Ektoiini nahka valgendav toime MSH-stimuleeritud melanogeneesi pärssimise ja antioksüdantide Nrf2 radade aktiveerimise kaudu UVA-kiiritatud keratinotsüütides

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

You-Cheng Hseu 1,2,3,4, Xuan-Zao Chen 1, Yugandhar Vudhya Gowrisankar 1, Hung-Rong jeen 3,4,5,6, Jing-Yuan Chuang 7 ja Hsin-Ling Yang 8,*

Abstraktne:Ultraviolett A (UVA) kiiritusest põhjustatud reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) tootmine põhjustab liigsetmelanogeneesnaharakkudes, mis põhjustab pigmentatsiooni. Näitasime loodusliku bakteriaalse osmolüüdi Ectoine depigmenteerivat ja melanogeenset toimet UVA-kiirgusega inimese (HaCaT) keratinotsüütides ning selgitati välja selle aluseks olevad molekulaarsed mehhanismid. HaCaTrakke töödeldi eelnevalt madala kontsentratsiooniga ektoiiniga (0,5–1,5 µM) ja analüüsiti erinevate depigmenteerivate ja melanogeensete parameetrite suhtes. See eeltöötlus vähendas oluliselt ROS-i teket, melanotsüüte stimuleeriva hormooni (-MSH) tootmist ja proopiomelanokortiini (POMC) ekspressiooni UVA-kiirgusega HaCaT-rakkudes. Samutiantioksüdantheemoksügenaasi-1 (HO-1), NAD(P)H dehüdrogenaasi [kinoon 1] (NQO-1) ja -glutamaat-tsüsteiini ligaasi katalüütilise subühiku (-GCLC) valgu ekspressioonid olid vahendatud tuumafaktori erütroidi{7}}seotud faktori 2 (Nrf2) tuuma translokatsiooni kaudu, mille väljalangemine tõepoolest kahjustas seda mõju, mis näitab Nrf2 raja tähtsust. Ektoiin vahendas Nrf2 aktiveerimist p38, proteiinkinaasi B (tuntud ka kui AKT), proteiinkinaasi C (PKC) ja kaseiinkinaasi II proteiinkinaasi (CKII) radade kaudu. Ectoine'iga eeltöödeldud ja UVA-kiirgusega HaCaT rakkudest saadud konditsioneeritud sööde vähendastürosinaas, türosinaasiga seotud valk -1 ja -2 (TRP-1/-2), tsükliline AMP (c-AMP) proteiinkinaas, c-AMP-response element-inding protein (CREB) ) ja mikroftalmiaga seotud transkriptsioonifaktori (MITF) ekspressioonid, mis põhjustavad melanoomi B16F10 rakke, mis inhibeerivad melaniini sünteesi. Huvitaval kombel oli see melanogeenne toime -MSH-stimuleeritud B16F10 rakkudes täheldatav ainult ektoiini kontsentratsioonil 50–400 µM, mis tähistab ektoiiniga (0,5–1 µM) töödeldud keratinotsüütide naha võtmerolli.valgendaminemõjusid. Jõudsime järeldusele, et Ectoine'i saab kasutada tõhusa paikse, depigmenteeriva ja melanogeense toimega loodusliku kosmeetikavahendina.

Märksõnad:ektoiin; keratinotsüüdid;melanogenees; türosinaas; -MSH; Nrf2

Cistanche'il on oksüdatsioonivastane toime.

1. Sissejuhatus

Inimese naha kokkupuude UVA-kiirgusega käivitab ROS-i tekke ja ka melaniini ületootmise naharakkudes. ROS-i kontrollimatu tootmine võib põhjustada ka melanoomi seisundeid. Enamik nahka valgendavaid aineid on suunatud ja üritavad minimeeridamelanogeneesprotsess läbi -MSH jatürosinaaslavastused [1]. Enamik nahatooni heledamaks muutvaid kreeme koosneb hüdrokinoonist [2] või hüdrokortisoonist [3], mis teadaolevalt vähendavad melaniini butaare moodustumist, mis on samuti seotud tõsiste kõrvaltoimetega. Näiteks akne, ketendav ja sügelev nahk, naha siniseks ja mustaks muutumine, okronoos, põletav ja kipitav nahaärritus ning isegi põletik.valgendamineLooduslikest allikatest pärinevad ained, näiteks Kojic hape (Penicilliumi ja Aspergilluse liikide seente derivaat) põhjustab samuti kontaktdermatiiti tundliku nahaga inimestel. Nendel isikutel võib üle 1 protsendi kojichappest põhjustada tõsiseid ülitundlikke kõrvaltoimeid [4,5]. Seetõttu vaid vähesed looduslikult saadud nahadvalgendaminetooteid (oleosiin, lagritsaekstrakt, askorbiinhape, sojavalk, N-atsetüülglükoosamiin jne) kasutatakse praegu kosmeetikatööstuses [6]. Kuid nahahooldustooted, mis on peamiselt suunatud depigmenteerivatele omadustele, ei ole mõnikord keskendunud UVA-kiirguse poolt põhjustatud ROS-i ülemäärase tootmise kahjulike mõjude neutraliseerimisele.melanogeneesnaharakkudes.

Ektoiin on "looduslik ekstremolüüt", mis on toodetud mitmest mikroorganismide liigist, mis on stressirohke [7,8]. See ühend eraldati esmakordselt Egiptuse kõrbes elavatest bakteriliikidest Ectothiorhodospira. Selle ühendi tootmises osaleb ect operoni geenide kaskaad (ectA, ectB, ectC või ectD). Ektoiini tähistatakse keemiliselt kui 1,4,5,6-tetrahüdro-2-metüül-4-pürimidiinkarboksüülhapet [9]. Niiskuse sidujana aitab ektoiin naha rakumembraani ümberkorraldamisel [10], kaitseb UV-kahjustuste ja saaste eest [11,12], niisutab nahka [13], aeglustab naha enneaegset vananemist [14] jne. Naha kaitsvatele funktsioonidele on ektoiin osutunud kasulikuks atoopilise dermatiidi [15], Alzheimeri tõve [16], samuti HIV replikatsiooni [17], raadio- ja keemiaravi [18] ning maksatsirroosi pidurdamisel. 19]. Arvatakse, et ektoiinil on depigmenteerivad ja nahka valgendavad omadused, põhjustamata soovimatuid kõrvalmõjusid [20]. Seevastu ektoiini poolt esile kutsutud molekulaarsed mehhanismid pole teada. Seetõttu oli selle uuringu eesmärk piiritleda ektoiini vahendatud depigmentatsiooni- ja anti-melanogeensed mehhanismid, mis on esile kutsutud UVA-kiirgusega kiiritatud inimese (HaCaT) keratinotsüütides rakumudeli süsteemina. HaCaT rakkudest pärinevate nahka kaitsvate ainete ektoiiniga indutseeritud sekretsiooni mõju söötmele (konditsioneeritud sööde) testiti ka tüüpilise melanoomiraku (B16F10) liini abil.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Reaktiivid ja antikehad

Ektoiin (toote nr: 81619, puhtus 95 protsenti või suurem) osteti ettevõttelt Sigma-Aldrich (Taufkichen, Saksamaa). Veise loote seerum (FBS), penitsilliin/streptomütsiin, Dulbecco modifitseeritud Eagle'i sööde (DMEM) ja l-glutamiin osteti ettevõttest Invitrogen/Gibco BRL (Carlsbad, CA, USA). l-DOPA, melaniin, 3-4, 5-dimetüül-2-üül-2, 5-difenüültetrasooliumbromiid (MTT) ja -MSH hangiti ettevõttelt Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). N-atsetüültsüsteiin (NAC) ja 20,{13}}diklorofluorestseiindiatsetaat (DCFH2-DA) hangiti ettevõttest Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kõik JNK (SP600125), ERK1/2 (PD98059), p38 (SB203580), PKC (GF109203X) ja CKII jaoks vajalikud farmakoloogilised inhibiitorid saadi ettevõttest Calbiochem (La Jolla, CA, USA). Saadi PI3K/AKT inhibiitor (LY294002). firmalt Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kõik antikehad POMC, CREB, -aktiini,türosinaas, Nrf2, p-CREB, NQO-1, PKC, Kelchi-sarnane ECH-ga seotud valk-1 (Keap-1) ja TRP-1, TRP-2 saadi ettevõttelt Santa Cruz Biotechnology Inc. (Heidelberg, Saksamaa). Antikehad -GCLC ja HO{10}} vastu hangiti ettevõttelt Gene Tex Inc. (San Antonio, TX, USA). Saime c-AMP proteiinkinaasi ja CKII vastased antikehad ettevõttest Abcam (Cambridge, MA, USA). Histoonid, MITF, p-p38, p38, p-AKT ja AKT saadi ettevõttest Cell Signal Technology (Beverly, MA, USA). Tõhustatud kemoluminestsentsi (ECL) tuvastamise reagendid saadi ettevõttest Millipore, (Billerica, MA, USA). Kõik muud reagendid (HPLC kvaliteediga) osteti ettevõttelt Sigma-Aldrich või Merck & Co., Inc. (Darmstadt, Saksamaa).

2.2. Rakukultuur

Saime immortaliseeritud inimese naha keratinotsüütide HaCaT ja hiire melanoomi B16F10 rakud nii rakuliiniteenustest (CLS, Eppelheim, Saksamaa) kui ka Ameerika tüübikultuuride kollektsioonist (ATCC, VA, USA). Rakke kultiveeriti DMEM-is, millele oli lisatud 10 protsenti kuumaktiveeritud FBS-i, 1 protsenti streptomütsiini/penitsilliini ja 2 mM L-glutamiini, 37 °C juures niisutatud inkubaatoris, millele oli lisatud 5 protsenti CO2.

2.3. Rakkude töötlemine ja UVA-kiirgus

Enne UVA kiiritamist töödeldi rakke ektoiiniga (0,5–1,5 µM 24 tundi) või kandjaga (PBS). Pärast inkubeerimist eksponeeriti PBS-iga pestud rakud UVA-kiirgusele 3 J/cm2 (27 minutiks, λmax, 365 nm, alla 320 nm ei tuvastatud emissioone), kasutades UV CROSS-LINKER CL-508 (UVitec, Cambridge, Ühendkuningriik) [21].

2.4. Intratsellulaarne ROS-analüüs

HaCaT rakud külvati tihedusega 1,5 × 105 8-süvendiga Lab Teck kambrisse, mis sisaldas DMEM-i, millele oli lisatud 10% FBS-i, ja kasvatati 80% konfluentsuseni. Neid rakke töödeldi esmalt 1,5 µM ektoiiniga, millele järgnes UVA kiiritamine 3 J/cm2 ettenähtud aja jooksul. Rakke pesti PBS-ga ja rakusisese ROS-produktsiooni määramiseks kasutati DCFH2-DA meetodit. kasutades Olympuse tarkvara lahendustarkvara iga tingimuse jaoks [21].

2.5. Melaniini kvantifitseerimine

6-süvendiga plaadile külvati hiire melanoomi B16F10 rakud tihedusega 2,5 × 105 rakku süvendi kohta. Neid töödeldi eelnevalt 100, 200 ja 400 µM ektoiiniga 2 tundi -MSH puudumisel või juuresolekul. (1 uM). Melaniini kvantifitseerimiseks kasutatud protokoll järgis eelnevalt kirjeldatud meetodit [21]. Mõõtsime melaniini sisaldust ELISA mikroplaadilugejaga, mille neeldumislainepikkus oli 470 nm.

cistanche inhibeerib melaniini.

2.7. Western Blot

HaCaT (1 × 106 rakku 10 cm tassi kohta) või B16F10 (1 × 106 rakku 10 cm tassi kohta) rakke töödeldi eelnevalt erineva kontsentratsiooniga ektoiiniga (0,5, 1 ja 1,5 µM) või -MSH-ga (1). µM), millele järgneb kiiritamine UVA puudumisel või olemasolul ettenähtud aja jooksul. PBS-iga pestud rakud koguti, valgusisaldus (tuuma- ja tsütosoolne) eraldati pärast töötlemist. Seejärel allutati rakkudele Western blot meetod, mida varem kasutati erinevate tuuma- ja tsütosoolvalkude ekspressioonide määramiseks [21].

2.8. RNA ekstraheerimine ja RT-PCR

Ektoiiniga eeltöödeldud (1,5 uM, 24 h) HaCaT rakke töödeldi TRIzol reagendiga (Invitrogen, Carlsbad), et eraldada nendest rakkudest kogu RNA. 1 µg kogu RNA-d ja SuperScript-III One-Step RT-PCR plaatina Taq komplekti (Invitrogen, Carlsbad) tarnitud reagente kasutati PCR-katses Bio-Rad iCycler PCR-seadmega (Bio-Rad, Hercules, CA, Ameerika Ühendriigid). Kasutatud GAPDH päri- ja tagurpidi praimerid olid: F: 50-GCATCCTGGGCTACACTGA-30, R: 50-CCACCACCCTGTTGCTGTA-30. Katse lõpus analüüsiti PCR produkti 1% agaroosgeeliga. Seejärel visualiseeriti see etiidiumbromiidiga värvimisega. Sisekontrollina kasutasime GAPDH-d [22].

2.9. Immunofluorestsentsanalüüs

HaCaT rakke kultiveeriti tihedusega 1 × 104 rakku süvendi kohta DMEM-lisandis koos 10% FBS-iga 8-süvendiga Lab Teki kambris (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Eeltöötlesime rakke näidatud aja jooksul 1, 5 uM ektoiiniga, millele järgnes kiiritamine UVA puudumisel või juuresolekul. Rakud allutati immunofluorestsentsanalüüsile, milles kasutati eelnevalt kirjeldatud meetodit [21].

2.10. Statistiline analüüs

Kõikide selles uuringus kasutatud tulemuste puhul kasutasime keskmist ± standardhälvet (keskmine ± SD). Kõiki andmeid analüüsiti dispersioonanalüüsiga (ANOVA), millele järgnes Dunnetti test paaripõhiseks võrdluseks ja esitati keskmisena ± SD kolmest. või rohkem sõltumatuid katseid. Statistiline olulisus määrati * p < 0.05;="" **="" p="">< 0.01;="" ***="" p="">< 0.001="" võrreldes="" töötlemata="" kontrollrakkudega="" ja="" #="" p="">< 0,05;="" ##="" p="">< 0,01;="" ###="" p="">< 0,001="" võrreldes="" uva-ga="" eksponeeritud="" hacat="" rakkude="" või="" -msh-ga="" töödeldud="" b16f10="">

3. Tulemused

3.1. Ektoiini inhibeeritud UVA-indutseeritud ROS-i teke HaCaT-rakkudes

Esiteks testisime ektoiini tsütotoksilist toimet (joonis 1A) UVA-kiirgusega kiiritatud HaCaT rakkudele. Meie MTT andmed näitasid, et võrreldes töötlemata kontrollrakkudega oli Ectoine eeltöödeldud (0,5–1,5 µM) ja 3 J/cm2 UVA-ga eksponeeritud HaCaT rakud ei suutnud rakkude elujõulisuse olulist vähenemist (joonis 1B). Lisaks nõrgendas ektoiini eeltöötlus UVA (3 J/cm2) poolt indutseeritud rakusurma annusest sõltuval viisil (joonis 1B). Lisaks meie fluorestsentsandmetele, mis näitasid, et võrreldes kontrollrakkudega, suurendas 3 J/cm2 UVA-kiirguse ja ainult ektoiiniga töötlemine (1,5 µM) oluliselt ROS-i taset 5- ja 2- korda, vastavalt. Kuid Ectoine eeltöötluse puhul olid ROS-i tasemed oluliselt alla reguleeritud ja võime järeldada, et Ectoine'il onantioksüdantUVA-kiirguse vastane toime. See indutseerib ka ROS-i baastasemeid HaCaT rakkudes (joonis 1C, D).

3.2. Ektoiini allasurutud POMC ja -MSH ekspressioonid UVA-kiiritatud HaCaT rakkudes

UVA-kiirgusega eksponeeritud keratinotsüüte stimuleeriti nende ROS-p53 vahendatud POMC ja ka väikese peptiidhormooni -MSH jaoks, mis on tuletatud POMC-st [23]. Seetõttu määrasime Ectoine'iga eeltöödeldud HaCaT rakkudes -MSH, POMC ja teiste seotud valkude muutuste inekspressioonimustrid ja seejärel eksponeerisime need UVA-le (3 J / cm2). Western blot andmed näitasid, et UVA-indutseeritud -MSH ja POMC ekspressioonide ülesreguleerimine vähenes ektoiini eeltöötlusega; arvestades, et ektoine töötlemine ilma UVA-kiirguseta on täielikult inhibeerinud kiiritamata HaCaT rakkude -MSH ja POMC ekspressioone (joonis 2A). Hiljem testisime ektoiiniga eeltöödeldud ja UVA-kiirgusega kiiritatud HaCaT rakkudest saadud konditsioneeritud söötme (10 ml/100 mm plaat) mõju.melanogeneesB16F10 melanoomirakkudest. Joonisel 2B on kujutatud seda konditsioneeritud keskkonda, mis on allareguleeritudtürosinaas, TRP-1, TRP-2, c-AMP proteiinkinaasi, p-CREB, CREB ja MITF tasemed B16F10 rakkudes.

3.3. Ektoiini alareguleeritud melaniini ja türosinaasi ekspressioon -MSH-stimuleeritud B16F10 rakkudes

B16F10 melanoomirakud allutati esmalt ektoiini kõrgematele kontsentratsioonidele ja tsütotoksilisuse mõju määrati MTT testi abil. Joonis 3A näitab, et ektoiinil ei olnud suuremates kontsentratsioonides (100–400 μM 72 tunni jooksul) olulist mõju B16F10 rakkude elujõulisusele. Siiski ei muutunud rakkude elujõulisus 24- ja 48-tunnisel ektoiiniga töötlemisel (andmeid pole näidatud). Seetõttu kasutati neid kontsentratsioone, et määrata ektoiini mõju -MSH-stimuleeritudmelanogeneesB16F10 rakkudes. Melaniini kvantifitseerimisandmed näitasid, et võrreldes kontrollrakkudega tõstis ravi ainult -MSH-ga (1 μM) melaniini taset oluliselt rohkem kui 25 protsenti. Võrreldes ainult -MSH-ga töötlemisega, vähendasid rakud, mis puutusid kokku ektoiini suureneva kontsentratsiooniga (100–400 μM 72 tunni jooksul), annusest sõltuvalt ja oluliselt vähendasid melaniinisisalduse protsenti, kusjuures maksimaalne allareguleerimine oli vaid 85 protsenti (või –15 protsenti kui töötlemata). kontroll) täheldati 400 μM ektoiini eeltöötluse juures (joonis 3B). Veelgi enam, meie Western blot andmed näitasid ka, et -MSH stimuleeristürosinaas(24 h) ja p-CREB (2 h) ekspressioonid olid nendes melanoomirakkudes ektoiini eeltöötluse suureneva kontsentratsiooniga oluliselt alla reguleeritud (joonis 3C).

3.4. Ektoiin reguleeris HO-1, NQO-1 ja -GCLC valkude ekspressiooni HaCaT rakkudes

Et määrata aja mõju Nrf2 ektoiini poolt vahendatud tuuma translokatsioonile ja sellele järgnevale HO-1, NQO-1 ja -GCLC valkude allavoolu ekspressioonile, eksponeeriti HaCaT rakke 1,5 µM ektoiiniga ja raku valgud koguti. 0.5, 1, 2, 4, 8 või 12 tundi pärast ektoinetöötlust. Western blot andmed näitasid, et välja arvatud -GCLC valk, põhjustas 1,5 µM ektoiin HO-1, Nrf2 ja NQO-1 valkude maksimaalse ekspressiooni 4-tunnisel ajahetkel. -GCLC näidati 8-tunnisel ajahetkel (joonis 5A). Ajakõveralt saadud andmed viivad meid testima ektoiini kontsentratsiooni mõju ekspressioonileantioksüdantvalgud 4 tunni pärast. Joonis fig 5B näitab, et kõik kolm antioksüdantset valku ekspresseerisid maksimaalselt 1,5 uM ektoiini kontsentratsiooni juures. Hiljem testiti ektoiini eeltöötluse mõju Nrf2 ja Keap -1 suhte ekspressioonile UVA-kiirgusega kiiritatud HaCaT rakkudes. Lääne andmete analüüs näitas, et eeltöötlus 1,5 µM ektoiiniga näitas Nrf2/Keap-1 suhte suurenemist UVA-kiirgusega HaCaT rakkudes (joonis 5C). Samuti nägime ühtseid andmeid NQO suurenenud ekspressiooni kohta. -1, HO-1 ja -GCLC valgud ektoiiniga eeltöödeldud HaCaT rakkudes, mida kiiritati 3 J/cm2 UVA-ga (joonis 5D). Need andmed viitavad sellele, et ektoiini eeltöötlus mängib UVA-kiirgusega HaCaT rakkudes kaitsvat rolli.

3.5. Nrf2 aktiveerimisse ektoiiniga töödeldud HaCaT rakkudes olid kaasatud erinevad signaaliradad

Me määrasime kindlaks signalisatsiooniteed, mis on seotud Nrf2 ektoiini vahendatud tuuma translokatsiooniga. HaCaT rakke töödeldi eelnevalt PI3K / AKT, ERK, p38, JNK, PKC, ROS ja CKII signaaliradade farmakoloogiliste inhibiitoritega, millele järgnes 1, 5 μM ektoiin. Tuuma Nrf2 Western blot andmed näitasid, et selles mehhanismis osalesid p38 MAPK, PI3K / AKT, PKC ja CKII rajad (joonis 6A). Saadud teabe põhjal määrasime ka Ectoine'i eeltöötluse mõju nende radade rollile antioksüdantsete valkude ekspressioonis. Joonis fig 6B näitab, et MAPK, p38, PI3K/AKT, CKII ja PKC radade farmakoloogiline inhibeerimine reguleeris NQO-1, HO-1 ja -GCLC ekspressiooni alla.antioksüdantvalgud HaCaT rakkudes. Veelgi enam, aeg, mis kulus AKT, p38 fosforüülimiseks ning PKC ja CKII ekspressiooniks ektoiiniga kokkupuutel, näitab, et p38 fosforüülimine ning PKC ja CKII ekspressioonid toimusid hiljem, välja arvatud p-AKT. ainult ajapunktid (30 minuti pärast) (joonis 6C). AKT puhul täheldati fosforüülimist alates 15-minutilisest ajahetkest, mis saavutas haripunkti 30 minuti pärast (joonis 6C). AKT puhul täheldati fosforüülimist alates 15-minutilisest ajahetkest, mis saavutas haripunkti 30 minuti pärast (joonis 6C). Need kumulatiivsed tulemused viitasid sellele, et p38, AKT, PKC ja CKII signaalirajad aktiveerisid antioksüdantide ektoiini vahendatud tuuma translokatsiooni. Nrf2, mis viib antioksüdantsete valkude ekspressioonini.

3.6. Ektoiini vahendatud melanogeenne toime pärssis Nrf2 löögi tõttu

Nrf2 roll ektoiini vahendatud anti-melanogeneesmäärati Nrf2 vaigistamise teel HaCaT rakkudes. Western bloti andmed näitasid, et 1,5 μM ektoiiniga kokku puutunud Nrf2 knockdowni rakud näitasid minimaalset NQO-1, HO-1 ja -GCLC ekspressiooniantioksüdantvalgud (joonis 7A). Hiljem testisime Nrf2 knockdowni mõju -MSH taseme ekspressioonile UVA-kiirgusega (3 J/cm2) HaCaT rakkudes. Western blot'i tulemused näitasid, et siRNA-ga transfekteeritud rakkude kontrollimiseks oli UVA-kiirgus oluline -MSH taseme ekspressiooni ülesreguleerimisel ektoiiniga kokku puutumata rakkudes (joonis 7B). Kuid 1,5 μM ektoiini on selle efekti maha surunud. Teisel juhul näitasid siNrf2-ga transfekteeritud rakud -MSH taseme ekspressiooni vähenemist nii töötlemata kui ka töödeldud rakkudes (joonis 7B). Sarnaselt -MSH andmetega näitasid meie fluorestsentsiandmed ka seda, et UVA kiiritamine reguleeris märkimisväärselt ROS-i tootmist ektoiiniga töötlemata kontroll-siRNA rakkudes (joonis 7C, D). Kui rakud puutusid kokku 1,5 µM ektoiiniga, siis see efekt vähenes oluliselt. Teisest küljest näitasid Nrf2-ga transfekteeritud ja UVA-kiirgusega HaCaT-rakud ROS-i tasemete ligikaudu 8--kordset tõusu võrreldes Nrf2-ga transfekteeritud rakkudega, mida ei kiiritatud UVA-ga, kuid mida eksponeeriti ektoiiniga töötlemisele (joonis 7C, D). Kõik need andmed näitavad ektoiini vahendatud kaitsvat rolli, mida Nrf2 mängib melaniini tootmise minimeerimisel UVA-kiirgusega HaCaT rakkudes. Antioksüdandid 2020, 9, x PEER REVIEW 11/15 UVA-ga kiiritatud, kuid ektoiiniga töödeldud (joonis 7C, D) . Kõik need andmed tähistavad Nrf2 ektoiini vahendatud kaitsvat rolli melaniini tootmise minimeerimisel UVA-kiirgusega HaCaT rakkudes.

cistanche eelis: naha valgendamine

4. Arutelu

Erinevad nahad -valgendamineaineid kasutatakse kosmeetikatööstuses. Paljud neist ainetest on keemilise päritoluga ja kannatavad mitmesuguste kõrvalmõjude, sealhulgas vähi tekitamise piirangute all [24–26]. Seetõttu on ohutute ja looduslike nahka valgendavate ainete väljaselgitamine tunni vajadus. Ektoiini (joonis 1A) on teadaolevalt kasutatud näokreemide ja muude kosmeetikavahendite toimeainena. See toimib nahka niisutava ainena ja samuti arvatakse, et see aeglustab naha enneaegset vananemist [27]. Peaaegu kõik tuntud nahka valgendavad ained on suunatud naha allareguleerimiseletürosinaasensüümi aktiivsus UV-kiirgusega rakkudes, mis vähendabmelanogeneesnaharakkudes.Yao et al. demonstreerisvalgendaminebiosünteesitud ektoiini omadusi ja pakkus välja, et see on oletatav valgendav aine. Oma uuringus testisid nad ektoiini kõrget kontsentratsiooni (500 µM) valgendava toime osas hiire melanoomi (B16F0) ja inimese melanoomi (A2058) rakuliinidele ning jõudsid järeldusele, et ektoiin on ohutu ja potentsiaalne aine kosmeetiliseks ja kliiniliseks kasutamiseks [20]. Kuid selles uuringus testisime täiendavalt ektoiini madalate kontsentratsioonide (0, 5–1, 5 µM) kasulikku mõju UVA-kiirgusega HaCaT rakkudele ja selle aluseks olevad molekulaarsed mehhanismid dešifreeriti. Meie uuringus näidati, et Ectoine ei ole Nrf2/ARE raja kaudu mitte ainult indutseerinud antioksüdantse geeniekspressiooni ekspressiooni, vaid ka POMC allasurumise kaudu vähendanud -MSH taset UVA-kiirgusega HaCaT rakkudes. -MSH taseme langus oli korrelatsioonis türosinaasi ensüümi aktiivsuse vähenemisega, mis viis melaniini tootmise vähenemiseni. Meie teadmiste kohaselt on see esimene aruanne, mida tõendas mehhanism, mille Ectoine kutsus esile UVA-kiirgusega HaCaT rakkudes. See uuring kirjeldas molekulaarseid mehhanisme, mida Ectoine eksponeerib HaCaT rakkudes rakumudeli süsteemina.

Esmalt määrasime kindlaks ektoiini subletaalsed kontsentratsioonid ja UVA-kiirguse mõju HaCaT-rakkude elujõulisusele. Meie MTT andmed näitasid, et madalad ektoiini kontsentratsioonid (0,5–1,5 µM) ei avaldanud olulist mõju HaCaT-rakkude elujõulisusele (joonis 1B). Ektoiini eeltöötlus suurendas 3 J/cm2 UVA-kiirgusega HaCaT rakkude elujõulisust (joonis 1B). Nendele tähelepanekutele tuginedes jätkasime edasisi katseid, kasutades 1,5 µM ektoiini eeltöötlust ja UVA-kiirgust annustes 3 J/cm2.

UVA-kiirguse poolt indutseeritud ROS-i tootmine naha keratinotsüütides on hästi tuntud fakt [28]. Seetõttu testisime ka ektoiini eeltöötluse kasulikke mõjusid UVA-kiirguse poolt indutseeritud ROS-i tootmisel HaCaT rakkudes. Meie DCF-fluorestsentsi intensiivsuse andmed näitasid, et eeltöötlus 1,5 µM ektoiiniga vähendas oluliselt UVA-kiirguse poolt indutseeritud ROS-i tootmist inkeratinotsüütides. Samuti oli täheldatav, et 1, 5 µM ektoiini võib põhjustada HaCaT rakkude ROS taseme tõusu, mis osutus statistiliselt oluliseks (joonis 1D, E).

Rousseau et al. teatas, et POMC-d sekreteerivad inimese epidermaalsed keratinotsüüdid ja melanotsüüdid ning see on stimuleerinudmelanogenees[29]. Seda silmas pidades testisime ka UVA-kiirguse ja ektoiini eeltöötluse mõju melanogeneesiga seotud valkudele HaCaT rakkudes. Meie Western blot andmed näitasid, et -MSH ja POMC valkude ekspressiooni annusest sõltuv allareguleerimine UVA-kiirgusega kiiritatud HaCaT rakkudes oli põhjustatud eeltöötlemisest Ectoine'iga. Vastupidi, ektoiini eeltöötlusel on erinev mõju valkude ekspressioonimustrile.melanogenees-seotud valgud. Eelkõige on peaaegu kõik testitud valgud (Türosinaas, TRP-1, TRP-2, c-AMP proteinkinaas, CREB ja MITF) näitasid UVA-kiirgusega kiiritatud HaCaT rakkudes ektoiini eeltöötluse kontsentratsioonide suurenemisega ekspressioonide vähenemist (joonis 2A, B). Need andmed näitavad tõsiasja, et Ectoine omab UVA-kiirgusega HaCaT rakkudes melanogeenseid omadusi.

Ectoine'i melanogeenset toimet testiti täiendavalt B16F10 rakkudes, mis on hästi tuntud melanoomi rakuliin, mida kasutataksemelanogeneesuuringud [30]. Üks meie uuringu märkimisväärsetest tähelepanekutest oli see, et erinevalt HaCaT rakkudest oli melaniini sünteesi pärssimiseks -MSH-stimuleeritud B16F10 rakkudes vaja ektoiini kõrgeid kontsentratsioone (100–400 uM) (joonis 3B). Meie Western blot andmed näitasid, et ektoiin vähendas annusest sõltuvalt ekspressioonitürosinaasja p-CREB-valgud -MSH-stimuleeritud B16F10 rakkudes, mis toob kaasa ülalnimetatud efekti (joonis 3C). Seetõttu testiti ka seda, kas need kõrged ektoiini kontsentratsioonid võivad mõjutada B16F10 rakkude elujõulisust. Meie MTT-tulemused näitasid, et ektoiini kõrged kontsentratsioonid (100–400 µM) ei mõjutanud B16F10 rakkude elujõulisust (joonis 3A). Need tulemused näitavad, et keratinotsüütidel on võtmeroll ektoiini vahendatud anti-melanogeneesja depigmenteerivad efektid.

Transkriptsioonifaktori Nrf2 roll naharakkude metabolismis oli hästi dokumenteeritud [31]. Seetõttu testisime täiendavalt mehhanisme, mida mängib Nrf2/Keap-1 rada ektoiini vahendatud efektides keratinotsüütides. Joonisel 4A on näidatud, et ektoiini suurendas annusest sõltuvalt ja oluliselt Nrf2/Keap-1 suhet maksimaalse efektiga 1,5 µM ektoiini kontsentratsiooni juures. Samuti täheldati, et 1,5 µM ektoiin soodustas Nrf2 valgu tuuma translokatsiooni, kusjuures 2 h ajahetkel täheldati maksimaalselt Nrf2 ekspressiooni tuumavalgu fraktsioonist (joonis 4B). HaCaT rakkude immunofluorestsentsvärvimisel saadud andmed on samuti seda efekti toetanud. (Joonis 4D).

Inimese melanotsüütides ja keratinotsüütides on Marrot et al. ja teised on selgitanud Nrf2 kaitseraja tähtsust fotooksüdatiivse stressi vastustes [32]. Uurisime ka ektoiini vahendatud antioksüdantse valgu ekspressiooni mõju HaCaT rakkudes. Meie ajakõvera andmed näitasid, et kõigi kolme antioksüdantse valgu (HO-1, NQO-1, -GCLC) ja Nrf2 ektoiini vahendatud ekspressioon ekspresseerub ajaga kahefaasiliselt ({{ 8}},5–12 h) täheldati 4-tunnisel ajahetkel (joonis 5A). Sellest kontsentratsioonikõver, mis mõõdab ektoiinikontsentratsiooni mõjuantioksüdantvalgu ekspressioon määrati ka 4-tunnisel ajahetkel. Joonisel fig 5B on näidatud, et võrreldes töötlemata rakkudega on ektoiiniga töötlemine annusest sõltuvalt suurendanud HO-1, NQO-1, -GCLC valkude ekspressiooni. Samuti mõõtsime, kuidas ektoiini kontsentratsioon avaldas kaitsvat toimet HaCaT rakkudes, mis puutusid kokku UVA-kiirgusega. Western blot'i andmed näitasid, et ektoiin suurendas annusest sõltuvalt antioksüdantsete valkude ekspressiooni, suurendades samuti dramaatilist ülesreguleerimist Nrf2/Keap-1 suhtes (joonis 5C, D). Need tulemused näitasid, et ektoiinieeltöötlusel (1, 5 µM, 4 tundi) on potentsiaalne toime indutseerida antioksüdantse valgu ekspressiooni HaCaT-rakkudes, mis võib neutraliseerida UVA-ga kokkupuutest tulenevaid kahjulikke mõjusid.

antioksüdantne cistanche

5. Kokkuvõtted

Ülaltoodud andmete põhjal järeldasime, et ektoiini madalad kontsentratsioonid (0,5–1,5 µM) võivad POMC ja melaniini tootmist alla reguleerida.türosinaasrada UVA kiiritatud HaCaT rakkudes, mis näitab selle anti-melanogeneestõhusust. Lisaks osales Ectoine ka intratsellulaarse ROS-i tootmise pärssimises HaCaT rakkudes. Erinevalt HaCaT rakkudest suutsid ektoiini kõrged kontsentratsioonid (50–400 µM) näidata B16F10 melanoomirakkudes sarnast toimet, mis on näidanud tõsiasja, et keratinotsüüdid võivad mängida võtmerolli ektoiini vahendatud anti-melanogeneesja nahk-valgendaminemõju naharakkudele. Kõige tähtsam on see, et ektoiin vahendas kasulikke toimeid Nrf2 raja aktiveerimise kaudu, mis kutsub esileantioksüdantvalgud HO-1, NQO-1 ja -GCLC. Näidati, et AKT on esimene signalisatsioonirada, mis käivitab Nrf2 aktiveerimise, millele järgnesid teised teed (p38, PKC ja CKII). Lõpuks andis Nrf2 vaigistamine otse tõendeid selle kohta, et Nrf2 mängib võtmerolli nii rakusisese ROS kui ka -MSH tootmise reguleerimisel. Jõudsime järeldusele, et ektoiini peamist valgendamismehhanismi peaks põhjendama ROS-p53/POMC{10}}MSH raja pärssimine UVA-kiirgusega HaCaT rakkudes. Seetõttu võib ektoiin või selle derivaadid olla niisutajate ja losjoonide aktiivne koostisosa. mida kasutatakse potentsiaalse ja loodusliku nahanavalgendaminekosmeetikatööstuse ained.

antioksüdantne tsistanši lisand