RNA M6 A lugeja YTHDF2 kontrollib NK-rakkude kasvajavastast ja viirusevastast immuunsust, 3. osa

YTHDF2 on vajalik IL-15-vahendatud NK-rakkude ellujäämise, proliferatsiooni ja efektorfunktsioonide jaoks

IL-15 on üks, kui mitte kõige olulisem tsütokiin NK-rakkude pleiotroopsete funktsioonide jaoks. Meie ja teised avastasime varem, et IL-15 mängib võtmerolli NK-rakkude homöostaasi, ellujäämise ja efektorfunktsioonide reguleerimisel (Becknell ja Caligiuri, 2005; Carsonet al., 1997; Carson et al., 1994; Wang et al., 2019b; Yu et al., 2013).

Rakkude pleiotroopia viitab nende võimele täita erinevates keskkondades erinevaid funktsioone. Rakkude pleiotroopia on tihedalt seotud immuunsusega, kuna paljud immuunsüsteemi rakud võivad mängida erinevaid rolle.

Immuunsüsteemis on T-rakud väga kriitilise tähtsusega rakutüüp. Nad tunnevad ära ja ründavad patogeene, reguleerides samal ajal ka teiste immuunrakkude aktiivsust. T-rakkude pleiotroopia on väga oluline, sest kui immuunsüsteem puutub kokku uue patogeeniga, peavad T-rakud tõhusaks reageerimiseks lühikese aja jooksul täitma erinevaid rolle. Näiteks kui immuunsüsteem puutub kokku bakteriaalse infektsiooniga, peavad T-rakud täitma bakterite tapmise rolli ja kui immuunsüsteem puutub kokku viirusinfektsiooniga, peavad T-rakud täitma teiste immuunrakkude reguleerimise rolli.

Lisaks on immuunsüsteemis pleiotroopne toime ka rakkude klassil, mida nimetatakse makrofaagideks. Nad võivad fagotsütoosida ja lagundada võõrpatogeene ning aktiveerida ka teisi immuunrakke, et patogeene rünnata. Makrofaagide pleiotroopia on oluline, kuna nad peavad erinevates keskkondades täitma erinevaid rolle. Näiteks viirusnakkuste korral peavad makrofaagid viiruse vastu võitlemiseks eritama mõningaid aineid, samas kui bakteriaalsete infektsioonide korral peavad makrofaagid patogeeni puhastamiseks bakterid endasse neelama ja seedima.

Kokkuvõttes on rakulise pleiotroopia ja immuunsuse vahel tihe seos. Pleiotroopsed rakud võivad erinevate patogeenidega nakatunud keskkondades mängida erinevat rolli, suurendades seeläbi immuunsüsteemi reageerimisvõimet ja parandades organismi immuunsust erinevate patogeenide suhtes. Seetõttu peaksime pöörama tähelepanu rakkude pleiotroopiale ja tugevdama ka immuunsuse kasvatamist, et säilitada inimeste tervist. On näha, et peame parandama mälu ja Cistanche deserticola võib oluliselt parandada mälu, sest Cistanche deserticola suudab reguleerida ka neurotransmitterite tasakaalu, näiteks tõsta atsetüülkoliini ja kasvufaktorite taset. Need ained on mälu ja õppimise jaoks väga olulised. Lisaks võib Cistanche deserticola parandada ka verevoolu ja soodustada hapniku kohaletoimetamist, mis tagab aju piisava toitainete ja energia kättesaamise, parandades seeläbi aju elujõudu ja vastupidavust.

Klõpsake nuppu Tea, kuidas oma mälu parandada

Käesolevas uuringus näitame, et IL-15 suurendas YTHDF2 mRNA ja valgu taset NK-rakkudes (joonis 6 A; ja joonis 1, D–F). Seetõttu oletasime, et YTHDF2 on vajalik IL-15-vahendatud ellujäämiseks ja NK-rakkude efektorfunktsioonide jaoks.

Esmalt püüdsime tuvastada potentsiaalseid transkriptsioonifaktoreid, mis on allavoolu IL{0}} signaaliülekandest, mis reguleerivad otseselt YTHDF2 ekspressiooni. Analüüsisime DNA elementide entsüklopeediat, kasutades Santa Cruzi California ülikooli genoomibrauseri andmebaasi (https://genome.ucsc.edu), mis annab ennustusi sidumissaitide kohta kogu genoomis koos JASPARiga (http://jaspar.genereg). .net).

Leidsime, et STAT5-l, mis on NK-rakkudes IL-15 põhitegur, on neli sidumissaiti 2 kb Ythdf2 transkriptsiooni algussaidist (TSS) ülesvoolu, mis näitab, et IL-15 võib positiivselt mõjutada. reguleerida Ythdf2 transkriptsiooni hiire NK-rakkudes STAT5 kaudu.

Kasutades STAT5 inhibiitorit STAT5-IN-1 (Müller et al., 2008), näitasime, et STAT5 inhibeerimine põhjustas Ythdf2 vähenemise nii mRNA kui ka valgu tasemel hiire NK-rakkudes (joonis S4, A ja B). Et veelgi kinnitada, et YTHDF2 on STAT5 poolt reguleeritud allavoolu tegur, kasutasime Stat5fl/fl Ncr1-iCre hiiri (edaspidi Stat5ΔNK hiired), kus STAT5 on spetsiifiliselt deleteeritud hiire NK-rakkudest (Wiedemann et al., 2020).

Töötlesime Stat5WT ja Stat5ΔNK hiirte põrna NK rakke IL-15-ga. Leidsime, et YTHDF2 vähenes oluliselt Stat5ANKhiirte NK-rakkudes võrreldes Stat5WT hiirte NK-rakkudega nii RNA kui ka valgu tasemel (joonis 6, B ja C; ja joonis S4, C ja D).

Lutsiferaasi reporteranalüüs näitas, et nii STAT5a kui ka STAT5b aktiveerisid otse Ythdf2 geeni transkriptsiooni (joonis 6, D ja E). Kromatiini immunosadestamise (ChIP) – qPCR tulemused näitasid, et STAT5 on neljas kohas märkimisväärselt rikastatud normaalse IgG kontrolliga võrreldes, mis näitab otsest seondumist hiire NK-rakkudega (joonis 6 F). Üheskoos näitavad meie tulemused, et YTHDF2 ekspressiooni reguleerib STAT5 NK-rakkudes IL-15 signaaliülekandest allavoolu.

Seejärel mõtlesime, kas Ythdf{0}}puudulikud NK-rakud ei reageerinud IL-le-15. Isoleerisime põrna NK-rakud Ythdf2ΔNK hiirtelt ja Ythdf2WT hiirtelt ning kultiveerisime themin vitro IL-15 juuresolekul. Leidsime, et NK-rakkude kasv oli Ythdf2ANK hiirtel oluliselt vähenenud võrreldes Ythdf2WT hiirtega (joonis 6 G). CellTrace Violet (CTV) märgistamise testid näitasid, et NK-rakkude proliferatsioon oli Ythdf2 puudulikkuse tõttu häiritud (joonis 6 H).

 Rakutsükli jaotusanalüüs näitas Ythdf2ΔNK hiirte NK-rakkude märkimisväärselt suurenenud osakaalu G0/G1 faasis, kuid Ythdf2ΔNK hiirte NK-rakkude märkimisväärselt vähenemist S-faasis (joonis 6 I), mis viitab Ythdf2 puudulikkuse tulemustele. G0/G1 faasi seiskumisel NK-rakkudes.

Lisaks suurenes Ythdf2ΔNK hiirte apoptootiliste (anneksiin V+Sytox-Blue+/−) NK-rakkude arv kaks kuni kolm korda võrreldes Ythdf2WT hiirte omadega (joonis 6 J), mis näitab NK-rakkude puudulikku ellujäämist pärast hiirte kaotust. Ythdf2. Need tulemused viitavad sellele, et YTHDF2 reguleerib NK-rakkude reageerimist IL-15-le in vitro. Kuna IL-15 transleeritakse halvasti ja sekreteeritakse in vivo püsiolekus (Corbel et al., 1996; Fehniger et al., 2001), uurimaks, kas Ythdf2-puudulikud NK-rakud on oma vastuses puudulikud IL-15 in vivo, ravisime hiiri IL-15-ga.

Leidsime, et Ythdf2-puudulikud versus WT NK-rakud näitasid oluliselt vähenenud rakkude proliferatsiooni ja suurenenud rakkude apoptoosi, kui hiiri raviti IL-15-ga (joonis 6 K; ja joonis S4, E–J). Need andmed viitavad sellele, et YTHDF2 reguleerib NK-rakkude reageerimist IL-15-le, eriti teatud tingimustes, kus IL-15 on kõrge. Samuti leidsime, et IFN-, gransüüm B ja perforiini mRNA ja valgu tase vähenes Ythdf2ΔNK NK-rakkudes võrreldes Ythdf2WT NK-rakkudega IL-15-le vastusena oluliselt (joonis 6, L–N), mis näitab, et YTHDF2 aitab kaasa ka IL-15-vahendatud NK-rakkude efektorfunktsioonidele in vitro.

Meie andmed näitavad kollektiivselt, et YTHDF2 on vajalik IL-15-vahendatud NK-rakkude ellujäämise, proliferatsiooni ja efektorfunktsioonide jaoks. Järgmisena uurisime allavoolu mehhanisme, mille abil YTHDF2 reguleerib IL-15-vahendatud NK-i ellujäämist, proliferatsiooni ja efektorfunktsiooni. Leidsime, et Ythdf2ΔNKhiirte ja Ythdf2WT hiirte NK-rakkudel oli IL-15 retseptorite CD122 (IL-15R) ja CD132 (IL-15R c; joonis S4 K) tase sarnane. IL-15 signaali vahendavad NK-rakkudes vähemalt kolm allavoolu signaalirada: Ras–Raf–MEK–ERK, PI3K–AKT–mTOR ja JAK1/3–STAT3/5 (Mishra et al., 2014).

Et uurida, millist signaalirada YTHDF2 reguleerib NK-rakkudes, uurisime Ythdf2ΔNK hiirte või Ythdf2WT hiirte ERK, AKT, S6, STAT3 ja STAT5 inNK-rakkude fosforüülimise taset pärast IL-ga stimuleerimist -15.

Tulemused näitasid, et Ythdf2 puudulikkus ei mõjutanud ERK, AKT, S6 ja STAT3 fosforüülimist IL-15-stimulatsioonil (joonis S4, L ja M), kuid pärssis oluliselt STAT5 aktivatsiooni, mida tõendab STAT5 vähenenud fosforüülimise tase Ythdf{{s 7}}puudulikud NK-rakud kui Ythdf2WT hiirte NK-rakkudes (joonis 6 O), mis näitab, et YTHDF2 on vajalik optimaalse IL-15/STAT5 signaaliülekande jaoks aktiveeritud NK-rakkudes.

Kuna näitasime, et IL-15-st allavoolu fosforüülitud STAT5 seondub Ythdf2 promootoriga (joonis 6, D–F), ja siin näitasime, et YTHDF2 on vajalik optimaalseks STAT5 fosforüülimiseks, viitavad meie andmed STAT5-YTHDF2 positiivse tagasiside ahelale allavoolu IL-15, mis võib kontrollida NK-rakkude ellujäämist, proliferatsiooni ja efektorfunktsioone.

Transkriptoomi hõlmav analüüs tuvastab Tardbp YTHDF2 sihtmärgina NK-rakkudes

Molekulaarse mehhanismi käsitlemiseks, mille abil YTHDF2 reguleerib NK-rakke, teostasime esmalt RNA sekveneerimise (seq) IL-2-laiendatud Ythdf2WT ja Ythdf2ΔNK NK-rakkudes. Kustutamine Ythdf2 NK-rakkudes andis tulemuseks 617 erinevalt ekspresseeritud geeni, sealhulgas 252 ülesreguleeritud geeni ja 365 allareguleeritud geeni (joonis S5 A).

Geeniontoloogia (GO) analüüs näitas, et erinevalt ekspresseeritud geenid olid oluliselt rikastatud rakutsükli, rakkude jagunemise ja rakkude jagunemisega seotud protsesside, sealhulgas mitotsütokineesi, kromosoomide segregatsiooni, spindli, nukleosoomi, keskkeha ja kromosoomiga (joonis 7). A).

Geenikomplekti rikastamise analüüs (GSEA) näitas E2F sihtmärkide, G2/Mcheckpointi ja mitootilise spindli tunnusgeenide olulist rikastamist Ythdf2ΔNKNK rakkudes (joonis S5 B). Rakutsükli ja rakujagunemisega seotud geenid, sealhulgas Aurka, Aurkb, Cdc20, Cdc25b, Cdc25c, Cdk1, E2f2 ja Plk1 (Bertoli et al., 2013), vähenesid Ythdf2ANK7 B hiirte NK-rakkudes oluliselt (joonis fig. ).

Spindli ja kromosoomide segregatsioonigeenid, nagu Anln, Aspm, Birc5, Bublb, Cenpe, Esco2, Ska1, Ska3 ja Tpx2 (Gorbsky, 2015), olid Ythdf2ΔNK hiirte NK-rakkudes samuti oluliselt alla reguleeritud, võrreldes NK-rakkudega Ythdf2ΔNK hiirtest, võrreldes NK-rakkudega Ythdf2ΔNK-st (F2igWTm).

Lisaks vähenesid rakkude ellujäämise geenid, sealhulgas Birc5 (Niu et al., 2010), Septin4 (Larisch et al., 2000) ja Rffl (Yanget al., 2007), märkimisväärselt Ythdf2ANK hiirte NK-rakkudes (joonis fig. 7 D). NK-rakkude efektorfunktsiooni geenid, sealhulgas Klrk1, Ncr1, CD226 ja Gzma (Bezman et al., 2012), olid Ythdf2ANK hiirte NK-rakkudes samuti oluliselt allareguleeritud (joonis 7 D).

Need andmed toetavad meie iseloomustatud YTHDF2 rolli NK-rakkude proliferatsiooni, ellujäämise ja efektorfunktsioonide reguleerimisel. Seejärel teostasime Ythdf2WT ja Ythdf2ΔNK hiirte IL-2-laiendatud NK-rakkudes m6A-seq. Põhikomponentide analüüs näitas, et iga genotüübi kolm bioloogilist replikatsiooni koondusid kokku (andmeid pole näidatud), mis viitab m6A-seq proovide heale korratavusele.

Motiivide rikastamise hüpergeomeetrilise optimeerimise (HOMER) analüüs tuvastas m6A konsensusmotiivi (GGAC), mis näitab m6A-modifitseeritud transkriptide edukat rikastamist (joonis 7 E). m6A modifikatsioonid paiknesid valdavalt valku kodeerivates transkriptides ja piigid rikastati 59 transleerimata piirkonnas (UTR) ja 39UTR-is, eriti algus- ja lõppkoodonite ümber (joonis 7 F ja joonis S5 C).

GOenrichment analüüs geenid m6A piigid näitas, et enamik m6A-märgistatud transkripte NK-rakkudes olid rikastatud radasid, mis on seotud rakutsükli ja rakkude proliferatsiooni (joonis S5 D).

For more information:1950477648nn@gmail.com