Tolerantsus NADH/NAD pluss tasakaalustamatuse suhtes eeldab vananemist ja vananemisvastaseid sekkumisi

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

KOKKUVÕTE

Redokspaarid koordineerivad raku funktsiooni, kuid nende tasakaalustamatuse tagajärjed on ebaselged. See on mõnevõrra seotud nende eksperimentaalse kvantifitseerimise piirangutega. Siin me väldime neid raskusi, esitades lähenemisviisi, mis iseloomustab treeningupõhiseid tolerantsiprofiile redokspaaride tasakaalustamatuse suhtes, kasutades metabolismi silikoonist esitust. Keskendudes NADH / NAD1 redokspaarile pärmis, demonstreerime, et redutseeriv tasakaalustamatus tekitab metaboolseid sündroome, mis on võrreldavad vähirakkudes täheldatutega.cistanche ekstrakti eelisedPärmi mutantide taluvus redoks-tasakaaluhäire suhtes võib samuti seletada 30 protsenti nende eksperimentaalselt mõõdetud kronoloogilise eluea varieeruvusest. Veelgi enam, ennustades mõnede metaboliitide olulisust tasakaalustamatuse vastu võitlemisel, tuvastame õigesti patoloogia mehhanismide aluseks olevad toitained, eluiga kaitsvad molekulid või kaloripiirangu mimeetikumid. Tolerantsus redoks-tasakaaluhäirete suhtes muutub sel viisil usaldusväärseks, mis annab raamistiku vananemisfenotüübi omaduste äratundmiseks, olles samal ajal kooskõlas vananemisvastaste sekkumiste hindamise bioloogilise põhjendusega.

SISSEJUHATUS

Redoks-homöostaasi uuringud on viimase kahe aastakümne jooksul oluliselt laienenud, kujundades pidevalt ümber klassikalisi arusaamu oksüdatiivsest rakukahjustusest (Halliwell ja Gutteridge, 2015). Selle homöostaasi aluseks olevate kõige paradigmaatilisemate molekulaarsete ainete hulgas ilmnevad redokspaaride suhted, nagu glutatiooni, NADPH ja NADH konjugeeritud vormide suhted. Nii glutatioon kui ka NADPH toimivad mitokondrites reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) oluliste eemaldamismehhanismidena, samas kui NADPH ja NADH seovad vastavalt anaboolsed ja kataboolsed rajad raku redoksolekuga.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Sellegipoolest tunnustatakse jätkuvalt uusi mehhanisme, mis seovad NADPH / NADP * ja NADH / NAD * paare redoks-homöostaasiga. Näiteks NADPH / NADP pluss tasakaal selgitab osaliselt AMP-aktiveeritud proteiinkinaasi ellujäämist soodustavaid tagajärgi (She et al., 2014). Samuti seostab see ööpäevast ajamõõtmist redoksseisunditega (Rey et al., 2016). Praegu arvatakse, et NADH/NAD pluss suhe on seotud mitokondriaalse ja tuumafunktsiooni koordineerimisega, DNA parandamise ja rakulise identiteedi epigeneetilise reguleerimisega ning energia metabolismi häälestamisega keskkonnamuutujatele (Canto et al., 2015; Gomes et al. al. 2013). Mittepatoloogilistes tingimustes kõigub NADH / NAD* suhe hapniku pingega, hüpoksiliste tingimuste ja kõrgema hapniku kättesaadavusega, mis ilmnevad vastavalt redutseerivate ja oksüdatiivsete kõrvalekalletega (Clanton, 2007; Graef et al., 1999).

Kuid kasvav huvi redokspaaride suhete vastu tuleneb peamiselt nende mõjust patoloogiasse.cistanche tšingis-khaanROS-i ilmumist nii redutseerivas (hüpoksiline, NADH-le kalduv) kui ka oksüdatiivses (hüperoksiline, NAD pluss kalduvus) meeltes on seostatud erinevustega optimaalsest redokspotentsiaalist, mis tagab mitokondrite parima jõudluse (Aon et al., 2010). Clanton, 2007). Vähi osas võib vähenenud NADH/NAD pluss olla aluseks glioblastoomide letaalsusele (Gujar et al., 2016) ja soodustada käärsoolevähi progresseerumist (Hong et al., 2019), kuid see võib päästa ka mõningaid terveid fenotüüpe erineval määral rakkudest. muud kasvajatüübid (Garrido ja Djouder, 2017).

Cistanche on vananemisvastane toime

NADH-st on saanud ka Toronto bioloogia huvipakkuv koht. Selles kontekstis põhjustas NAD pluss basseini suurendamine vananemise ja muude sellega seotud patoloogiliste fenotüüpide osalise pöördumise organismide lõikes (Das et al., 2018; Mendelsohn ja Larrick, 2014; Wei jt, 2017; Zhu jt. , 2017) ning on leitud, et vananevad ja neoplastilised rakud põhjustavad NADH/NAD pluss suhte tasakaalustamatust (Braidy et al., 2011; Schwartz ja Passonneau, 1974; Wiley jt, 2016). Lisaks on NADPH äsja avastatud rollid ja esilekerkiv NADH / NADH kontseptsioon redoks-homöostaasi ja vananemise pearegulaatorina kooskõlas vananemise metaboolse stabiilsuse teooriaga (Demetrius, 2004). See teooria viitab sellele, et vananemise põhjuseks on redokspaaride püsiseisundi tasemete haavatavus juhuslike keskkonnahäirete suhtes ensüümi reaktsioonikiirustes, ja teeb mitmeid huvitavaid ennustusi, mis kehtivad inimeste kohta.

Arvestades kõiki neid tagajärgi, on paljud uuringud uurinud redokspaaride suhete fenomenoloogiat kas nende tasemete passiivse teatamise või neid aktiivselt muutes. Eksperimentaalsed manipulatsioonid on aga keerulised. Traditsioonilisemad süüdistavad sügavaid eksperimentaalseid hoiatusi (Sun et al., 2012) ja uuemad jätavad endiselt tähelepanuta teatud bioloogilised asjaolud, kuna need on piiratud temperatuuri ja pH intervallidega (Hung et al., 2011; Zhao jt, 2015). Peale selle on eksperimentaalselt kallis jälgida mitmesuguseid fenotüüpe, mis järgnevad koensüümide kogumite muutmisele metaboliitide lisamise teel (Hou et al., 2010) ja NAD(H) tarbivate ensüümide mutatsioonide või üleekspressiooni tõttu (Bait al., 2011; Felipe et al., 1998). Seega on vaja alternatiivseid strateegiaid, et käsitleda redoks-homöostaasi kontrolli redokspaaridega manipuleerimise kaudu, samuti on vaja meie arusaama selle kontrolli bioloogilistest tagajärgedest.

In silico mudelid muutuvad praktiliseks uurimisstrateegiaks alati, kui eksperimentaalsed lähenemisviisid on piiratud, mille eeliseks on see, et see võimaldab vaadeldavate nähtuste täielikku mehhaanilist ülevaadet. Genoomi skaala metaboolsed mudelid, mida saab uurida voolu tasakaalu analüüsi (FBA) abil (Orth et al, 2010), on muutunud süsteemibioloogia standardiks metaboolsete häirete tagajärgede uurimiseks rakufunktsioonile (meetodid S1). Muuhulgas on nad aidanud avastada uusi antibiootikume ja kemoterapeutikume, välja töötada huvipakkuvate ainete tööstuslikuks tootmiseks optimeeritud bakteritüvesid ja paremini mõista inimese ainevahetushaigusi (Burgard et al., 2003; Pagliarini et al. 2016; Raman et al., 2009). FBA kasutamisel on täiendav eelis, et see annab ülevaate metaboolsetest nähtustest ilma mittemetaboolsete segavate tegurite (geneetilised, epigeneetilised, mehaanilised jne) mõju. Seega sobivad genoomipõhised metaboolsed mudelid eriti hästi redoks-homöostaasist kõrvalekallete metaboolsete tagajärgede uurimiseks.

Siin kasutame FBA-d redokspaaride tasakaalu uurimiseks ainuraksete eukarüootide Saccharomyces cerevisiae genoomi mastaabis rekonstrueerimisel, millega iseloomustame saadaoleva NADH / NAD pluss voo kontrollitud häirimise metaboolseid ja pikaealisusega seotud tagajärgi erinevates geneetilistes valdkondades. taustad. Täpsemalt näitavad meie tulemused, et tolerantsus selle tasakaalustamatuse suhtes põhjustab spetsiifilist metaboolset ümbersuunamist, mis meenutab patoloogiat, ja selgitab ka enam kui veerandit postmitootilise eluea spetsiifilisest varieeruvusest. Lisaks aitab see raamistik meil visandada arvutusprotokolli (mida me rakendame ka loomade ja inimeste metaboolsete mudelite puhul), et tuvastada metaboliite ja ensüüme, mis võivad vanusega seotud patoloogiate kontekstis olla terapeutilised sihtmärgid.

TULEMUSED

Fitnessil põhinev tolerantsiprofiil iseloomustab redokspaari häireid

Redokspaari konjugeeritud vormide vahelise tasakaalustamatuse esindamiseks lisasime vastava metaboolse võrgu genoomi skaala rekonstrueerimisse kunstliku pöörduva reaktsiooni - "tasakaaluhäire reaktsiooni" (STAR-meetodid). Reaktsioon oksüdeerib või vähendab paari, võttes arvesse spetsiifilisi raku sektsioone (nt tsütosool, mitokondrid jne) ja selle aktiivsust saab fikseerida mis tahes soovitud kiiruse väärtusele. Kõigi nende väärtuste jaoks saab arvutada kasvukiiruse ("fitness"), mis toimib pärmiraku tolerantsi selle konkreetse seisundi suhtes. Lõpuks määratletakse tolerantsiprofiil, arvutades vahemiku kasvukiiruse tasakaalustamatuse väärtustest (joonis 1A; pange tähele, et redutseerivad / oksüdatiivsed tingimused on kogu käsikirjas esitatud vastavalt sinise / punase värviga).

Tolerantsiprofiilid näitavad tavaliselt maksimaalset kasvu nulli tasakaalustamatuse punkti ümber, kusjuures ligikaudu kõik kõrvalekalded (st reaktsiooni nullväärtusest erinevad väärtused) põhjustavad sobivuse vähenemist. See rõhutab asjaolu, et ainevahetuse toimimiseks peab redokspaari suhet ühes mõttes häälestavate reaktsioonide aktiivsus olema proportsionaalne nende aktiivsusega, mis häälestavad seda teises mõttes. Täpsemalt, NADH / NADt tsütosoolne tasakaalustamatus S.cistanche eluea pikendamineCerevisiae, mis kasvab glükoosil ja aeroobsetes tingimustes, annab profiili, mille maksimaalne kasv on märkimisväärselt nihkunud oksüdatiivse poole suunas tasakaalustamatuse profiili punktis, kus ~50 mmol/DW/tunnis NADH muundatakse NADH-ks (joonis 1B). Arvestades selle asemel mitokondrite tasakaalustamatust, täheldasime nulli tasakaalustamatuse punktis maksimumi (joonis 1C), mustrit, mida täheldasime sarnaselt ka teistes profiilides (joonis S1). Üldiselt muutuvad taandavad tingimused

Joonis 1. Tolerantsiprofiil iseloomustab reaktsiooni redoks-tasakaaluhäiretele

(A)Ülemine. Võtsime kasutusele kunstliku reaktsiooni organismi metaboolses rekonstrueerimise mudelis (antud juhul pärmi), et teisendada redoks-koensüümi kaks konjugeeritud vormi (siin NADH / NADH paar). Kõigi tasakaalustamatuse tingimustes, st tehisreaktsiooni kiiruse väärtuste korral, rakendame kasvukiiruse arvutamiseks voo tasakaalu analüüsi. Altpoolt. Prognoositavad kasvu väärtused on graafikul koos tolerantsi profiili piiritleva tasakaalustamatuse kiiruse väärtustega; ainevahetuse taluvuse asendusnäitaja valitud häiringuga silmitsi seistes.cistanche nz(B) Tolerantsuse profiil pärmis, mis on seotud tsütosoolis paikneva tasakaalustamatusega.

(C) Mitokondrites paikneva tasakaalustamatusega seotud pärmi taluvusprofiil. Sinine/punane varjund tähistab vastavalt vähenenud ja oksüdeeritud tasakaalustamatuse režiime ning hallid täpid näitavad väärtusi, mis vastavad tasakaalustamatuse puudumisele või äärmuslikule redutseerivale/oksüdatiivsele tasakaalustamatusele, mis ei põhjusta kasvu. kahjulik ja surmav kiiremini kui oksüdatiivsed režiimid. Kahel juhul (tsütosoolse NADH või mitokondriaalse tioredoksiini konjugeeritud paarid) parandab paari kerge kunstlik oksüdatsioon kasvu (joonis S1).

NADH/NAD* häired põhjustavad metaboolseid sündroome, mis meenutavad patoloogiat

Pärmi energia metabolism tasakaalustamatuseta vastab iseloomulikule aeroobsele metabolismile glükoosi juuresolekul (uuritud kasvutingimused), milles glükolüüs on seotud trikarboksüülhappe tsükli (TCA) ja oksüdatiivse fosforüülimisega. Pentoosfosfaadi rada oksüdeerib glükoosi ja annab riboosi -5P nukleotiidide sünteesiks ja NADPH-ga sündinud redutseerivat jõudu anabolismi jaoks, samas kui anaplerootilised teed väljuvad TCA tsüklist, sarnaselt glutamiini metabolismi omadega, mida kasutatakse mõõdukalt peamiselt pürimidiini ja pürimidiini toitmiseks. aminohapete süntees. FBA võimaldab meil kvantifitseerida muutusi nendes radades ja seda, kuidas need lõpuks üksikasjalikult kirjeldavad mis tahes konkreetse tasakaalustamatuse režiimi aluseks olevaid metaboolseid tunnuseid.

Täpsemalt näitab joonis 2A, kuidas tsütosoolse NADH / NADH redutseeriv tasakaalustamatus põhjustas glükolüütilise voo suurenemise, TCA tsükli ja elektronide transpordiahela aktiivsuse vähenemise ning glutamiini metabolismi tõusu. See pseudohüpoksiline metaboolne tunnus - hapniku juuresolekul - meenutab anaeroobset metabolismi, kus glükolüüs on seotud alkohoolse või piimhappe fermentatsiooniga, mis kahjustab mitokondriaalseid radu; pentoosfosfaadi raja hapnikku sisaldav osa suletakse ja glutamiini metabolism, mis on aktiivsem, võidakse suunata ümber püruvaadi tootmiseks, mis aitab kaasa anabolismile. Nimelt hõlmab see fenotüüp mõningaid paradoksaalse saagise metabolismi tunnuseid, mida on täheldatud erinevat tüüpi vähirakkudes (Warburgi efekt) (Potter et al., 2016).

Joonis 2. Pärmi taluvusprofiili aluseks olevate energiahalduse peamiste radade vood (A) Tsütosoolne NADH/NAD tasakaalustamatus (ülemine) ja viie tüüpilise raja voo väärtused (alumine); i/glükolüüs (glükolüüs, tuum), ii/Krebsi tsükkel (TCA, roosa), ili/pentoosfosfaat (Penphos, roheline), iv/oksüdatiivne fosforüülimine (Oxphos, hall) ja glutamiini metabolism (Glutamiin, lilla). Esitatud voovektorid on konkreetse raja kõigi reaktsioonide voo keskmistamise tulemus.

(B) Sama mis (A) mitokondriaalse tasakaalustamatuse osas. Pange tähele, et negatiivsete voogude olemasolu glükolüüsis (paneel A, alumine) tähistab suurenenud glükoneogeneesi. Vaadake üksikasju põhiteksti kohta.

Seevastu oksüdatiivse tolerantsuse aluseks olev energia metabolism (seoses tsütosooliga, joonis 2A) oli aeroobsema konfiguratsiooniga, kuid sellel olid iseärasused, nagu eriti aktiivne polüamiini metabolism; ja äärmuslikud omadused, sealhulgas suurenenud glükoneogenees, oksüdatiivne fosforüülimine ja TCA tsükli aktiivsus, samuti väga kõrge (normaalsest tasemest kuni 12-kordne) voog läbi pentoosfosfaadi raja. Viimane võib sellegipoolest olla biomassi pseudoreaktsiooni erinevuste artefakt väga kõrge (55 mmol/gDW/h) oksüdatiivse tasakaalustamatuse korral (vt meetodeid S1).

Kui tasakaalustamatuse reaktsioon paikneb mitokondrites, tekitas NADH redutseerimine taas teatud pseudohüpoksilise käitumise ühe erinevusega (joonis 2B). Glükolüüsi ja glutamiini metabolismi läbiv voog suurenes koos TCA tsükli osade ja pentoosfosfaadi raja kadumisega. Kuid erinevalt tsütosoolsest juhtumist suurenes oksüdatiivne fosforüülimine märkimisväärselt. Teisest küljest oli mitokondriaalse profiili oksüdatiivne külg omapärasem: glükolüütiline aktiivsus suurenes paralleelselt TCA tsükliga, kuid oksüdatiivne fosforüülimine töötas enamasti normaalsest madalamal tasemel ja glutamiini metabolismil oli vähe tähtsust.

Metaboolsed sündroomid tulenevad kompromissist redoks-tasakaalu, biomassi tootmise ja ATP/NADH kompromissi vahel.

Tuvastasime mitu võtmeelementi, mis kujundasid varasemaid sündroome.cistanche peenise suurusOksüdatiivsele häirele vastati teravnenud aeroobse reaktsiooniga kompromissina kasvu säilitamise ja tasakaalustamatuse häirete puhverdamise vahel. See hõlmas voo ümbersuunamist maksimaalse võimaliku arvu reaktsioonide kaudu, mis vähendasid NAD plusi, säilitades samal ajal globaalse voo jaotuse, mis oli võimeline tootma biomassi koostisosi. Need kaks mehhaanilist elementi (häiringupuhverdus ja biomassi maksimeerimine) on optimeerimisprobleemi kõige olulisemad nõuded ja piisavad tolerantsiprofiili oksüdatiivse režiimi kirjeldamiseks.

Joonis 3. Konkureerivad mehhanismid põhjustavad pärmi pseudohüpoksilist käitumist

(A) Tasakaal NADH, ATP ja biomassi prekursorite tootmise vahel soosib reaktsioonimooduleid, mis toodavad võimalikult palju ATP-d ja nii vähe NADH-d, et kompenseerida redutseerivate režiimide tagajärgi, nt glükolüüsi kasutamine TCA-ga. Pange tähele, et lillad nooled tähistavad ATP tootmist, kollased nooled tähistavad NAD(H) tootmist ja valged ringid näitavad biomassi prekursorite teket. (B) NADH-le kalduv NADH/NADt häiring (x-telg) kattub kunstliku ADP-ga. fosforüülimisreaktsioon (y-telg), mis viib jõuliselt taandava jõu ATP kujul tasakaalustamata ainevahetusse. Roheline värvigradient tähistab glükolüütilise ja Krebsi tsükli voo vahelist suhet, mis on normaliseeritud selle normaalväärtusega (kuni 100- korda). Võib mõista, et ADP fosforüülimine vähendab pseudohüpoksilist fenotüüpi ja lükkab edasi vaikust.

Redutseeriv külg nõudis siiski ühte täiendavat ülevaadet. Kuna üha rohkem NADH-d eraldatakse NADH-reaktsioonidesse, mis kasutavad NADt-d ja on otseselt või kaudselt vajalikud biomassi koostisosade tootmiseks, muutuvad üha piiratumaks, mistõttu tuleb energia metabolismi ümber suunata, et võimaldada NADH-i kõrgem muundamine NAD-ks ja piirata NAD' vähendamine NADH-ks. See on endiselt ebapiisav, et häirega toime tulla, kuna suurem osa NADH-i vormis esinevast redutseerivast võimsusest on paljude metaboolsete eesmärkide, reaktsioonide ja kasvu jaoks kasutu: NADH-s salvestatud energia tuleb ADP-le ümber paigutada. Seega peab ainevahetus eelistama reaktsioonimooduleid, mis toodavad võimalikult palju ATP-d ja nii vähe NADH-d kui võimalik; see peab tuginema šuntidele ja radadele, millel on kõrge ATP/NADH saagis, nt glükolüüs ja oksüdatiivne fosforüülimine.

Need tulemused vähendasid muu hulgas TCA tsüklit ja suurendasid glükolüütilist voogu (joonis 3A). Selle ATP/NADH kompromissi mõju edasiseks uurimiseks kattusime redutseeriva NADH/NAD häiringu kunstliku reaktsiooniga, mis võimaldab ADP fosforüülimist. . Simulatsioonid näitasid, et redutseerivat metabolismi iseloomustav kõrgenenud glükolüüsi ja TCA tsükli voo suhe sõltub ATP/NADH saagisest.

Joonis 4. Tolerantsuse skoor pärmi kronoloogilise eluea ennustajana

(A) Pärmi mutantide taluvusprofiilid; kõvera sinised/punased sektorid esindavad NADH/NADH tasakaalustamatuse taandavat/oksüdatiivset režiimi.

(B) Seos normaliseeritud tolerantsi skoori (proportsionaalne tasakaalustamatuse väärtuste laiusega nii oksüdatiivse kui ka redutseeriva režiimi korral, STAR meetodid) ja kronoloogilise eluea vahel. Korrelatsioon selgitab ~30 protsenti kogu dispersioonist (R'= 0). 29, p-väärtus=3,2x 10-4, N= 41).

(C) Selle seose vaatamise alternatiivse viisina saime regressioonikalde väärtuste histogrammi, mis saadi kümne tuhande juhuslikult genereeritud seose tolerantsuse skoori ja eluea vahel. Sellest valimist leiame ainult 3 juhtumit, mille puhul seos tolerantsuskoori ja eluea andmete vahel on tugevam kui leitud (näidatud punase vertikaalse joonega).

(Joonis 3B). Jõuliselt fosforüüliv ADP vähendab seda pseudohüpoksilist tunnust isegi väga tugeva NADH-le kalduva tasakaalustamatuse korral.

Tolerantsus selgitab eksperimentaalseid kronoloogilisi eluea erinevusi erinevate pärmimutantide vahel

Järgmisena küsisime, mil määral võiks taluvusprofiil toimida eluea ennustajana, arvestades, et redokspaare on käsitletud potentsiaalsete eluea määrajatena. Üks viis selle uurimiseks on arvutada pro-fail erinevates mutantides (joonis 4A) ja seejärel kvantifitseerida, kuidas see vastab täpsetele eluea mõõtmistele, normaliseeritud kronoloogilisele elueale (CLS), mis on saadaval eksperimentaalselt mõõdetud mutantide ellujäämiskõverate põhjal (Garay et al., 2014). CLS-id arvutatakse nende mutantide ellujäämiskõverate põhjal statsionaarse faasi ellujäämise suurenemisena võrreldes metsiktüübiga.

FBA-s simuleeritakse spetsiifiliste geenide mutatsioone, piirates nendega seotud reaktsioonide voogu Boole'i ​​reeglite abil, mis seovad iga keemilise reaktsiooni ORF-idega, mis transleerivad reaktsiooni ensüümi (STAR-meetodid). Iga sellise mutandi jaoks arvutasime välja mutandi taluvusprofiili (joonis 4A) ja kasutasime tolerantsuse skalaarse skoorina (STAR) tasakaalustamatuse absoluutväärtuste summat, mille korral kasvukiirus väheneb poole võrra (nii redutseerivas kui ka oksüdatiivses režiimis). meetodid).

Meie mutantide komplekti piirasid siiski mõned piirangud (STAR-meetodid). Nimelt ei suutnud me eristada taluvuse erinevusi, mis olid alla 10 ppm metsiktüüpi väärtusest, ilma et oleks saavutatud ülemääraseid arvutusaegu, ja paljudel mutantidel esines nii tühiseid erinevusi elueas kui ka ebaolulisi erinevusi taluvuses. Lisaks leitakse üldiselt, et FBA ei ole võimeline iseloomustama funktsiooni suurendamise deletsioone ja üsna ennustatavalt ei ületanud ükski mutantide tolerants metsiktüübi omast.

Lisaks nendele piirangutele suutsid in silico tolerantsiprofiilid selgitada -30 protsenti eksperimentaalselt mõõdetud eluea varieeruvusest (joonis 4B, R2= 0.29, N=41,p väärtus{{5). }}.2x 10-) suure tähtsusega:10,000 andmepaaride randomiseerimine tõi kaasa ainult 3 suurema regressioonikalde esinemise (joonis 4C).

Tavalised toitained võimaldavad taluda NADH/NADH tasakaalustamatust

Lõpuks uurisime, kas spetsiifilised toidumetaboliidid olid redoks-tasakaaluhäirele reageerimisel eriti määravad. Sel eesmärgil kasutasime FBA mudelite lisafunktsiooni, milleks on võimalus pääseda juurde konkreetse metaboliidi kasutamisele (määratletud kui tarbimiskiirus püsiseisundis, STAR meetodid). Uurisime, kuidas see määr muutus redutseeriva ja oksüdatiivse NADH / NAD pluss tasakaalustamatuse väärtuste suurenemisega.

Kasutamine oli profiili mõlemal küljel ja enamiku metaboliitide puhul üsna lineaarne. Seega sobitasime selle muutuva mustri lineaarse mudeliga ja pidasime (absoluutset) kallet skalaariks, mis esindab vastava metaboliidi olulisust redokside tasakaalustamatuse talumisel (joonis 5A). iAZ900 kõige paremini reageerivate toitainete hulgas märkasime toidust saadavaid metaboliite, mis teadaolevalt mängivad pärmi eluea reguleerimisel olulist rolli, nagu atsetaat (Burtner et al., 2009), samuti paljusid, mis pikendavad eksperimentaalselt pärmi, usside ja usside eluiga. või isegi inimese rakud (Madeo et al., 2018; Mishur et al., 2016), sealhulgas malaat, hüdroksübutüraat, spermidiin või oksaloatsetaat (joonised 5B-5D, tabel S1).

Teatud toitained olid olulisemad NADreduktsiooni taluvuse, teised NADHoksüdatsiooni ja mõned nende mõlema režiimi suhtes. Kõige olulisemad redutseeriva taluvuse jaoks toidus saadavad metaboliidid olid järjekorras atsetaat, beeta-hüdroksübutüraat (BHB), glutamaat ja glutamiin (joonis 5B), samas kui NADH oksüdatsiooni talumisel olid kõige olulisemad atsetaat, NADP plus, putrestsiin ja spermidiin. (Joonis 5D). Nende hulgas, kes osalesid profiili mõlemal küljel tolerantsuse tõttu, olid kõige olulisemad atsetaat, glutamaat, oksaloatsetaat ja oksoglutaraat (joonis 5C).

Kaalusime teiste organismide metaboolseid mudeleid, et veelgi kinnitada, millised toitained on tasakaaluhäiretele reageerimisel määravad tegurid (meetodid S1, vt ka joonist S2, kuidas peamiste radade vood muutuvad). Kõik need peamised panustajad muutusid, kuigi mitte laialdaselt, kuna alfa-ketohapped, redokspaarid, teatud vitamiinid ja teatud aminohapped olid oluliselt vajalikud NADH/NADt häirete kontrollimiseks C.elegansis ja inimese rekonstrueerimisel. Nende organismide kõige levinum reaktsioon redoks-tasakaaluhäirele on seotud metaboliitidega, mis vahendavad pH homöostaasi, nagu atsetaat, vesinikkarbonaat, bifosfaat, naatrium, vesi ja muud sarnased. Samamoodi eristab glutamaadi, glutamiini, aspartaadi, treoniini, seriini ja glütsiini asjakohasus neid teistest aminohapetest ja enamikust metaboliitidest. Keskmise suurusega oksüdeeritud happed, nagu oksoglutaraat, malaat ja oksaloatsetaat, mängivad samuti püsivat rolli taluvuses, nagu biotiin ja mõned folaadid (täieliku loendi leiate tabelist S1).

ARUTELU

Pakume siin välja alternatiivse lähenemisviisi redokspaaride muutuste laiaulatuslike bioloogiliste tagajärgede mõistmiseks. See lähenemisviis põhineb in silico metaboolsetel mudelitel ja tutvustab tolerantsprofiili mõistet kui mõõdet, mis kvantifitseerib raku vastupanuvõimet nendele muutustele.

Joonis 5. Homöostaatilised toitained pärmis

(A) Toiteaine kasutusprofiil koos sellele vastava redutseeriva (sinine) ja oksüdatiivse (punane) lineaarse regressiooniga, mida iseloomustavad vastavalt nõlvad m ja m (absoluutväärtustes). Lisasime taustal viitena tsütosoolse tolerantsuse profiili.

(B) 4 parima homöostaatilise toitaine lineaarse regressiooni nõlvad (m,) NADH / NAD pluss häiringu redutseerivas tähenduses.

(C) top4 toitainete lineaarsed regressiooninõlvad, mis on homöostaatilised häire mõlemas mõttes; Sinine: redutseeriv lineaarse regressiooni kalle; Punane: oksüdatiivse lineaarse regressiooni kalle.

(D) 4 parima homöostaatilise toitaine lineaarsed regressiooninõlvad (m) NADH / NAD pluss häiringu oksüdatiivses mõttes.

Profiili aluseks olevad metaboolsed kohandused näitavad redutseerivate NADH režiimidega seotud pseudohüpoksilise fenotüübi olemasolu. See fenotüüp meenutab mõningaid näiliselt paradoksaalseid madala saagisega energia metabolismi, mida on täheldatud vähkkasvajate puhul (Warburgi efekt) ja seda tuntakse ära ka pärmi (Crabtree efekt) ja bakterite (ülevoolu metabolism) rakkudes (Basan et al., 2015; Mori et al., 2015). 2016; Potter et al., 2016). Viimastel aastatel on välja pakutud võimalus, et selle käitumise võivad põhjustada ressursside eraldamise piirangud, mis tulenevad suhteliselt kõrgest kasvust või glükoosi omastamise määrast (Basan et al, 2015; Mori et al, 2016). Kuid pseudohüpoksiline fenotüüp, mida me täheldame, ei sõltu kasvukiirusest ja glükoosi omastamisest ning tegelikult esineb see koos madalate kasvumääradega (STAR-meetodid). Oleme näidanud, et selle põhjus peitub põhimõttelises ATP/NADH kompromissis – seda põhjendust toetab hiljutine eksperimentaalne uuring (Maldo-nado ja Lemasters, 2014).

Lisaks viitab meie vooanalüüs sellele, et redutseeriv NADH / NAD pluss tasakaaluhäired võivad ATP säilitamist negatiivselt mõjutada. Arvatakse, et suurenenud NADH on ATP kättesaadavuse vähenemise korrelatsioon, kuna oksüdatiivse fosforüülimise kahjustus võib põhjustada nii NADH / NAD plussi kui ka ATP / ADP vähenemise. Näitame, et väliselt tekitatud NADH tasakaalustamatus võib olla ortogonaalsete metaboolsete mehhanismide kaudu energia kättesaadavuse vähenemise põhjuseks, isegi kui oksüdatiivne fosforüülimine toimib üle normaalse taseme. See on vananemisuuringute kontekstis väga oluline, kuna vähenenud energia kättesaadavus ja ATP/ADP suhe on rakkude vananemise ja vanusega seotud patoloogiate säilinud tunnus (Moreira et al., 2003; Pall, 1990; Yaniv et al., 2013). ) ja võib soodustada toksiliste jäätmete kogunemist ja proteostaasi kadumist (veel üks vananemise tunnus), vähendades valkude käivet ja pikendades seega valgu poolestusaega (Anisimova et al., 2018).

Järgmisena püüame kindlaks teha meie raamistiku paikapidavuse eluea ja redoks-tasakaaluhäireid puhverdavate toidumetaboliitide ennustajana. Tolerantsus eeldab raku eluiga, kuid saadaolevast andmekogumist tulenevad piirangud. Kontrollides neid piiranguid (Garay et al., 2014), leiame, et saadud korrelatsioonid on endiselt piisavad tõendid tolerantsuse ja CLS-i erinevuste vahelise seose kohta.

Vastupidiselt meie ootustele on meie toidumetaboliitide analüüsist saadud kõige selgem õppetund see, et peamine tasakaalustamatuse reaktsiooni põhjustav aine ei sõltu eriti NADt päästevõrgust. Tõepoolest, peamised "homöostaatilised toitained" on TCA tsükli ja teiste keskse metabolismi osade vaheühendid, mille toime on palju läbitungavam kui NAD prekursoritel. Lisaks on reaktsioonide tähtsus, mis redokspaari ja peamiste metaboolsete radade vahel sillana toimides redutseerisid või oksüdeerisid NAD(H), NADt päästmist piiravate ensüümide (nagu nikotiinamiidmononukleotiid-adenüültransferaas) omast.

Näiteks oksaloatsetaadi ja oksoglutaraadi skoor pärmimudelis nelja kõige tõhusama metaboliidi hulgas, mis on tolerantsuse aluseks nii redutseerivates kui ka oksüdatiivsetes tingimustes, mis on järjekindel omadus, mis kinnitab varasemaid katsetulemusi (Chin et al., 2014; Williams et al., 2009). . Teiste oluliste metaboliitide hulka kuuluvad hüdroksübutüraat, mis on järjekindlalt näidanud, et see pikendab eluiga, reguleerib NAD-i ja vahendab nälgimisele reageerimist (Edwards et al., 2014; Newman ja Verdin, 2014) ja spermidiini, mis kuulub polüamiinide perekonda ja on teadaolevalt mängivad rolli vanusega seotud protsessides, autofaagias ja DNA kaitses (Eisenberg jt, 2009; Minois et al. 2011: Pietrocola jt 2015).

Eelmise hindamise tugevdamiseks kasutasime C.elegansi ja inimmudeleid, paljastades laiema pildi, mis keskendub pH homöostaasile, redokspaaridele ja TCA tsüklile. See viitab sellele, et viisid, kuidas pH (Burtner et al., 2009) ja NADH tasakaalustamatus (Ayer et al., 2014) määravad rakkude vananemise, on sügavalt läbi põimunud. Lisaks pH-le on NADH/NAD pluss tasakaalustamatuse reguleerimiseks kõige levinumad ja olulisemad toitained alfa-ketohapped oksaloatsetaat ja oksoglutaraat, nende amiinitud vormid ja muud mitokondritega seotud metaboliidid nagu malaat, püruvaat ja fumaraat, st põhiline sõlmpunkt. redoks tasakaalu kontroll on TCA tsükkel.

Siiani on mehhanismid, mille kaudu aminohapped ja TCA tsükli vahesaadused mõjutavad pärmi ja C. elegansi eluea pikendamist, ebaselged. Metaboliidid nagu malaat, oksaloatsetaat, fumaraat, valiin, seriin või treoniin võivad tõepoolest pikendada organismide eluiga, kuid nende mõjudeni viivad protsessid on vaieldavad ja keerulised (Edwards et al., 2013, 2015). Meie tulemused näitavad, et kõigi nende pikaealisust soodustavate nähtuste ühine seletus seisneb toitainete mõjus rakkude võimele taluda NADH / NAD pluss suhte häireid.

Võib siiski väita, et mõned vaadeldud metaboliidid tunduvad iseenesestmõistetavad, kuna nad on lõppude lõpuks seotud reaktsioonidega, mis muundavad omavahel NADH ja NAD plus. Küsimus on selles, miks meie tulemustes ei ilmne teisi metaboliite, mis näivad samuti a priori iseenesestmõistetavad. Vastus peitub mehhanismides, mis tagavad FBA-s realistlikud prognoosid. Et toitaine oleks "homöostaatiline" redoks-tasakaalu häirete vastu, ei pea see mitte ainult suurendama NADH või NADt tootmist, vaid olema kesksel rajal või moodulis, millel on kõrge ATP/NADH saagis ja/või võime varustada biomassi koostisosi.

Lõpuks väärivad tähelepanu veel kaks meie tulemuste ülevaadet. Ühest küljest viitavad nad sellele, et vastusena redoks-tasakaaluhäiretele on metaboolsed võrgud valmis üha enam tootma ja/või tarbima mõningaid metaboliite, mida signalisatsioonivõrgud tõlgendavad nii, et need välistavad vajaduse autofagia, antioksüdantide ja hormeetiliste reaktsioonide järele, aga ka paljusid, mis üleliigsed. või on leitud, et toidulisandid pikendavad eluiga ja/või jäljendavad muul viisil kaloripiirangu (CR) mõju viisil, mis sõltub signaaliradadest, mis on seotud CR-vahendatud eluea pikendamisega. See tugevdab varasemaid tõendeid, mis seovad CR ja NADH/NADH tasakaalu osana samast eluiga pikendavast ja tervist edendavast protsessist (Lin et al., 2004).

Teisest küljest näitab meie uuring, et vastusena muutunud suhetele kasutab ainevahetus üha rohkem ka teatud aineid, mis võivad rakku keemiliselt kahjustada, nagu atsetaat, putrestsiin või atseetaldehüüd; samuti mõned, mis võivad soodustada tuumori teket metaboolsete ümberlülituste kaudu, nagu glutamiin, suktsinaat ja fumaraat (Sciacovell et al., 2016). See võib osaliselt seletada redoks-tasakaalu häirega seotud patoloogiaid ja sellega seotud makroskoopilisi protsesse, nagu degeneratiivsed ja onkoloogilised haigused: kui redoks-tasakaalu häireid tuleb puhverdada mürgiste ainetega, siis on need ained tõenäoliselt mehhanismid, millega kaasnevad patoloogiad. - esinevad redoks-tasakaaluhäiretega.

Mõistame, et meie lähenemisviisi redoks-tasakaalu puudumisele võib mõista metaboolse võrgu stabiilsuse uuringu ebatavalise variatsioonina ja et see võib süüdistada teatud hoiatusi, mis jätavad palju arenguruumi. Mis puutub robustsusesse, siis FBA-d kasutanud uuringud määratlesid seda traditsiooniliselt kui objektiivse lahenduse (tavaliselt kasvu) muutust vastusena reaktsioonikiiruse erinevale vähenemisele, nt (Edwards ja Palsson, 2000), mitte konkreetsele häirele (redoks-tasakaalu rikkumine). ) metaboliitides nagu meiegi. Arvestades meie analüüsi piiranguid, võib neid seostada FBA enda sisemiste piirangutega, nagu regulatiivsete geenide puudumine. Lõppkokkuvõttes sõltub meie tulemuste usaldusväärsus metaboolsete rekonstruktsioonide ennustusvõimest: praegused pärmimudelid on ennustavad ja arenenud, kuid need pole täiuslikud (Heavner ja Price, 2015), kuid siiski on need palju paremad kui isegi enamik. saadaval on täpsed mitmerakulised rekonstruktsioonid. Kõigist nendest muredest hoolimata on palju tõendeid, mis õigustavad metaboolsete mudelite kasvavat truudust loomulikule käitumisele.

Praegu kipuvad valitsevad uuringud ignoreerima NADH / NADH suhte valimatu vähendamise võimalikke negatiivseid tagajärgi. See on osaliselt tingitud paljutõotavatest eelistest, mis tulenevad eksperimentaalselt saavutatud kergetest vähenemistest, mis hõlmavad neoplastiliste fenotüüpide vähenemist, eluea pikkust ja tervise pikendamist. Siiski on uusi tõendeid, mis soovitavad nende positiivsete tulemuste suhtes olla äärmise ettevaatusega (Gujarat al., 2016; Hong et al., 2019), samuti on olemas kindel, eksperimentaalselt püsiv teoreetiline raamistik, mis ennustab negatiivseid tagajärgi NADH/NADH suhete vähenemisest kaugemale. lävi (Aon et al., 2010). Meie NADH/NADt tasakaalustamatuse tolerantsi profiilid vastavad sellele tekkivale pildile, kuna kerged oksüdatiivsed kõrvalekalded võivad olla kasulikud, kuid kõrgemad kõrvalekalded on sama kahjulikud kui vastupidine äärmus.

Täpsemalt näitavad meie taluvusprofiilid, et lisaks keemiliste või füsioloogiliste probleemide tekitamisele peavad nii madalal kui ka kõrgel NADH / NADH suhtel olema ka puhtalt metaboolsed puudused, sealhulgas vähenenud energia kättesaadavus ja/või biosünteetiline väljund. Lisaks, ja nagu me juba märkisime, näivad mõnede meie poolt käsitletavate küsimuste kohta kättesaadavad piiratud eksperimentaalsed tähelepanekud meenutavat siin esitatud tulemusi.

Uuringu piirangud

Siin esitatud tulemused paranevad kasutatavate mudelite edasisel täiustamisel. Meie töö kannatab ka FBA kui tehnika sisemiste piirangute all. Näiteks dünaamilise teabeni ei jõuta, kuna praegu saadaolevate dünaamilise vooanalüüsi versioonide ulatus on liiga piiratud. Samamoodi vähendab kaudsete energiapiirangute puudumine voo tasakaalus selle prognoositavust kõrgete kasvumäärade osas. See nõrkus on ajendanud lisama selliseid tehnikaid nagu CAFBA, nagu me käsikirjas kaalusime. Lõpuks oleks huvitav juurdepääs regulatiivsele teabele, mida saab hõlpsasti juhtida ja sisse või välja lülitada. Praegu ei ole FBA-s geeniregulatsiooni rakendamiseks standardiseeritud lähenemisviise. Reaktsiooniaktiivsuse skooride rakendamine piirangupiiridele on selles osas paljutõotav.

See artikkel on välja võetud ajakirjast iScience 24, 102697, 23. juuli 2021