastus,

nagu Panax ženšenn, Ginkgo biloba ja Glycyrrhiza uralensis on esmakordselt ära kasutatud Roche 454 platvormi abil selle pika lugemise pikkuse jaoks. Tõhusa kokkupanekuvõime tõttu lühikeste lugemistega, eriti soodsate paarisotsaga lugemistega, on Illumina-põhist transkriptsiooni järjestamist ja kokkupanekut laialdaselt kasutatud ka mudel- ja mittemudelorganismide jaoks. Käesolevas uuringus genereerisime umbes 8G 101 bp paarisotsa lugemist ja tootsime pikemaid unigeenseid järjestusi keskmise pikkusega 725 aluspaari. Suuremahulised tüvespetsiifilised transkriptsiooniandmed võivad anda kasulikke võrdlusandmeid ja neid saab kasutada C. deserticola bioaktiivsete komponentide sekundaarse metabolismi kaevandamiseks. 81,62% kogu toorlugemistest läbis enne kokkupanemist ranged kvaliteedifiltrid (sealhulgas adapteri kärpimine ja madala kvaliteediga lugemiste äraviskamine), mis viitab meie järjestusandmete kõrgele kvaliteedile ja 82,08% kvaliteetsetest lugemistest oli kokkupanekul kasulikud. Muud lugemised, mida kokkupanekuks kasutada ei õnnestunud, võivad tuleneda järjestusvigadest, koosteparameetritest jt. Need kasutamata kvaliteetsed lugemised aitasid tulevikus parandada de novo kokkupanekut koos pikema lugemisega teiselt platvormilt (nt Roche 454).

LOODUSLIK TUBULOOS SUGUFUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Suur hulk kokkupandud transkripte (30 098) näitasid suuri järjestuste sarnasusi avalikes andmebaasides tuntud geenidega, mis viitab sellele, et meie Illumina-põhised paarisotsa andmed hõlmasid märkimisväärse osa C. deserticola transkriptidest. BLAST-i tabamusteta transkriptid võivad olla tingitud C. deserticola 3' või 5' transleerimata piirkondadest, mittekodeerivast RNA-st või uutest geenijärjestustest. Ekspresseeritud transkriptid märgiti paljudele GO kategooriatele ja KEGG radadele (tabelid 3 ja 4), milles paljud transkriptid määrati sekundaarsetele metabolismiga seotud radadele. Nagu me teame, võib fenüülpropanoid toimida indutseeritava antimikroobse ühendina, mis on maa-aluse elustiili jaoks väga kasulik [1], ja lisaks meditsiinilisele kasulikkusele toimida ka signaalmolekulina taimede ja mikroobide koostoimes [68, 69]. Terpenoidi kasutatakse bioaktiivsete komponentide (nagu 6- deoksükatalpool) biosünteesiks [70]. Leidsime, et fenüülpropanoidi ja terpenoidi karkassi biosünteesi rajas osalevaid geene oli C. deserticola puhul väga palju. Veelgi olulisem on see, et hästi esindatud ligniini biosünteesi radade avastamine (joonis 3) näitas ligniini aktiivset metaboolset protsessi C. deserticola tüves. Kõik teadaolevad ligniini biosünteesis osalevad ensüümgeenid (joonis 3) tuvastati ekspresseerituna ja neljal võtmeensüümil, sealhulgas PAL, CCR, HCT ja F5H, oli madalam ekspressioonisagedus (vastavalt FPKM 26,47, 3,89, 3,4 ja 3,83) võrreldes muud ensüümigeenid (tabel 6). See, kas nende kolme geeni ekspressioonimuutus võib mõjutada C. deserticola ligniini tootmist või mitte, väärib edasist uurimist. PAL on ligniini biosünteesi võtmeensüüm ning osaleb ka fenüülpropanoidi, resveratrooli, flavonoidi ja kumariini biosünteesis [71–74]. Avastasime C. deserticola genoomis (joonis S2) neli erinevat PAL-i geeni, mis langes kokku sellega, et PAL-i kodeeris väike mitmegeeniline perekond [39, 43, 45–49] ja lisaks tõestasime, et see võib mängida olulist rolli metaboolses süsinikuvoos. .

PhG on C. deserticola peamine toimeaine. Fenüületanooli biosünteesis osalevad geenid on C. deserticola kvaliteedi seisukohalt olulised. Järeldasime kaks erinevat fenüületanooli ja 17 ensüümi geeni biosünteesi rada, mis osalesid C. deserticola tüves PhG biosünteesis. Võimalikud kohvi-/feruulhappejärgsed protsessid (joonis 3) tuletati samuti esimest korda välja vahesaaduste ja vastavate ensüümide katalüütiliste omaduste struktuurvalemi põhjal, milles kohv/feruulhape oksüdeeritakse esmalt fenüülpüruvaadi derivaadiks; seejärel jäeti karboksüülrühm ilma dekarboksülaaside poolt; lõpuks muudeti aldehüüdrühm dehüdrogenaasi toimel tagasi alkoholirühmaks. See on Illumina paarisotsa sekveneerimistehnoloogia esimene rakendus, et uurida kogu C. deserticola transkriptoomi ja koostada RNA-seq lugemisi ilma võrdlusgenoomita. See uuring pakub tulevikus kasulikke ressursse ja geenijärjestusi C. deserticola funktsionaalse genoomika ja proteoomika uurimiseks.

Järeldused

Selles uuringus profileerisime C. deserticola tüve transkriptoomi suure läbilaskevõimega sekveneerimisandmete põhjal, tuvastasime ligniini biosünteesiradades osalevad geenid ja tegime esimest korda järelduse ka PhG-de potentsiaalse biosünteesi raja kohta, mis kindlasti kiirendab arusaamist. mitmetähenduslikest füsioloogilistest protsessidest ja suurest meditsiinilisest väärtusest molekulaarsel tasandil. Siiani on see esimene katse de novo kokku panna kogu C. deserticola tüve transkriptoom ja tuvastada meditsiiniliste komponentide biosünteesi rada, kasutades Illumina-põhiseid sekveneerimisandmekogumeid. Meie uuring võib soodustada looduslike ravimite väljatöötamist ja raviomadustega kultivaride valikut.

LOODUSLIK TUBULOOS SUGUFUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%