Trombomoduliin leevendab transformeerivat kasvufaktori b1-vahendatud kroonilist neeruhaigust G-valguga seotud retseptori 15/Akt signaaliraja kaudu

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Atsuro Takeshita1,2,8, Taro Yasuma1,2,8, Kota Nishihama1, Corina N. D'Alessandro-Gabazza2, Masaaki Toda2, Toshiaki Totoki4, Yuko Okano1,2, Akihiro Uchida1, Ryo Liqiang6,7,7 Fridman D'Alessandro2, Tetsu Kobayashi3, Yoshiyuki Takei4, Akira Mizoguchi5, Yutaka Yano1,9 ja Esteban C. Gabazza2,9

1 Diabeedi, ainevahetuse ja endokrinoloogia osakond, Mie ülikooli meditsiinikool, Tsu-city, Mie, Jaapan; 2 Immunoloogia osakond, Mie University Graduate School of Medicine, Tsu-city, Mie, Jaapan; 3 Mie ülikooli meditsiinikooli kopsu- ja kriitilise meditsiini osakond, Tsu-city, Mie, Jaapan; 4 Mie ülikooli meditsiinikooli Gastroenteroloogia ja hepatoloogia osakond, Tsu-city, Mie, Jaapan; 5 Neuraalse regeneratsiooni ja rakukommunikatsiooni osakond, Mie ülikooli meditsiinikool, Tsu-city, Mie, Jaapan; 6 Katseloomade keskinstituut, Kawasaki-ku, Kawasaki, Kanawaga, Jaapan; ja 7 Nefroloogia osakond, Taizhou haigla, Wenzhou meditsiiniülikool, Lihai, Zhejiangi provints, Hiina Rahvavabariik.

Kidney International (2020) 98, 1179–1192; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.05.041

Autoriõigus ª 2020, International Society of Nephrology. Väljaandja Elsevier Inc. See on avatud juurdepääsuga artikkel CC BY-NC-ND litsentsi alusel (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Kirjavahetus: Esteban C. Gabazza, Mie ülikooli meditsiinikooli immunoloogia osakond, Edobashi 2-174, Tsu-city, Mie 514-8507, Jaapan. E-post: gabazza@doc.medic.mie-u.ac.jp; või Yutaka Yano, diabeet, ainevahetus ja endokrinoloogia, Mie ülikooli meditsiinikool, Edobashi 2-174, Tsu-city, Mie 514-8507, Jaapan. E-post: yanoyuta@clin.medic.mie-u.ac.jp 8 AT ja TY panustasid sellesse töösse võrdselt. 9 YY ja EKG on kaasautorid. Saabunud 1. september 2019; muudetud 24. aprillil 2020; vastu võetud 7. mail 2020

MÄRKSÕNAD: apoptoos; krooniline neeruhaigus; G-valguga seotud retseptor; inimese rekombinantne trombomoduliin; transformeeriv kasvufaktor-b1

Neerufibroos on krooniliste neeruhaiguste sagedane tagajärg, mis areneb vääramatult lõppstaadiumis neeruhaiguseks, mille elundipuudulikkus on ravitav ainult asendusraviga. Kuna transformeeruv kasvufaktor-b1 on neerufifibroosi patogeneesis peamine tegur, püstitasime hüpoteesi, et rekombinantne trombomoduliin võib leevendada transformeerivat kasvufaktori b1-vahendatud progresseeruvat neerufibroosi ja -puudulikkust. Meie hüpoteesi uurimiseks lõime rekombinantse trombomoduliini terapeutilise toime hindamiseks uudse glomerulus-spetsiifilise inimese transformeeriva kasvufaktori b1 transgeense hiire. Sellel transgeensel hiirel tekkis progresseeruv glomerulaarskleroos ja tubulointerstitsiaalne fibroos koos neerupuudulikkusega. Ravi rekombinantse trombomoduliiniga nelja nädala jooksul pärssis oluliselt neerufibroosi ja parandas elundite funktsiooni võrreldes ravimata transgeensete hiirtega. Ravi rekombinantse trombomoduliiniga inhibeeris oluliselt podotsüütide apoptoosi ja mesenhümaalset diferentseerumist, interakteerudes G-valguga seotud retseptoriga 15, et aktiveerida Akt signaalirada ja reguleerida apoptootiliste valkude, sealhulgas surviviini, ekspressiooni. Seega viitab meie uuring tugevalt rekombinantse trombomoduliini potentsiaalsele terapeutilisele efektiivsuselekrooniline neeruhaigusja sellele järgnev elundipuudulikkus.

cistanchesaabravida neeruhaigustparandada neerufunktsiooni

Tõlkeavaldus

Fibroos ja talitlushäiredneerudon praegu kogu maailmas suured terviseprobleemid. Praegu ei ole neerufibroosi raviks heaks kiidetud fibroosivastast ravimit. Transformeeruv kasvufaktor-b1 on paljudest häiretest põhjustatud kroonilise neeruhaiguse peamine ja tavaline neerufibogeneesi põhjustaja. Leidsime siit, et rekombinantne trombomoduliin, ravim, mis on Jaapanis heaks kiidetud dissemineeritud intravaskulaarse koagulatsiooni raviks, pärsib glomerulaarskleroosi, tubulointerstitsiaalse fibroosi ja neerupuudulikkuse progresseerumist, mis on põhjustatud inimese transformeeriva kasvufaktori b1 üleekspressioonist, mis viitab selle potentsiaalsele terapeutilisele väärtusele ravis. kohtakroonilised neeruhaigused.

Krooniline neeruhaiguson suur rahvatervise probleem, mis on seotud kõrge haigestumuse ja suremusega, mis mõjutab umbes 13 protsenti arenenud riikide täiskasvanud elanikkonnast.1 Maailma Terviseorganisatsioon teatas, etkrooniline neeruhaigus(CKD) põhjustas 2012. aastal 1,5 protsenti kogu maailmas surmadest.1 Lisaks näitavad hiljutised epidemioloogilised andmed kroonilise neeruhaigusega patsientide arvu ülemaailmset pidevat kasvu.2,3 Enamikul juhtudel areneb patoloogiline protsess järk-järgult, mis viib lõpuks staadiumi neerupuudulikkus, mida saab ravida ainult eluaegse dialüüsi või neerusiirdamisega.4,5 Suhkurtõbi (DM) ja arteriaalne hüpertensioon on kõige sagedasemad kroonilise neeruhaiguse põhjused, millele järgneb isheemia, teadmata etioloogiaga glomeruloskleroos, uroloogilised obstruktsioonid ja kroonilised infektsioonid. Olenemata põhihäirest on kroonilise neeruhaiguse lõplik ja tavaline patoloogiline tagajärg neerufifibroos.7 Neerufibroos on neerude parenhüümsete struktuuride ebanormaalne paranemine ja ümberkujunemine, mis on allutatud pikaajalisele või korduvale vigastusele, mida iseloomustab tubulointerstitsiaalne fibroos, glomeruloskleroos ja tubulaarne atroofia.8 Neerufibrogeneesi peamine tegur on kasvufaktide muutmine või (TGF)-b1.8,9 TGFb1 võib soodustada fibroosi, stimuleerides ekstratsellulaarse maatriksi valkude ja kemotaktiliste tegurite või fibroblastide proliferatsioonifaktorite sekretsiooni, inhibeerides metalloproteinaase ja soodustades epiteeli-mesenhümaalset üleminekut.10 Lisaks põhihaiguse ravile. , heakskiidetud ravim, mis on suunatud konkreetselt neerufibroosi vastu, ei ole praegu saadaval.6

Trombomoduliin (TM) on transmembraanne glükoproteiin, millel on mitu bioloogilist funktsiooni, sealhulgas hüübimissüsteemi moduleerimine, immuunvastus, põletikulised reaktsioonid ja rakkude ellujäämine.11 TM-i molekulaarstruktuur sisaldab lektiinilaadset domeeni ja 6 epidermise kasvufaktori sarnast domeeni. , seriini/treoniinirikas domeen, transmembraanne osa ja tsütoplasma saba.12 Trombiin, hüübimissüsteemi aktiveerimise käigus tekkiv prokoagulantfaktor, muutub pärast TM-iga seondumist antikoagulandiks ja antifibrinolüütiliseks faktoriks.13 TM-trombiini kompleks suurendab teket. aktiveeritud proteiin C (APC), põletikuvastase ja tsütoprotektiivse toimega antikoagulant, aktiveerides valku C. Lisaks võib TM üksi põletikulist reaktsiooni otseselt alla reguleerida, inhibeerides suure liikuvusega rühma valgu B aktiivsust{10}} (HMGB1), surudes alla immunogeenseid dendriitrakke, eosinofiile, nuumrakke ja komplemendi süsteemi.13–18

On avaldatud tulemusi, mis näitavad TM-i ennetavat toimet diabeetilise renopaatia ja isheemia-reperfusiooniga neerukahjustuse korral.{1}} Siiski ei ole üheski uuringus hinnatud rekombinantse TM-i mõju progresseeruvale neerufibroosile, mida põhjustab TGFb1, mis on tavaline neerufibroosi põhjustaja mitmed kroonilist neeruhaigust põhjustavad haigused. Esitasime hüpoteesi, et TM võib leevendada TGFb1-vahendatud neerufibroosi ja neerupuudulikkust. Selle hüpoteesi küsitlemiseks hindasime rekombinantse TM-i terapeutilist toimet äsja väljatöötatud glomerulus-spetsiifilisel TGFb1 transgeensel (TG) hiirel, mis areneb progresseeruvalt.neerufibroos ja neerupuudulikkus.

cistanche neerude jaoks

TULEMUSED

Tsirkuleerivate TM-i fragmentide suurenemine on korrelatsioonis neerufunktsiooni häiretega

TM, endoteeliraku membraaniga seotud glükoproteiin, lõhustub fragmentideks, kaotades endoteeli vigastuse ajal oma kaitsefunktsioonid.22 Diabeetiline nefropaatia on seotud endoteelikahjustusega.23,24 Nefropaatiaga DM-ga patsientidel oli võrreldes nefropaatiata patsientidega märkimisväärselt kõrgeid näitajaid. TM (4,4 vs. 3,3 pg/ml) ja aktiivse TGFb1 (0,28 vs. 0,24 ng/ml) tsirkuleerivad tasemed (täiendav tabel S1, täiendav joonis S1A). TM on märkimisväärselt korrelatsioonis kreatiniini, aktiivse TGFb1 ja lahustuva podotsiiniga (täiendav joonis S1B). Need tähelepanekud viitavad sellele, et funktsionaalse membraaniga seotud TM-i kadu on seotud aktiivse TGFb1 suurenenud vabanemisega ja neerufunktsiooni häiretega.

TG hiir täispika inimese TGFb1 geeni glomerulus-spetsiifilise ekspressiooniga

Töötasime välja TG hiire, mis üleekspresseerib täispikka inimese TGFb1 geeni podotsüütides. Hiir genereeriti, asetades inimese TGFb1 podotsiini promootori kontrolli alla bakteriaalsele tehiskromosoomi (BAC) konstruktsioonile (täiendav joonis S2; täiendav joonis S3). Saime 5 asutajahiirt, kes ekspresseerisid 3 koopiat ja 3 asutajahiirt, kes ekspresseerisid 1 koopia inimese TGFb1 transgeenist. Transgeeni ekspressioon oli neeruspetsiifiline ja asutajate järglased olid elujõulised (täiendav joonis S3). Hiirtel oli täisaegne rasedus ja pesakond olid normaalse suurusega. Hiired sündisid oodatud Mendeli suhtega.

TG hiirte iseloomustamiseks mõõtsime mituneerude parameetridiga 4 nädala järel 16 nädala jooksul (täiendav joonis S4). TGFb1 kontsentratsioon plasmas ja uriinis tõusis TGFb1- TG hiirtel võrreldes metsiktüüpi (WT) hiirtega märkimisväärselt alates esimestest nädalatest pärast sündi ja püsis seejärel kõrgel tasemel (joonis 1a). TGFb1-TG hiirtel suurenes hüdroksüproliini neerukoe sisaldus 20ndal nädalal (190,5 vs. 96.{21}} mg neeru kohta) ), mesangiaalne laienemine alates 4. nädalast (1,9 vs. 1,1 skoor) ja kollageeni ladestumine alates 12. nädalast (0,9 protsenti vs. 0,1 protsenti) pärast sündi, võrreldes nende WT kolleegidega (joonis 1a–f ). Tavaline optiline mikroskoopia näitas Bowmani kapsli basaalmembraani laienemist, glomerulaarse basaalmembraani paksenemist, suurenenud kollageeni ladestumist mesangiaalsetes ja interstitsiaalsetes ruumides ning torukujulist atroofiat (joonis 1bd). Transmissioonelektronmikroskoopia näitas glomeruloskleroosi, sealhulgas podotsüütide mikrovilloosset transformatsiooni ja jalaprotsessi kadumist, glomerulaarse kapillaaride endoteeli fenestratsiooni vähenemist, glomerulaarse basaalmembraani paksenemist ja suurenenud mesangiaalse maatriksi ladestumist (joonis 2a – i). Nefropaatia varajaste markerite Rasvhappeid siduva valgu kontsentratsioonid uriinis (185,1 vs. 87,0 pg/ml) janeerukahjustusmolekul 1 (441,9 vs. 256,9 pg/ml) suurenes oluliselt TGFb1-TG hiirtel alates 4. ja 8. elunädalast, võrreldes nende vanusega WT hiirtega (täiendav joonis S5). Üldine proteinuuria ja valgu-kreatiniini üldsuhe uriinis suurenesid 4., 8., 12., 16. ja 2 . Vere uurea lämmastiku tase plasmas tõusis oluliselt alates 4. nädalast (5,1 vs. 4,1 mg/dl) ja kreatiniini kontsentratsioon alates 8. nädalast (1,1 vs. 0,4 mg/dl) TGFb1-TG hiirtel võrreldes nende WT kolleegidega (joonis 3b).

rhTM inhibeerib glomeruloskleroosi ja tubulointerstitsiaalset fibroosi

Võrreldes TGFb{0}}TG hiirtega, keda raviti soolalahusega (SAL) ja WT hiirtega, keda raviti rekombinantse inimese (RH) TM või SAL-iga, näitasid rütmiga ravitud TGFb1-TG hiirtel märkimisväärselt vähenenud mesangiaal laienemine/rakulisus (1,3 vs. 3.{{30}} skoor) ja märkimisväärselt madal tubulointerstitsiaalne kollageeni ladestumine ja glomeruloskleroos (121,3 protsenti vs. 139,7 protsenti) (joonis 4a–e). Kooskõlas nende tähelepanekutega on hüdroksüproliini sisaldus (11,7 vs. 19,9 mg/g), kollageeni I (101,3 vs. 196,7 ng/mg valgu) ja periostiini (21,7 vs 40,8 ng/g/g) kontsentratsioonid neerukoes. mg valku) ja kollageeni I suhteline mRNA ekspressioon vähenes märkimisväärselt rhTM-iga ravitud TGFb1-TG hiirte neerukudedes võrreldes kontrollhiirte neerukudedega (joonis 4f, täiendavad tabelid S2 ja S3). Transmissioonelektronmikroskoopia näitas rhTM-iga ravitud hiirtel jalgade podotsüütide kadumise ja glomerulaarse basaalmembraani paksenemise olulist vähenemist võrreldes ainult SAL-iga ravitud hiirtega (täiendav joonis S6AB ja B). Lisaks profibrootiliste tsütokiinide monotsüütide kemoatraktandi valgu -1 (45,0 vs. 76,1 pg/mg valgu), interleukiini-13 (612,1 vs. 1002,0 pg/mg valgu) ja aktiivse TGFb1 kontsentratsioonid neerukoes. (131,0 vs. 151,5 pg/mg valku) vähenesid märkimisväärselt rhTM-iga ravitud TGFb1-TG hiirtel võrreldes kontrollhiirtega (täiendav joonis S7). HMGB1 kontsentratsioon neerukoes vähenes samuti oluliselt rhTM-iga ravitud TGFb1-TG hiirte neerukudedes võrreldesneerukudedkontrollhiirtelt (täiendav joonis S7). Trombiini antitrombiinikompleksi kontsentratsioon plasmas tõusis oluliselt TGFb1-TG/SAL rühmas võrreldes WT/SAL rühmaga, kuid TGFb1-TG/rhTM ja WT/rhTM rühmade vahel ei leitud erinevusi. (täiendav joonis S8A). Nagu oodatud, oli rhTM-ga ravitud TGFb1-TG ja WT hiirte plasmas kõrge TM kontsentratsioon. APC/antitrüpsiini kompleksi plasmakontsentratsioon vähenes oluliselt TGFb1-TG/SAL rühmas võrreldes WT/SAL ja TGFb1-TG/rhTM rühmadega (280,5 vs. 384,6 pg/ml) , ja plasminogeeni aktivaatori inhibiitori -1 tasemes ei olnud olulist erinevust (täiendav joonis S8A). C5a tase plasmas, uriinis janeerukude(630,1 vs. 1075,0 pg/mg valku) ja plasmas lahustuv podotsiin vähenesid oluliselt rhTM-ga ravitud TGFb1-TG hiirtel võrreldes SAL-iga ravitud TGFb1-TG hiirtega (täiendav joonis S8B). Podotsiini tase uriinis oli kõrgem TGFb1-TG/SAL rühmas kui WT/SAL ja TGFb1-TG/rhTM rühmades (täiendav joonis S9A–C).

Joonis 1|Inimese transformeeriva kasvufaktori b1 (TGFb1) transgeensel (TG) hiirel areneb progresseeruv neerufibroos. ( a ) TGFb1 valgu kontsentratsiooni plasmas ja uriinis mõõdeti ensüümi immuuntestiga ja koe hüdroksüproliini sisaldust kolorimeetrilise testiga. (b–d) Neerukoe lõigud värviti (b) periodic acid-Schiffiga (tulbad ¼ 20 mm) ja (c, d) Massoni trikroomiga (tulbad ¼ 10{{ 40}} mm) ja seejärel (e,f) kvantifitseeriti, kasutades punktisüsteemi või WinROOF-i kujutise tarkvara (Mitani Corporation, Tokyo, Jaapan). Hiirte arv neerukoe hindamisel: metsikut tüüpi (WT) hiirtel n ¼ 4 4, 12 ja 20 nädala pärast; TG hiirte puhul n ¼ 7 4 nädala vanuselt, n ¼ 8 16 nädala vanuselt ja n ¼ 9 20 nädala vanuselt. Hiirte arv plasma ja uriini hindamiseks: WT hiirte puhul n ¼ 12 4 nädala pärast, n ¼ 8 8 nädala pärast, n ¼ 7 12 nädala pärast ja n ¼ 4 16 ja 20 nädala pärast; TG hiirte puhul n ¼ 24 4 nädala pärast, n ¼ 17 8 ja 12 nädala järel ning n ¼ 9 16 ja 20 nädala pärast. Andmed on väljendatud keskmise interkvartiilse vahemikuna. Statistiline analüüs Mann-Whitney U testiga. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ****p="">< 0,0001.="" ns,="" mitte="" oluline.="" selle="" pildi="" vaatamise="" optimeerimiseks="" vaadake="" selle="" artikli="" veebiversiooni="" aadressil="">

Joonis 2|Transmissioonielektronmikroskoopilised leiud transformeeriva kasvufaktori b1-indutseeritud neerufifibroosi mudelis. Hiirte neerude fikseerimine, käsitsemine ja eemaldamine viidi läbi meetodites kirjeldatud viisil. (a, b) podotsüütide mikrovilloosne transformatsioon ja (a, b, d, e, g) jala protsessi tuhmumine (valged nooleotsad), (c–e) vähenenud glomerulaarkapillaaride endoteeli fenestratsioon (kollased nooleotsad), (f) paksenemine esinevad glomerulaarsed basaalmembraanid (tärnid) ja (h,i) suurenenud mesangiaalse maatriksi ladestumine (valged nooled). CL, kapillaari luumen. Selle pildi vaatamise optimeerimiseks vaadake selle artikli veebiversiooni aadressil www.kidney-international.org.

rhTM parandab neerufunktsiooni

L-rasvhappeid siduva valgu tase (197.0 vs. 313,4 pg/ml),neerukahjustuse molekul1 (299,9 vs. 596,2 pg/ml), vere uurea lämmastik (12,9 vs 34,8 mg/dl), kreatiniin (0,5 vs. 1,4 mg/dl) ning albumiini-kreatiniini suhe vähenesid oluliselt Neerufibroosiga TGFb1-TG-hiired, keda raviti rhTM-iga, võrreldes nende ravimata TG-vastastega (joonis 5). Uriini üldvalgu ja üldvalgu kreatiniini suhe vähenes ka rhTM-iga ravitud TGFb1-TG hiirtel võrreldes nende ravimata hiirtega (joonis 5).

rhTM vähendab glomerulaarrakkude apoptoosi

Terminaalne desoksünukleotidüültransferaasi vahendatud dUTP hüüdmärgiga lõpp-märgistus näitas märkimisväärselt vähenenud apoptootiliste rakkude arvu glomerulites TGFb1-TG hiirtelt, keda raviti rhTM-iga, võrreldes TGFb1- TG hiirte glomerulitega, keda raviti SAL-iga (täiendav lisa). Joonis S10A ja B). Kaspaasi{5}} lõhustumine vähenes oluliselt ka rhTM-ga ravitud TGFb1-TG hiirte neerukudedes võrreldes SAL-iga ravitud TGFb1-TG hiirte neerukudedega (täiendav joonis S10C). TheneerukudedrhTM-ga ravitud TGFb1-TG hiirtelt, võrreldes SAL-iga ravitud TGFb1-TG hiirtega, ilmnes B-rakulise lümfoomi 2 (Bcl-2), B mRNA taseme oluline tõus. - ülisuurrakuline lümfoom (Bcl-XL), apoptoosi korduse bakuloviiruse inhibiitor, mis sisaldab 5 (BIRC5, tuntud ka kui surviviin) ja BIRC6 (Apollon) suurenenud Bcl-2-Bax suhtega (täiendav joonis S11 ).

Joonis 3|Inimese transformeeriva kasvufaktori b1 (TGFb1) transgeensel (TG) hiirel on neerufunktsiooni häire. (a) Üldvalku ja (b) vere uurea lämmastikku (BUN) mõõdeti kolorimeetriliste meetoditega ja kreatiniini ensümaatilise meetodiga. Hiirte arv plasma ja uriini hindamiseks: metsikut tüüpi (WT) hiirtel, n ¼ 12 4 nädala pärast, n=7 8 ja 12 nädala järel ning n=4 16 ja 2{ {21}} nädalat; TG hiirte puhul n =24 4 nädala pärast, n=17 8 ja 12 nädala järel ning n=9 16 ja 20 nädala pärast. Andmed on väljendatud mediaanina ± interkvartiilne vahemik. Statistiline analüüs Mann-Whitney U testiga. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ****="" p=""><>

rhTM inhibeerib podotsüütide apoptoosi

Podotsüütide eeltöötlemine rhTM-ga vähendas oluliselt TGFb1 juuresolekul kultiveeritud podotsüütide apoptoosi, mida hinnati rakkude arvu järgi subG1 faasis (3,2% vs. 5,2%), terminaalse desoksünukleotidüültransferaasi vahendatud dUTP hüüdmärgistus - positiivsed rakud. 1.0 vs. 5,4 rakku/Fifield) ja kaspaasi-3 lõhustumise aste (suhted 0,9 vs. 1,1) (joonis 6a–e). Antiapoptootiliste tegurite sõelumine kultiveeritud podotsüütides näitas, et rhTM suurendab märkimisväärselt antiapoptootilise faktori Bcl-2 mRNA ekspressiooni võrreldes ekspressiooniga töötlemata rakkudes (täiendav joonis S12). Antiapoptootilise faktori BIRC5 mRNA ekspressioon suurenes ka rhTM-iga töödeldud rakkudes võrreldes ekspressiooniga töötlemata rakkudes (täiendav joonis S12). Proapoptootilise faktori Baxi mRNA ekspressioon vähenes märkimisväärselt rhTM-raviga võrreldes ravi puudumisega (täiendav joonis S12). Töötlemine rhTM-ga inhibeeris märkimisväärselt ka anneksiin V ekspressiooni ja terminaalse desoksünukleotidüültransferaasi vahendatud dUTP hüüdmärgistuse värvimist podotsüütides, mida kultiveeriti vesinikperoksiidi juuresolekul (täiendav joonis S13A–E) ja kõrge glükoosisisaldusega tingimustes (täiendav joonis S14A). ), kinnitades veelgi rhTM-i antiapoptootilist omadust podotsüütidel. Antiapoptootilise proteiinkinaasi B (Akt) raja25 uurimine näitas, et rhTM suurendas Akt fosforüülimist inimese primaarsetes podotsüütides, mida kultiveeriti vesinikperoksiidi või TGFb1 juuresolekul (täiendav joonis S15A ja B). Seejärel eraldasime igast hiirte rühmast podotsüüdid ja hindasime Akt fosforüülimist Western blot analüüsiga. TGFb{{30}}TG/rhTM rühmast eraldatud podotsüütides oli Akt fosforüülimine märkimisväärselt suurenenud, võrreldes töötlemata rühma podotsüütidega (suhe 1,1 vs. 0,7) (täiendav joonis S16A ja B).

GPR15 vahendus

Varasemad uuringud teatasid, et TM aktiveerib rakusiseseid radu, toimides koos fibroblastide kasvufaktori retseptoriga 1 (FGFR1) jaG-valguga seotud retseptor15 (GPR15).26,27 Podotsüüdid ekspresseerivad FGFR128, kuid pole selge, kas nad ekspresseerivad GPR15. Siin eraldasime igast hiirte rühmast podotsüüdid ja näitasime, et podotsüüdid ekspresseerivad ka GPR15 (täiendav joonis S17A – E). Leidsime, et terve kontrolli ja glomeruloskleroosiga patsiendi podotsüüdid ekspresseerivad ka GPR15 (täiendav joonis S18). Et selgitada, kas FGFR1 või GPR15 vahendab rhTM-i inhibeerivat toimet podotsüütide apoptoosile, hindasime rhTM-i antiapoptootilist toimet TGFb{12}}töödeldud podotsüütides FGFR1 inhibiitori juuresolekul või pärast rakkude transfekteerimist väikese segava RNA-ga (siRNA). FGFR1 või GPR15 vastu. Podotsüütide eeltöötlemine FGFR1 inhibiitoriga (täiendavad joonised S19A ja B) või FGFR1 siRNA-ga (13,2 protsenti vs. 7,9 protsenti) (joonised 7a ja b) ei suutnud kaotada rhTM-i inhibeerivat toimet podotsüütide apoptoosi suhtes. Kuid rakkude transfektsioon GPR15 siRNA-ga kaotas täielikult rhTM-i inhibeeriva toime (14,6 protsenti vs. 13,8 protsenti).podotsüütide apoptoos(Joonis 7a–c).

Joonis 4|Inimese rekombinantne trombomoduliin (rhTM) pärsib glomeruloskleroosi ja tubulointerstitsiaalset fibroosi. Neerukoe lõigud värviti (a, b) perioodilise happe-Schiffiga ja (c, d) Massoni trikroomiga ja (e) seejärel kvantifitseeriti punktisüsteemi või WinROOF-i pilditarkvara abil. (e) Metsiktüüpi (WT)/soolalahuse (SAL) rühma keskmiseks väärtuseks võeti 100 protsenti. Statistiline analüüs Mann-Whitney U testiga. ( f ) Kudede hüdroksüproliini sisaldust mõõdeti kolorimeetrilise meetodiga, kollageeni I-a1 (Col1a1) ja periostiini kontsentratsiooni ensüümi immunoanalüüsiga ning mRNA ekspressiooni pöördtranskriptaasi-polümeraasi ahelreaktsiooniga. Statistiline analüüs Kruskal Wallise dispersioonanalüüsi ja korrigeeritud Dunni testiga. n=8 igas rühmas. Vardad {{10}} (a,c) 50 mm ja (d) 20 mm. Andmed on väljendatud mediaanina ± interkvartiilne vahemik. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" ****p="">< 0,0001.="" tg,="" transgeenne;="" tgfb1,="" transformeeriv="" kasvufaktor="" b1.="" selle="" pildi="" vaatamise="" optimeerimiseks="" vaadake="" selle="" artikli="" veebiversiooni="" aadressil="">

rhTM inhibeerib podotsüütide EMT-d

TGFb1-TG/SAL hiirtel oli märgatavalt suurenenud podotsiini ja a-silelihase aktiini (a-SMA) positiivse värvumisega ala (1,4 protsenti vs. 11,2 protsenti) võrreldes TGFb1-TG-ga. /rhTM hiired (joonis 8a ja b). Seejärel kultiveerisime in vitro primaarseid inimese podotsüüte, mida töödeldi enne TGFb1 valgu lisamist söötmele rhTM-ga. Fibroblastitaoline morfoloogia ja a-SMA suurenenud ekspressioon suruti alla rhTM-iga töödeldud podotsüütides võrreldes töötlemata rakkudega (täiendav joonis S20A). Lisaks inhibeeris rhTM fibronektiini ja vimentiini mRNA ekspressiooni, kuigi see suurendas E-kadheriini mRNA ekspressiooni podotsüütides võrreldes ekspressiooniga töötlemata rakkudes (täiendav joonis S20B). SMAD-i perekonnaliikmed 2 (Smad2) ja Smad3 mängivad olulist rolli TGFb1-vahendatud epiteel-mesenhümaalses üleminekus (EMT).29 Ravi rhTM-ga pärssis oluliselt Smad2 ja Smad3 aktivatsiooni TGFb1-TG hiirtel. võrreldes töötlemata TG hiirtega (joonis 8c) ja inimese podotsüütidega, mida kasvatati TGFb1 juuresolekul (täiendav joonis S20C).29 TG hiirtel, keda raviti rhTM-iga (TGFb1-TG/rhTM), ilmneb samuti väiksem a-SMA ekspressioon (3,7 protsenti vs. 17,2 protsenti) tubulaarsetes epiteelirakkudes võrreldes nende töötlemata kolleegidega (täiendav joonis S21A ja B).

Joonis 5|Inimese rekombinantne trombomoduliin (rhTM) leevendab neerukahjustusi ja neerufunktsiooni häireid. Kreatiniini mõõdeti ensümaatilise meetodiga; kogu valk kolorimeetrilisel meetodil; ja vere uurea lämmastik (BUN) ja albumiin, neerukahjustuse molekul 1 (KIM-1), L-rasvhapet siduv valk (L-FABP) ja kogu transformeeriv kasvufaktor b1 (TGFb1) ensüümi immuuntesti abil. n=8 igas rühmas. Andmed on väljendatud mediaan±interkvartiilvahemikuna. Statistiline analüüs Kruskal-Wallise dispersioonanalüüsi ja korrigeerimata Dunni testiga. * P < {{10}}.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" ****="" p="">< 0,0001,="" #p="0.06." ns,="" mitteoluline;="" sal,="" soolalahus;="" tg,="" transgeenne;="" wt,="" metsik="">

GPR15 vahendab rhTM-i inhibeerivat toimet EMT-le

Podotsüütide transfektsioon FGFR1 siRNA-ga ei suutnud kaotada rhTM-i inhibeerivat aktiivsust nii kollageeni I-a1 kui ka a-SMA suhtelisele mRNA ekspressioonile TGFb 1--ga töödeldud podotsüütides (täiendav joonis S22). Kuid rakkude transfektsioon GPR15 siRNA-ga kaotas märkimisväärselt rhTM-i inhibeeriva toime nii kollageeni I-a1 kui ka a-SMA suhtelisele mRNA ekspressioonile TGFb{10}}-ga töödeldud podotsüütides (täiendav joonis S22).

ARUTELU

TGFb1 ja glomerulaarrakkude vigastus

Kroonilist neeruhaigust põhjustavate häirete sagedaseks tagajärjeks on neerufibroos.8,30,31 TGFb1 on kroonilise neeruhaigusega seotud haiguste, sealhulgas DM, arteriaalse hüpertensiooni ja autoimmuunhaiguste põhjustatud neerude fibrogeneesi tavaline põhjus.10 Rakud glomerulusest ja tubulointerstitsiaalsetest ruumidest võib sekreteerida TGFb1 varjatud vorme, mis koekahjustuse ajal liigselt aktiveerituna võivad põhjustada neerude armistumist.32 Kuna TGFb1 võib stimuleerida oma sekretsiooni, muutub fibrootiline protsess üldiselt nõiaringiks.8 TGFb patogeense protsessi varane sündmus. 1- vahendasneerufibrooson podotsüütide ja glomerulaarsete endoteelirakkude vigastus.33–35 Lahustuva TM-i tase plasmas on endoteelikahjustuse marker. Kooskõlas TGFb1 rolliga neerurakkude vigastuses leidsime siin aktiivse TGFb1 olulise korrelatsiooni DM-ga patsientide plasmas lahustuva TM-i, lahustuva podotsiini ja kreatiniiniga. Ristkõne glomerulaarsete endoteelirakkude ja podotsüütide vahel aneerukahjustusviib proteaaside lokaalse ekspressioonini, mis põhjustab glomerulaarse basaalmembraani lagunemist.34–36 See võib seletada lahustuva podotsiini tuvastamist ja selle olulist korrelatsiooni lahustuva TM-ga meie DM-ga patsientidel.

Joonis 6|Inimese rekombinantne trombomoduliin (rhTM) pärsib kasvufaktori b1 (TGFb1) transformeerimisega indutseeritud podotsüütide apoptoosi. (a) rhTM lisati podotsüütide söötmele 1 tund enne apoptoosi esilekutsumist 10 ng/ml TGFb1-ga 48 tunni jooksul. ( b ) SubG1 faasis olevate rakkude protsent tuvastati kaastsütomeetria abil. (a,b) n=3 igas rühmas. (c, d) DNA fragmentatsiooniga rakkude arvu mõõdeti terminaalse desoksünukleotidüültransferaasi vahendatud dUTP hüüdmärgistuse (TUNEL) analüüsiga (n=3 soolalahuses [SAL]/SAL ja rhTM/SAL rühmades); n=6 SAL/TGFb1 ja rhTM/TGFb1 rühmades) ja (e) kaspaasi{15}} lõhustumise astet mõõdeti Western blot analüüsiga (n=4 igas rühmas). Vardad=100 mm. Andmed on väljendatud mediaanina ± interkvartiilne vahemik. Statistiline analüüs Mann-Whitney U testiga. *P < 0,05.="" dapi,="" 40,="" 6-diamidino-2-fenüülindool;="" hpf,="" suure="" võimsusega="" väli;="" ns,="" mitte="" oluline.="" histogrammid="" kuvatakse="" protsentides="" max="" (="" protsenti="" maksimaalsest="" väärtusest),="" skaleerides="" iga="" kõvera="" režiimile="100" protsenti="" .="" selle="" pildi="" vaatamise="" optimeerimiseks="" vaadake="" selle="" artikli="" veebiversiooni="" aadressil="">

Podotsüüdi-spetsiifiline inimese TGFb1 üleekspressiooniga seotud neerufibroos

Neerufibroosi blokeerimiseks sobiks ideaalselt ravim, mis suudab neutraliseerida TGFb1 toimet. Siin oleme loonud TG hiire, mis ekspresseerib üle inimese TGFb1 geeni glomerulites, millel areneb spontaanne ja progresseeruv glomerulaarne skleroos ja tubulointerstitsiaalne fibroos koos neerupuudulikkusega juba 4 nädalat pärast sündi. Mudel näitab kaugelearenenud glomerulopaatiat koos podotsüütide ja glomerulaarsete endoteelirakkude vigastustega; glomerulaarse basaalmembraani paksenemine ja mesangiaalne laienemine koos interstitsiaalse armistumisega; neerukoe vigastuse ja neerufunktsiooni häire markerite suurenemine; ja suurenenud TGFb1 plasmas,neerukude, ja uriin. Valkude, TGFb1 eritumise suurenemine uriiniga ja komplemendisüsteemi aktiveerimine võivad seletada interstitsiaalse armistumise samaaegset arengut meie praeguses mudelis.37–40 Edasised katsed näitasid apoptootiliste rakkude arvu suurenemist ja Smad-valkude aktiveerumist neerukoes töötlemata TGFb{st. {3}}TG hiired võrreldes WT hiirtega. Üldiselt viitavad need leiud sellele uudsele TGFb1-TG hiirele kui sobivale mudelile ravimite avastamiseksneerufibroos.

Joonis 7|G-valguga seotud retseptor (GPR15) vahendab apoptoosi rekombinantse inimese trombomoduliini (rhTM) inhibeerimist podotsüütides. Inimese primaarsed podotsüütide rakud transfekteeriti fibroblasti kasvufaktori retseptori 1 (FGFR1) väikese segava RNA (siRNA), GPR15 siRNA või segatud siRNA-ga 48 tundi ja seejärel lisati rakukultuurile rhTM 1 tund enne töötlemist transformeeriva kasvufaktoriga b1. (TGFb1). Apoptootilisi rakke (a) hinnati kaastsütomeetriaga ja (b) seejärel kvantifitseeriti. ( c ) Rakulüsaadid valmistati Western blot analüüsi jaoks. n{{10}} igas rühmas. Andmed on väljendatud mediaanina ± interkvartiilne vahemik. Statistiline analüüs Mann-Whitney U testiga. *P < 0,05,="" #p="0.1." sal,="">

Joonis 8|Epiteeli-mesenhümaalse ülemineku pärssimine inimese rekombinantse trombomoduliini (rhTM) abil. ( a ) Podotsiin ja a-silelihase aktiin (a-SMA) värviti meetodites kirjeldatud viisil. ( b ) a-SMA värvimise suhtes positiivne ala kvantifitseeriti pilditöötlustarkvaraga WinROOF. n=3 metsiktüüpi (WT)/soolalahuse (SAL) ja WT/rhTM rühmades ning n=5transformeeriv kasvufaktor-b1-transgeenne(TGFb{{0}}TG)/SAL ja TGFb1-TG/rhTM rühmad. ( c ) SMAD perekonnaliikme (Smad) kogu (t) ja fosforüülitud (p) valkude kogust hinnati Western blot analüüsiga. n=8 igas rühmas. Andmed on väljendatud mediaanina ± interkvartiilne vahemik. Statistiline analüüs Kruskal-Wallise dispersioonanalüüsi ja korrigeeritud Dunni testiga. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" #p="0,08." selle="" pildi="" vaatamise="" optimeerimiseks="" vaadake="" selle="" artikli="" veebiversiooni="" aadressil="">

rhTM leevendab neerufibroosi

Oleme näidanud, et rhTM leevendab inimese TGFb1 kopsudes üleekspresseerivatel hiirtel tekkinud kopsufibroosi, surudes alla alveolaarsete epiteelirakkude apoptoosi.41 Kliinilised uuringud on näidanud ka idiopaatilise kopsufibroosi leevendust pärast rhTM-ravi. elundifibroosi raviks. Me oletasime, et rhTM on efektiivne TGFb{4}}-ga seotud neerufibroosi korral. Selle hüpoteesi kontrollimiseks ravisime neeruspetsiifilisi TGFb1-TG hiiri rhTM-ga.44 RhTM-i manustamine 4 nädala jooksul nõrgendas oluliselt neerude vigastusi, düsfunktsiooni ja fibroosi. RhTM-iga ravitud hiirtel oli uriinis madal üldvalgu, albumiini, TGFb1, C5a tase ning vähenenud profibrootiliste tsütokiinide, C5a ja HMGB1.45 tase neerudes. Ravi rhTM-iga inhibeeris samuti nii podotsüütide apoptoosi kui ka EMT-d. Kuid rhTM ei avaldanud mingit mõju trombiini antitrombiini kompleksile, hüübimisaktivatsiooni markerile, kuigi see suurendas APC teket, põletikuvastase ja apoptootilise toimega antikoagulandi faktorit.23 Väärib märkimist, et trombiin, prokoagulantne ensüüm, võib paradoksaalselt soodustavad hüübimisvastast toimet madala astme protrombootilistes seisundites, moodustades TM/trombiini kompleksi, mis suurendab antikoagulandi APC teket. Trombiin toimib siiski peamiselt prokoagulandina liigsete protromboosiseisundite korral (nt sepsis).46 See trombiini kahekordne ja paradoksaalne toime võib seletada rhTM-i näilist ebaefektiivsust koagulatsiooni aktivatsiooni pärssimisel meie mudelis, mis on madala astme protromboosiseisundis. . Üldiselt viitavad need tähelepanekud sellele, et rhTM leevendab progresseeruvat fibroosi ja düsfunktsiooni.neerudpikendades glomerulaarrakkude ellujäämist või vältides EMT-d ning pärssides põletikku, komplemendi aktivatsiooni ja kasvufaktori aktiivsust otseselt või kaudselt proteiin C raja aktiveerimise ja HMGB1 ekspressiooni vähendamise kaudu. Diabeetilise nefropaatia paranemine hiirtel, kellel on suurenenud ringleva TM-i lektiinitaoline domeen, ja haiguse ägenemine hiirtel, kellel puudub lektiinitaoline domeen, toetavad rhTM-i kasulikku toimet neerufibroosile.20,21

Podotsüüdi apoptoosi pärssimine

Podotsüüdid mängivad olulist rolli glomerulaarfiltratsiooni barjääri säilitamisel ja pilu diafragma moodustamisel, et vältida oluliste ringlevate valkude kadu.47Neerukahjustusmida põhjustavad reaktiivsed hapnikuühendid, kõrge glükoosisisaldus või põletikulised vahendajad, sealhulgas TGFb1, indutseerib podotsüütide apoptoosi, mis viib podotsüütide ammendumiseni, mis võib lõpuks põhjustada neerufunktsiooni häireid.47 Pärast seriini/treoniini kinaasi transmembraanse heteromeerse I ja II tüüpi retseptori kompleksi sidumist ja aktiveerimist , TGFb1 kiirgab rakusiseseid signaale transkriptsioonifaktorite perekonna Smad või Smad-sõltumatute signaaliradade kaudu.48 Smad-sõltuva raja aktiveerimine toimub siis, kui aktiveeritud TGFb1 retseptor fosforüleerib Smad2 ja Smad3, mis koos Smad4-ga siirduvad tuuma.49 Smad2/ Smad3/Smad4 kompleks stimuleerib proapoptootiliste faktorite transkriptsiooni ja vähendab raku apoptoosi viivate antiapoptootiliste faktorite transkriptsiooni.49 Sellega kooskõlas leidsime proapoptootilise faktori Bax kõrge taseme neerudes ning antiapoptootiliste faktorite Bcl2 ja Bcl-XL madala taseme. TGFb1- TG hiirtel. TM võib pärssida erinevate rakutüüpide apoptoosi.21,41,49 Sellega kooskõlas avastasime siin, et rhTM inhibeerib vesinikperoksiidi, kõrge glükoosisisalduse või TGFb1 poolt indutseeritud podotsüütide apoptoosi ning see leid võib selgitada rhTM-i kasulikku toimet kroonilise neeruhaiguse korral. . Lisaks kallutas rhTM tasakaalu apoptoosi pärssimise suunas, vähendades Baxi ekspressiooni, suurendades Bcl2, Bcl-XL, BIRC5 ja BIRC6 ekspressiooni ning suurendades Akt raja aktivatsioonineerukuded. Üldiselt näitavad need tähelepanekud, et rhTM stimuleerib podotsüütide ellujäämist, soodustades Akt aktivatsiooni ja antiapoptootilise faktori ekspressiooni.

cistanche kroonilise neeruhaiguse korral

EMT pärssimine

Podotsüütide EMT aitab kaasa ka neerufibroosi tekkele. EMT-d läbivad podotsüüdid vabastavad ekstratsellulaarse maatriksi valgud, mis kogunevad ja ladestuvad TGFb{0}}seotud neerufibrogeneesi käigus.50 TGFb1 soodustab EMT-d Smad2/Smad3/Smad4 kompleksi retseptori poolt vahendatud aktiveerimise kaudu. Fosforüülitud Smad3 soodustab EMT-d, stimuleerides maatriksvalkude transkriptsiooni ja vähendades epiteelimarkerite ekspressiooni.51 Sellega kooskõlas leidsime, et TGFb1-TG hiirtel ja TGFb1 juuresolekul või selle all kultiveeritud podotsüütides on suurenenud podotsüütide EMT. oksüdeerivad või kõrge glükoosisisaldusega tingimused. Varasemad aruanded näitasid, et rhTM pärsib EMT.52,53 Siin leidsime, et rhTM inhibeerib podotsüütide ja tubulointerstitsiaalsete epiteelirakkude EMT-d TGFb1-TG hiirtel. Smad-valgu aktivatsiooni pärssimine näib olevat rhTM-i EMT-le kasuliku mõju mehhanism, sest rhTM-iga töödeldud TGFb1-TG-hiired ja primaarsed podotsüüdid näitasid Smad2 ja Smad3 fosforüülimise märkimisväärselt vähenenud võrreldes ravimata seisunditega. Need leiud toetavad TM-i inhibeerivat toimet EMT-le.

Retseptori vahendamine rhTM-i kaitsvas aktiivsuses

Varasemad uuringud on näidanud, et GPR15 või FGFR1 vahendavad TM.26,27,54 tsütoprotektiivset toimet. Testisime, kas need retseptorid vahendavad rhTM-i kaitsvat toimet apoptoosi ja EMT vastu. Kui GPR15 valgu allareguleerimine siRNA poolt kaotas täielikult rhTM-i supresseeriva aktiivsuse TGFb{6}}vahendatud podotsüütide apoptoosile, ei kaotanud ei FGFR1 siRNA ega selle inhibiitor seda, mis viitab sellele, et GPR15 vahendab rhTM-i kaitsvat aktiivsust. Pärast rhTM-ga töötlemist täheldati kultiveeritud podotsüütides ja TGFb1-TG hiirtest eraldatud podotsüütides Akt suurenenud fosforüülimist, mis viitab rakusisese Akt raja osalemisele. Töö, mis näitab, et rhTM aktiveerib endoteelirakkudes Akt raja, toetab seda järeldust.55 Akt signaaliraja aktiveerimine võib veelgi võimendada rhTM-efekti, suurendades GPR15 pinnaekspressiooni.56 Need tähelepanekud näitavad, et rhTM kaitseb podotsüüte meie TGFb{-s apoptoosi eest. {13}}TG hiired, aktiveerides GPR15/Akt telje, mille tulemuseks on apoptootiliste faktorite suurenenud ekspressioon ja proapoptootiliste faktorite vähenenud ekspressioon.57 Teisest küljest näitasid varasemad uuringud, et anafülatoksiinid C3a ja C5a võivad oma GPR-de kaudu kaasa aidata CKD, kahjustades podotsüüte ja et APC võib pärssida podotsüütide apoptoosi ja neerufibroosi oma endoteeli valgu C retseptori ja proteaasiga aktiveeritud retseptori 1.23, 58–61 kaudu. Siin leidsime, et rhTM inhibeerib komplemendi süsteemi ja suurendab APC teket. Seetõttu võib lisaks GPR15/Akt raja aktiveerimisele komplemendi faktorite pärssimine ning C-valgu ja selle retseptorite suurenenud aktiveerimine selgitada ka rhTM-i kasulikke mõjusid meie TGFb{25}}seotud rakkudele.neerufibroosi mudel.

Lisaks blokeeris GPR15, kuid mitte FGFR1, allareguleerimine rhTM-i inhibeerivat toimet EMT-le, mis viitab sellele, et GPR15 vahendab ka seda rhTM-i kaitsvat aktiivsust. Smad-valkude inhibeerimine on seotud EMT supressiooniga, kuna ravi rhTM-ga inhibeeris nii Smad2 kui ka Smad3 fosforüülimist TGFb1-TG hiirtel ja kultiveeritud podotsüütides. Smad-valgu inhibeerimise täpne mehhanism GPR15 kaudu on siiski ebaselge. Mõned tõendid näitavad, et Akt rada võib läbida Smadi signaaliraja ja seda reguleerida,62–64 ning et Akt võib takistada Smad3 fosforüülimist, toimides vahetult fosforüülimata Smad3-ga, et eraldada see tuumast väljapoole, mis põhjustab transkriptsiooni ja EMT pärssimise. 64 Nende aruannete põhjal on mõeldav, et pärast rhTM-i seondumist GPR15-ga aktiveeritud Akt eraldab fosforüülimata Smad3, mis viib podotsüütide EMT inhibeerimiseni. Väärib märkimist, et seda Akt-vahendatud kasulikku toimet täheldatakse ainult mittepahaloomulistes rakkudes.65–67 Pahaloomulistes rakkudes võib TGFb1 interaktsioon selle retseptoritega otseselt aktiveerida fosfoinositiidi 3-kinaasi/Akt/tigu rada ja põhjustada EMT.65–67 Üldiselt toetavad meie uuringu tulemused GPR15 rolli retseptorina, mis vahendab rhTM-i kasulikku mõju podotsüütidele.

Järeldus

Kokkuvõttes kirjeldame siin esimest korda uudset transgeenset TG hiirt, mis ekspresseerib inimese TGFb1 geeni täispikkuses üle konkreetselt glomerulites, mis arendavad spontaanne ja progresseeruvat glomerulaarskleroosi, tubulointerstitsiaalset fibroosi janeerupuudulikkusja väljakujunenud neerufibroosi / neerupuudulikkuse leevendamine rhTM-i interaktsiooniga GPR15-ga, mis pärsib podotsüütide apoptoosi ja mesenhümaalset üleminekut.

MEETODID

TGFb1 BAC TG hiire genereerimine

TGFb1-BAC-TG hiir, mis ekspresseerib täispikka inimese TGFb1 geeni hiire podotsiini promootori kontrolli all, genereeriti pronukleaarse süstimise teel 392 C57BL/6J hiireembrüosse (CLEA Japan, Inc., Tokyo, Jaapan). Hindasime BAC TG konstruktsiooni TG asutajaid ja idutee ülekannet Southern blottinguga (täiendavad materjalid ja meetodid).

Katseloomad

Enne katsetes kasutamist kasvatati TGFb1-TG hiiri C57BL/6 taustal rohkem kui 10 põlvkonda. Kontrollloomadena kasutati WT pesakonnakaaslasi. Kõiki loomi peeti spetsiifilises patogeenivabas keskkonnas ja neile viidi läbi 12-tunnine valguse-pimeduse tsükkel ümbritseva õhu temperatuuril ja õhuniiskusel vahemikus 22–26 kraadi ja 40–70 protsenti ning neile võimaldati ad libitum juurdepääs. toidule ja veele Mie ülikooli loomamajas (täiendavad materjalid ja meetodid).

Eetiline avaldus

Rekombinantse DNA eksperimendi ohutuskomitee (loa nr I-629; kuupäev: 19. september 2013) ja Mie ülikooli loomauuringute komitee (loa nr 27-4; kuupäev: 19. august 2015) kiitis heaks uuringu protokollid. Kõik loomkatsed viidi läbi vastavalt Mie ülikooli institutsionaalsetele juhistele ja järgides Rahvusvahelise Terviseinstituudi (https://olaw.nih.gov/) avaldatud rahvusvaheliselt heakskiidetud laboriloomade hooldamise põhimõtteid.

Kliiniliseks uuringuks andsid kõik patsiendid ja terved katsealused kirjaliku teadliku nõusoleku ning uuringuprotokolli kiitis heaks Mie ülikooli kliiniliste uuringute eetikakomitee (kinnitusnumbrid 1043 ja 2194).

Eksperimentaalne disain

Iseloomustamiseksneerudfifibroosi mudeli järgi jaotasime isased TGFb{{0}}TG hiired (n=24) ja isased WT hiired (n=12) 4 nädala vanused ja kaaluga 20–23 g kolmeks. 8 TGF b1-TG hiirt ja 4 WT hiirt igas rühmas. Igast WT ja TGFb1-TG rühmast pärit hiired surmati 0., 8. või 16. nädalal, et koguda uriini-, vere- ja neeruproove, et hinnata fifibroosi ja neerufunktsiooni parameetrite muutusi aja jooksul.

RhTM-i (rhTM-i pakkus lahkesti Asahi Kasei Pharma Corporation, Tokyo, Jaapan) terapeutilise efektiivsuse hindamiseks neerufibroosi korral TGFb1-TG hiirtel (n= 8) või WT pesakonnakaaslastel (n {{2) }}) töödeldi rhTM-ga (3 mg/kg) ip süstimise teel 3 korda nädalas 4 nädala jooksul enne hiirte tapmist. Negatiivse kontrollhiirtena kasutati TGFb1-TG hiiri (n =8) või WT pesakonnakaaslasi (n= 8), kes said samaväärse koguse füsioloogilist SAL-i ip süstimise teel.

Käesoleva uuringu protokoll järgis loomuuringuid käsitlevaid suuniseid Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE). Hiired randomiseeriti ja parameetreid mõõtnud teadlased pimestati ravirühmadega.

Biokeemiline analüüs

Üldvalgu (BCA valgu analüüsi komplekt; Pierce, Rockford, IL), TGFb1 (R&D System, Minneapolis, MN), monotsüütide kemoatraktandi valgu -1 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), trombiini antitrombiini kompleksi kontsentratsioonid (Cedarlane Laboratories, Hornby, Ontario, Kanada) mõõdeti kaubanduslike ensüümi immuunanalüüsi komplektide abil, järgides tootja juhiseid (täiendavad materjalid ja meetodid).

Rakukultuur

Inimese podotsüütide primaarsed rakud osteti ettevõttest CELPR OGEN (Torrance, CA). Inimese podotsüütide primaarseid rakke kultiveeriti Dulbecco modifitseeritud Eagle söötmes niisutatud 5% CO2 atmosfääris 37 kraadi juures. Söötmele lisati 10 protsenti kuumusega inaktiveeritud veise loote seerumit (Bio Whittaker, Walkersville, MD), 100 RÜ/ml penitsilliini, 100 mg/ml streptomütsiini ja L-glutamiini (täiendavad materjalid ja meetodid).

Statistiline analüüs

Andmed on väljendatud mediaan±interkvartiilvahemikuna. Muutujate statistiline erinevus arvutati Kruskal-Wallise dispersioonanalüüsiga post hoc analüüsiga, kasutades Dunni testi. Kahe rühma vaheliste erinevuste hindamiseks kasutati Mann-Whitney U testi. Statistilised analüüsid viidi läbi GraphPad Prism versiooni 8.0.1 (GraphPad Software, San Diego, CA) abil. Statistiliseks olulisuseks loeti P <>

AVALIKUSTAMINE

EKG-l, CND-G-l ja YY-l on patent TGFb1-TG hiirele koosneerufibrooskasutatud käesolevas uuringus. CND-G ja YY said käesoleva uuringu jaoks toetuse Jaapani haridus-, kultuuri-, spordi-, teadus- ja tehnoloogiaministeeriumilt. EKG, TY, CND-G ja MT said Shionogi Pharmaceuticalsilt toetuse. Kõik teised autorid ei deklareerinud konkureerivaid huve.

TUNNUSTUS

Seda uurimistööd toetasid osaliselt Jaapani haridus-, kultuuri-, spordi-, teadus- ja tehnoloogiaministeeriumi stipendiumid (Kakenhi nr 17K09824 YY jaoks; Kakenhi nr 17K08442 CND-G jaoks) ja osaliselt Shionogi toetus. & Co, Ltd, Jaapan. Rahastajatel ei olnud mingit rolli uuringu kavandamisel, andmete analüüsimisel, avaldamise otsustamisel ega käsikirja ettevalmistamisel.

Osa sellest tööst avaldati abstraktsel kujul.

AUTORI KAASALAD

AT koostas haiguse mudeli ja kirjutas käsikirja esimese mustandi. TY, KN, TT, RI ja CND-G valmistasid ette haigusmudelid ja mõõdeti parameetreid. AM ja SW viisid läbi ülekandemikroskoopilise uuringu. MT, YO ja AU mõõtsid parameetreid ja viisid läbi in vitro katsed. YT, LQ, TK ja VFD andsid intellektuaalse panuse. YY ja EKG parandasid käsikirja mustandit ja kujundasid uuringu.

cistanche neerupuudulikkuse sümptomite korral

LISAMATERJAL

Täiendav fail (PDF) Täiendavad materjalid ja meetodid.

Tabel S1. Õppeainete omadused.

Tabel S2. Praimerid hiire kudede RT-PCR jaoks.

Tabel S3. Praimerid inimese podotsüütide RT-PCR jaoks.

Joonis S1. Lahustuvad trombomoduliini fragmendid korreleeruvad TGFb1 ja kreatiniiniga DM-ga patsientidel.

Joonis S2. Inimese TGFb1 – bakteriaalse kunstliku kromosoomi (BAC) konstruktsioon. Joonis S3. Asutajahiired, kes ekspresseerivad inimese TGFb1 geeni täispikkuses.

Joonis S4. Glomerulus-spetsiifilise transformeeriva kasvufaktori b1 transgeense hiire iseloomustus.

Joonis S5. Inimese TGFb1 transgeensel hiirel on suurenenud neerukahjustuse markerid.

Joonis S6. Ravi inimese rekombinantse trombomoduliiniga (rhTM) vähendab podotsüütide kadumist jala protsessist ja glomerulaarse basaalmembraani paksenemist.

Joonis S7. Inimese rekombinantse trombomoduliiniga (rhTM) ravitud TGFb1 transgeensetel hiirtel on neerukoes madal profibrootiliste tegurite ja HMGB1 kontsentratsioon. Joonis S8. Ravi inimese rekombinantse trombomoduliiniga (rhTM) suurendab aktiveeritud valgu C teket, inhibeerib komplemendi süsteemi, vähendab tsirkuleerivat lahustuvat podotsiini, kuigi see ei mõjuta TGFb1 transgeensete hiirte hüübimissüsteemi.

Joonis S9. Ravi inimese rekombinantse trombomoduliiniga (rhTM) vähendab podotsiini kontsentratsiooni uriinis.

Joonis S10. Ravi inimese rekombinantse trombomoduliiniga (rhTM) vähendab glomerulaarrakkude apoptoosi.

Joonis S11. TGFb1-üleekspressiooniga seotud neerufifibroosi ravi inimese rekombinantse trombomoduliiniga (rhTM) pärsib apoptoosi neerukoes.

Joonis S12. Inimese rekombinantne trombomoduliin (rhTM) suurendab antiapoptootiliste tegurite ekspressiooni podotsüütides.

Joonis S13. Inimese rekombinantne trombomoduliin (rhTM) pärsib vesinikperoksiidi poolt indutseeritud podotsüütide apoptoosi.

Joonis S14. Inimese rekombinantne trombomoduliin (rhTM) pärsib kõrge glükoositaseme poolt indutseeritud podotsüütide apoptoosi.

Joonis S15. Inimese rekombinantne trombomoduliin (rhTM) suurendab Akt-radade aktivatsiooni podotsüütides.

Joonis S16. Ravi inimese rekombinantse trombomoduliiniga (rhTM) suurendab Akt fosforüülimist TGFb1-TG hiirte podotsüütides.

Joonis S17. Iga hiirte ravirühma podotsüüdid ekspresseerivad GPR15 mRNA-d.

Joonis S18. GPR15 värvimine terve indiviidi ja fokaalse segmentaalse glomeruloskleroosiga patsiendi podotsüütides.

Joonis S19. Fibroblasti kasvufaktori retseptor-1 ei ole seotud inimese rekombinantse trombomoduliini (rhTM) inhibeeriva toimega podotsüütides.

Joonis S20. Inimese rekombinantne trombomoduliin (rhTM) pärsib podotsüütide epiteeli-mesenhümaalset üleminekut.

Joonis S21. Ravi inimese rekombinantse trombomoduliiniga (rhTM) pärsib a-silelihase aktiini ekspressiooni neerutuubulites.

Joonis S22. G-valguga seotud retseptor (GPR15) vahendab inimese rekombinantse trombomoduliini (rhTM) inhibeerivat toimet podotsüütide epiteel-mesenhümaalsele üleminekule.

Täiendavad viited.

VIITED

1. Webster AC, Nagler EV, Morton RL jt. Krooniline neeruhaigus. Lancet. 2017;389:1238–1252.

2. Bello AK, Levin A, Tonelli M jt. Globaalse neeru tervise seisundi hindamine. JAMA. 2017;317:1864–1881.

3. Levin A, Tonelli M, Bonventre J jt. Globaalne neerutervis 2017. aastal ja pärast seda: tegevuskava hoolduse, teadusuuringute ja poliitika lünkade kõrvaldamiseks. Lancet. 2017;390:1888–1917.

4. Ackland P. Kroonilise neeruhaiguse levimus, avastamine, hindamine ja ravi. BMJ. 2014;348:f7688.

5. Turner JM, Bauer C, Abramowitz MK jt. Kroonilise neeruhaiguse ravi. Kidney Int. 2012;81:351–362.

6. Breyer MD, Susztak K. Järgmise põlvkonna ravimid kroonilise neeruhaiguse raviks. Nat Rev Drug Discov. 2016;15:568–588.

7. Liu Y. Neerufibroos: uued teadmised patogeneesist ja ravimeetoditest. Kidney Int. 2006;69:213–217.

8. Liu Y. Neerufibroosi rakulised ja molekulaarsed mehhanismid. Nat Rev Nephrol. 2011; 7:684–696.

9. Xavier S, Vasko R, Matsumoto K jt. Endoteeli TGF-beeta signaaliülekande piiramine on piisav, et vähendada endoteeli-mesenhümaalset üleminekut ja fibroosi kroonilise neeruhaiguse korral. J Am Soc Nephrol. 2015;26:817–829.

10. Higgins SP, Tang Y, Higgins CE jt. TGF-beeta1 / p53 signaaliülekanne neerufibrogeneesis. Kärjesignaal. 2018;43:1–10.

11. Conway EM. Trombomoduliin ja selle roll põletikus. Seminimmunopatool. 2012;34:107–125.

12. Martin FA, Murphy RP, Cummins PM. Trombomoduliin ja veresoonte endoteel: ülevaade funktsionaalsetest, regulatiivsetest ja terapeutilistest aspektidest. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2013;304:H1585–H1597.

13. Morser J. Trombomoduliin seob koagulatsiooni põletiku ja immuunsusega. Curr Drug Targets. 2012;13:421–431.

14. Roeen Z, Toda M, D'Alessandro-Gabazza CN jt. Trombomoduliin pärsib eosinofiilide ja nuumrakkude aktivatsiooni. Cell Immunol. 2015;293:34–40.

15. Takagi T, Taguchi O, Toda M jt. Allergilise bronhiaalastma inhibeerimist trombomoduliini poolt vahendavad dendriitrakud. Am J Respir Crit Care Med. 2011;183:31–42.

16. Tateishi K, Imaoka M, Matsushita M. Trombomoduliini kaks moduleerivat funktsiooni alternatiivsel komplemendi rajal. Biosci suundumused. 2016;10:231–234.

17. Toda M, D'Alessandro-Gabazza CN, Takagi T jt. Trombomoduliin moduleerib dendriitrakke nii suure liikuvusega rühma valgu B1 antagonismide kui ka sõltumatu mehhanismi kaudu. Allergol Int. 2014;63:57–66.

18. Van de Wouwer M, Plaisance S, De Vriese A jt. Trombomoduliini lektiinilaadne domeen häirib komplemendi aktivatsiooni ja kaitseb artriidi eest. J Thromb Haemost. 2006; 4:1813–1824.

19. Sharfuddin AA, Sandoval RM, Berg DT jt. Lahustuv trombomoduliin kaitseb isheemilisi neere. J Am Soc Nephrol. 2009;20:524–534.

20. Wang H, Vinnikov I, Shahzad K jt. Trombomoduliini lektiinilaadne domeen leevendab diabeetilist glomerulopaatiat komplemendi inhibeerimise kaudu. Thromb Haemost. 2012;108:1141–1153.

21. Yang SM, Ka SM, Wu HL jt. Trombomoduliini domeen 1 leevendab diabeetilist nefropaatiat hiirtel NF-kappaB/NLRP3-vastase põletikulise vahendatud põletiku, NRF2 antioksüdantse aktiivsuse suurendamise ja apoptoosi pärssimise kaudu. Diabeetoloogia. 2014;57:424–434.

22. Ohlin AK, Larsson K, Hansson M. Lahustuva trombomoduliini aktiivsus ja lahustuv trombomoduliini antigeen plasmas. J Thromb Haemost. 2005;3: 976–982.

23. Gil-Bernabe P, D'Alessandro-Gabazza CN, Toda M jt. Eksogeenne aktiveeritud proteiin C pärsib diabeetilise nefropaatia progresseerumist. J Thromb Haemost. 2012;10:337–346.

24. Yasuma T, Yano Y, D'Alessandro-Gabazza CN jt. Diabeedi leevendamine S-valguga. Diabeet. 2016;65:1940–1951.

25. Havasi A, Borkan SC. Apoptoos ja äge neerukahjustus. Kidney Int. 2011;80:29–40.

26. Kuo CH, Sung MC, Chen PK jt. FGFR1 vahendab rekombinantset trombomoduliini domeeni poolt indutseeritud angiogeneesi. Cardiovasc Res. 2015;105:107–117.

27. Pan B, Wang X, Kojima S jt. Trombomoduliini viies epidermise kasvufaktorilaadne piirkond leevendab LPS-i põhjustatud sepsist, toimides GPR15-ga. Thromb Haemost. 2017; 117:570–579.

28. Lu Y, Ye Y, Bao W jt. Podotsüüdi tsütoskeleti jaoks oluliste geenide genoomi hõlmav tuvastamine, mis põhineb üherakulise RNA sekveneerimisel. Kidney Int. 2017;92:1119–1129.

29. Vigolo E, Marko L, Hinze C jt. Kanooniline BMP signaalimine torukujulistes rakkudes vahendab taastumist pärast ägedat neerukahjustust. Kidney Int. 2019;95:108–122.

30. Nangaku M. Krooniline hüpoksia ja tubulointerstitsiaalne vigastus: viimane ühine viis lõppstaadiumis neerupuudulikkuseni. J Am Soc Nephrol. 2006;17: 17–25.

31. Thomas R, Kanso A, Sedor JR. Krooniline neeruhaigus ja selle tüsistused. Esmahooldus. 2008;35:329–344, vii.

32. Mozes MM, Bottinger EP, Jacot TA jt. Fibrootilise maatriksi valkude ja transformeerivate kasvufaktori beeta (TGF-beeta) isovormide ekspressioon neerudes TGF-beeta transgeensetel hiirtel. J Am Soc Nephrol. 1999; 10:271–280.

33. Arif E, Solanki AK, Srivastava P jt. Motoorne valk Myo1c reguleerib transformeerivat kasvufaktori-beeta-signaali ja fifibroosi podotsüütides. Kidney Int. 2019;96:139–158.

34. Ebefors K, Wiener RJ, Yu L et al. Endoteliini retseptor-A vahendab glomerulaarse endoteeli pinnakihi lagunemist aktiveeritud podotsüütide ja glomerulaarsete endoteelirakkude vahelise patoloogilise läbirääkimise kaudu. Kidney Int. 2019;96:957–970.

35. Fu J, Lee K, Chuang PY jt. Glomerulaarsete endoteelirakkude kahjustus ja ristkõned diabeetilise neeruhaiguse korral. Am J Physiol Renal Physiol. 2015;308:F287–F297.

36. Masum MA, Ichii O, Elewa YHA et al. Modifitseeritud skaneeriv elektronmikroskoopia paljastab endoteelirakkude ja podotsüütide vahelise patoloogilise läbirääkimise membranoproliferatiivse glomerulonefriidi hiiremudelis. Sci Rep. 2018;8:10276.

37. Abbate M, Zoja C, Rottoli D jt. Proksimaalsed torukujulised rakud soodustavad fifibrogeneesi TGF-beeta{2}}vahendatud peritubulaarsete müofifibroblastide indutseerimise kaudu. Kidney Int. 2002;61:2066–2077.

38. Liu BC, Tang TT, Lv LL jt. Neerutuubulite vigastus: kroonilise neeruhaiguse edasiviiv jõud. Kidney Int. 2018;93:568–579.

39. Loefflfler I, Wolf G. Transforming kasvufaktor-beeta ja progresseerumine neeruhaigus. Nephrol Dial siirdamine. 2014;29 (suppl 1):i37–i45.

40. Murakami K, Takemura T, Hino S jt. Uriini transformeeriv kasvufaktor-beeta glomerulaarhaigustega patsientidel. Pediatr Nephrol. 1997;11:334–336.

41. Fujiwara K, Kobayashi T, Fujimoto H jt. Rakkude apoptoosi pärssimine ja kopsufibroosi leevendamine trombomoduliiniga. Olen J Pathol. 2017;187:2312–2322.

42. Kataoka K, Taniguchi H, Kondoh Y jt. Inimese rekombinantne trombomoduliin idiopaatilise kopsufibroosi ägeda ägenemise korral. Rind. 2015;148:436–443.

43. Tsushima K, Yamaguchi K, Yokoyama T jt. Trombomoduliin idiopaatilise kopsufibroosi ägedate ägenemiste korral: kontseptsiooniuuringu tõend. Pulm Pharmacol Ther. 2014;29:233–240.

44. Umemura Y, Yamakawa K. Optimaalne patsientide valik sepsise antikoagulantravi jaoks: tõenditel põhinev ettepanek Jaapanist. J Thromb Haemost. 2018;16:462–464.

45. Chen Q, Guan X, Zuo X jt. Suure liikuvusega rühmakasti 1 (HMGB1) roll neeruhaiguste patogeneesis. Acta Pharm Sin B. 2016;6:183–188.

46. ​​Miyake Y, D'Alessandro-Gabazza CN, Takagi T jt. Trombiini annusest sõltuv erinev toime allergilise bronhiaalastma korral. J Thromb Haemost. 2013;11:1903–1915.

47. Assady S, Wanner N, Skorecki KL jt. Uued teadmised podotsüütide bioloogiast glomerulaarse tervise ja haiguste puhul. J Am Soc Nephrol. 2017;28: 1707–1715.

48. Derynck R, Zhang YE. Smad-sõltuvad ja Smad-sõltumatud rajad TGF-beeta perekonna signalisatsioonis. Loodus. 2003;425:577–584.

49. Schuster N, Krieglstein K. TGF-beeta-vahendatud apoptoosi mehhanismid. Cell Tissue Res. 2002;307:1–14.

50. Greka A, Mundel P. Podotsüütide rakubioloogia ja patoloogia. Annu Rev Physiol. 2012;74:299–323.

51. Isaka Y. TGF-beeta signaalimise sihtimine neerufibroosi korral. Int J Mol Sci. 2018;19:2532.

52. Chang YJ, Cheng YW, Lin RK jt. Trombomoduliin mõjutab mittemetastaatilise kolorektaalse vähiga patsientide ellujäämist epiteeli-mesenhümaalse ülemineku (EMT) kaudu. PLoS One. 2016;11:e0160550.

53. Zheng N, Huo Z, Zhang B jt. Trombomoduliin vähendab kopsuvähirakkude tuumorigeenset ja metastaatilist potentsiaali E-kadheriini ülesreguleerimise ja N-kadheriini ekspressiooni allareguleerimise kaudu. Biochem Biophys Res Commun. 2016;476:252–259.

54. Pan B, Wang X, Nishioka C jt. G-valguga seotud retseptor 15 vahendab angiogeneesi ja trombomoduliini tsütoprotektiivset funktsiooni. Sci Rep. 2017;7:692.

55. Chen PS, Wang KC, Chao TH jt. Rekombinantne trombomoduliin avaldab endoteelirakkudes autofaagilist toimet ja annab ateroskleroosivastase toime apolipoproteiin E puudulikkusega hiirtel. Sci Rep. 2017;7: 3284.

56. Chung JJ, Okamoto Y, Coblitz B jt. PI3K/Akt signaali vahendatud valgu pinnaekspressioon, mida tajub 14-3-3 interakteeruv motiiv. VEEB J. 2009;276:5547–5558.

57. Sanchez-Capelo A. TGF-beeta1 kahekordne roll apoptoosis. Cytokine Growth Factor Rev. 2005;16:15–34.

58. Griffifin JH, Zlokovic BV, Mosnier LO. Aktiveeritud proteiin C, proteaasiga aktiveeritud retseptor 1 ja neuroprotektsioon. Veri. 2018;132:159–169.

59. Isermann B, Vinnikov IA, Madhusudhan T jt. Aktiveeritud proteiin C kaitseb diabeetilise nefropaatia eest, inhibeerides endoteeli ja podotsüütide apoptoosi. Nat Med. 2007;13:1349–1358.

60. Klos A, Tenner AJ, Johswich KO jt. Anafülatoksiinide roll tervises ja haigustes. Mol Immunol. 2009;46:2753–2766.

61. Morigi M, Perico L, Corna D jt. C3a retseptori blokaad kaitseb podotsüüte diabeetilise nefropaatia vigastuste eest. JCI Insight. 2020;5: e131849.

62. Conery AR, Cao Y, Thompson EA jt. Akt interakteerub otseselt Smad3-ga, et reguleerida tundlikkust TGF-beeta indutseeritud apoptoosi suhtes. Nat Cell Biol. 2004; 6:366–372.

63. Derynck R, Muthusamy BP, Saeteurn KY. Signaalraja koostöö TGF-beeta-indutseeritud epiteeli-mesenhümaalse ülemineku korral. Curr Opin Cell Biol. 2014;31:56–66.

64. Remy I, Montmarquette A, Michnick SW. PKB / Akt moduleerib TGF-beeta signaalimist otsese interaktsiooni kaudu Smad3-ga. Nat Cell Biol. 2004; 6: 358–365.

65. Hamidi A, Song J, Thakur N jt. TGF-beeta soodustab PI3K-AKT signaaliülekannet ja eesnäärmevähi rakkude migratsiooni läbi p85alfa TRAF6-vahendatud ubikvitilatsiooni. Teaduslik signaal. 2017;10:eaal4186.

66. Peng Z, Weber JC, Han Z jt. Akt signaalimise dihhotoomia mõju rinnavähi korral. Mol Vähk. 2012;11:61.

67. Zhou F, Geng J, Xu S et al. FAM83A signaalimine indutseerib epiteeli mesenhümaalset üleminekut PI3K / AKT / Snail raja kaudu NSCLC-s. Vananemine (Albany NY). 2019;11:6069–6088.