Kroonilise neeruhaiguse kõige levinum patoloogiline ilming on mingi neerufibroosi vorm

Lisateabe saamiseks võtke ühendust

Taust:Fibroos on üks levinumaid neerude vananemisprotsessi patoloogilisi tunnuseid ning vananevates neerudes esinev fibroos süvendab ka kroonilise neeruhaiguse (CKD) protsessi. Corallodiscus flabellata BLBurtt (C.flabellata, CF) on Hiina folklooris sageli kasutatav botaaniline ravim. Kuid vähesed uuringud on teatanud selle farmakoloogilistest mõjudest. Selle uuringu eesmärk oli uurida CF etanooli ekstrakti mõju neerufibroosile SAMP8 hiirtel ja tuvastada potentsiaalselt aktiivsed ühendid.

Meetodid:Loommudelitena kasutati vananemiskiirendatud hiirele kalduvat 8 (SAMP8) ja ühe kuu jooksul manustati sondiga erinevaid CF annuseid. Hiirte neerude vananemise astme jälgimiseks -galaktosidaasi värvimise abil. Neerufibroosi hindamiseks hiirtel kasutati Massoni värvimist ning Col-lI, a-SMA ja FN ekspressioonitasemeid. Mõõdeti Nrf2 raja ja Wnt/-catenin/RAS raja valgu ekspressioonitasemed neerudes. Ja -galaktosidaasi ( -gal) indutseeritud NRK{11}}E rakud in vitro mudelina CF aktiivsete komponentide skriinimiseks.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Tulemused:CF etanooliekstrakt inhibeeris oluliselt neeru-galaktosidaasi aktiivsust ja Coll, a-SMA ja FNin SAMP8 hiirte ekspressioonitasemeid ning parandas SAMP8 hiirtel Massoni värvimist. CF vähendas SAMP8 hiirtel märkimisväärselt uriinivalgu, kreatiniini, uurea lämmastiku ning TNF-a ja IL-1 taset seerumis ning suurendas oluliselt SOD ja GSH-Px taset. Veelgi enam, CF aktiveeris Nrf2 raja ja blokeeris Wnt / -catenin / RAS raja hiirte neerudes. Lisaks 3,4-dihüdroksüfenüületanool (SDC-0-14,16) ja (3,4-dihüdroksüfenüületanool-8-O-[4-O-trans -kofeoüül- -D-apiofuranosüül-(1→3)- -D-glükopüranosüül (1→6)]- -D-glükopüranosiid (SDC-1-8) eraldati CF-st , mis vähendas NRK-52E-rakkude vananemist ja võib-olla ka CF-i aktiivseid koostisosi, mis mängivad vananemisvastast rolli.

Järeldused:Meie katsed näitasid, et CF etanooli ekstrakt võib Wnt / -catenin / RAS raja kaudu leevendada SAMP8 hiirte neerufibroosi. Ja SDC-0-14,16 ja SDC-1-8 võivad olla CF-i materiaalseks aluseks, et avaldada neerude vananemisega seotud mõjusid.

Märksõnad:Vananemine, Corallodiscus flabellata, neer, neerufibroos, SAMP8, vananemine, Wnt/-catenin/RAS

Sissejuhatus

Kroonilise neeruhaiguse (CKD) ülemaailmne levimus suureneb koos elanikkonna vananemisega ja on ühiskonnale märkimisväärne koormus [1-3]. Kroonilise neeruhaiguse kõige levinum patoloogiline ilming on mingi neerufibroosi vorm[4]. Samuti on neerufibroos üks neerude vananemise märke [2]. Uuringud on näidanud, et oksüdatiivne stress, põletik, Wnt/-kateniini, reniin-angiotensiin-aldosterooni süsteemi (RAS) ja rapamütsiini (mTOR) signaalid on kõik seotud vananemisest põhjustatud kroonilise neeruhaigusega [5]. Neerufibroos vananevates neerudes on tihedalt seotud Wnt / -kateniini ja RAS-i signaaliraja aktiveerimisega [6]. Wnts-i aktiveerimisel translokeerub tsütoplasmas olev -kateniin tuuma, kus see seondub lümfoidse võimendaja sidumisfaktori (LEF) / T-rakufaktori (TCF) transkriptsioonifaktori perekonnaga ja algatab allavoolu sihtgeenide transkriptsiooni. Huvitaval kombel sisaldab RAS geeni promootorpiirkond ka LEF/TCF sidumissaite, mis võimaldab -kateniinil soodustada LEF-1 seondumist nende saitidega[7].cistanche kolesterool,Seetõttu võib Wnt/-catenin/RAS signaaliraja sihtimine olla potentsiaalne neerufibroosi ravistrateegia [8,9]. Viimastel aastatel on paljude teadlaste tähelepanu pälvinud neerufibroosi asendusravi looduslike toodetega [10]. . Xiaoyan Shen jt leidsid, et ginsenosiid Rgl leevendas neerude vananemise ajal glomerulaarfibroosi, inhibeerides SAMP8 hiirtel NLRP3 põletiku aktivatsiooni [11]. Selles uuringus uuriti C. flabellate(CF) ekstrakti mõju neerufibroosile SAMP8 hiirtel Wnt/-catenin/RAS rajal.

Cistanche on vananemisvastane toime

CF kui ravimtaim Hiinas registreeriti esmakordselt ajakirjas "Dian Nan Ben Cao. Kogu taime kasutatakse tavaliselt düsenteeria, enneaegse ejakulatsiooni, seemnepõiekeste ja neeruhaiguste raviks Hiina etnilistes vähemustes [12]. Praegu , on tänapäevastes uuringutes vähe teateid CF-i kohta. Meie laboris läbi viidud farmakoloogilised uuringud näitasid, et CF-i ekstraktil on diureetiline toime ja see leevendas lipopolüsahhariidi/D-galaktosamiini põhjustatud maksapuudulikkust ja ajukahjustust rottidel [13, 14]. Ja fütokeemilised uuringud selgus, et CF-i peamised keemilised komponendid on fenüületanoidglükosiidid ja flavonoidid [15,16]. Selle uuringu eesmärk oli uurida CF ekstrakti mõju neerufibroosile SAMP8 hiirtel ja selgitada selle võimalikku mehhanismi, et pakkuda. iidsetes raamatutes kirjeldatud eksperimentaalsed tõendid neeruhaiguse ravi kohta CF-ga.

materjalid ja meetodid

Taimse materjali kogumine ja ekstraheerimine

"Yunnan Chinese Herbal Medicine" märgib, et CF-i saab koristada aastaringselt. Selles katses kasutatud CF-taimed koguti septembris Hiinas Henani provintsis Xixia maakonnas. Selle tuvastas professor Suiqing Chen Henani Hiina meditsiini ülikoolist ja proove säilitati laboriproovide raamatukogus.cistanche deserticola kõrvaltoimedTaimi (1 kg) keedeti püstjahutiga 50% etanooliga (3 × 12 l, igaüks 1 tund) ja segu filtriti 16 kihiga marli. Ühendatud filtraadid kuivatati rootoraurustamisega, kasutades külmkuivatit. Lõpuks oli CF 50% etanooli toorekstrakti protsentuaalne saagis 15,5%. Kuivatatud ekstrakti hoiti kuni edasise kasutamiseni külmkapis. Täiendavad materjalid loetlevad asjakohased andmed CF-ekstrakti koostisosade nimetuse kohta.

Selles uuringus kasutati teist eelnevalt kirjeldatud eraldusprotsessi, et saada CF-st vee elueerimisfraktsioon, 20% etanooli elueerimisfraktsioon, 30% etanooli elueerimisfraktsioon ja 40% etanooli elueerimisfraktsioon [13]. 40-protsendiline etanoolifraktsioon eraldati Sephadex LH-20 ja silikageelikolonni abil ning puhastati poolpreparatiivse kõrgjõudlusega vedelikkromatograafiaga (HPLC), et lõpuks saada sellised ühendid nagu SDC-0-14,16, SDC{ {10}}, SDC-0-60(p-hüdroksübensüülalkohol).

Loomad ja manustamine

Selles uuringus kasutati Tianjini traditsioonilise hiina meditsiini ülikooli esimese sidushaigla (Tianjin, Hiina) kuuekuuseid isaseid SAMP8 ja vananemiskiirendatud hiireresistentseid 1 (SAMR1) hiiri. Loomi hoiti kontrollitud valguse (12-h valguse/pimeduse tsükkel), temperatuuri (23-25 kraadi C) ja niiskuse (45-55 protsenti) tingimustes ning neile manustati standardset dieeti ja vett. libitum. Kokku 48 SAMP8 hiirt jagati nelja katserühma (n=12/rühm): SAMP8 mudelhiired (M), väikese annusega CF-etanooli ekstraktiga töödeldud SAMP8 hiired (CF-L, 387,5 mg/kg, intragastraalselt), keskmise annusega CF-etanooliekstraktiga töödeldud SAMP8 hiired (CF-M, 775 mg/kg, intragastraalselt) ja suure annusega CF-etanooliekstraktiga töödeldud SAMP8 hiired (CF-H, 1550 mg/ kg, intragastraalselt). SAMRI kontrollrühma (Con, n{29}}) ja SAMP8 mudelrühmade (M) hiiri töödeldi füsioloogilise soolalahusega (0,9 protsenti). Kõiki hiiri raviti suu kaudu 1 kuu. Kõik loomkatsed kiitis heaks Henani Hiina meditsiini ülikooli eetikakomitee ja need viidi läbi vastavalt institutsionaalsetele juhistele (Henan, Hiina heakskiidunumber: HACTCM-2018009060-19). Katse ajal suri üks hiir mõlemas Con- ja M-rühmas ning kaks hiirt surid CF-H rühmas.

Näidiste kogumine

Katse lõpus paigutati hiired individuaalselt metaboolsetesse puuridesse 12- h uriinikogumiseks. Seejärel anesteseeriti hiired isofluraaniga ja vereproovid koguti retroorbitaalse verejooksu kaudu. Seejärel eemaldati iga hiire neerud kirurgiliselt ja hoiti analüüsideni 80 kraadi juures.

Rakukultuur ja in vitro uuring

NRK-52E-rakke, mis osteti Hiina Teaduste Akadeemia rakupangast (Shanghai, Hiina), kultiveeriti, et uurida CF ekstrakti mõju D-galaktoosi poolt põhjustatud rakkude vananemisele (D-gal, S11050, Yuanye, Shanghai, Hiina). NRK-52E rakke kasvatati inkubaatoris temperatuuril 37 °C ja 5 juuresolekul Dulbecco modifikatsioonis Eagle'i söötmes Dulbecco (DMEM, 12 100 046, Thermo Fisher, Massachusetts, USA), millele oli lisatud 10 protsenti veise loote seerumit. protsenti , CO.Rakke kasvatati 96-süvendiplaatidel või 6-süvendiplaatidel kuni 80-85 protsendilise konfluentsini ja seejärel töödeldi kasvusöötmega, mis sisaldas erinevaid ravimikombinatsioone: sööde pluss D-gal ( 20 mg/mL), sööde pluss D-gal pluss CF (10, 25,50, 100 ug/mL) või sööde pluss D-gal pluss monomeerne ühend (10 μM) vastavalt 48 tundi. Seejärel metüültiasolüültetrasoolium ( MTT) testi kasutati rakkude elujõulisuse tuvastamiseks ja -galaktosidaasi värvimist kasutati rakkude vananemise jälgimiseks.

Vananemisega seotud -galaktosidaasi värvimine

10-μm paksusteks osadeks viilutatud hiirte külmutatud neerud ja NRK-52E-rakud värviti vananemisega seotud galaktosidaasiga (SA- -gal, C0602, Beyotime Biotechnology, Shanghai, Hiina) järgides tootja protokolle.

Histoloogiline analüüs

Neerulõigud fikseeriti 4-protsendilise puhverdatud paraformaldehüüdiga ning 10-μm paksused parafiiniga kaetud lõigud värviti Massoni trikroomiga (G1006, Service, Wuhan, Hiina) ja vaadeldi mikroskoopiliselt. Massoni trikroomiga värvitud sektsioonide siniseid alasid mõõdeti kvantitatiivselt kuuest juhuslikult valitud väljast ja analüüsiti tarkvara Image-Pro Plus 6.0 abil.

Biokeemilised mõõtmised

Seerumi ja neeruhomogenaadi proovid sulatati toatemperatuurini ning superoksiidi dismutaasi (SOD, CSB-E08556m, Wuhan Huamei, Wuhan, Hiina), glutatioonperoksidaasi (GSH-Px, A005-1-2, Nanjing Jiancheng, Nanjing, Hiina), interleukiin-1 (IL-1, RK00006, ABklonaalne, Wuhan, Hiina), tuumori nekroosifaktor- (TNF-, RK00027, ABklonaalne, Wuhan, Hiina), uurea lämmastik (C{ {10}}, Nanjing Jiancheng, Nanjing, Hiina), kreatiniin (Cr, C011-2-1, Nanjing Jiancheng, Nanjing, Hiina) hiire seerumis, uriini üldvalk (C035-2-1, Nanjing Jiancheng, Nanjing , Hiina) hiire uriinis ja I tüüpi kollageeni (Col-I, MU30364, Bio-Swamp, Wuhan, Hiina), silelihaste aktiini (-SMA, MU30359, Bio-Swamp, Wuhan, Hiina), fibronektiini ekspressioonitasemed (FN, MU30179, Bio-Swamp, Wuhan, Hiina) mõõdeti hiire neerukudedes järjestikku vastavalt testikomplekti tootja protokollile.

Immunohistokeemiline analüüs

Immunohistokeemiline analüüs viidi läbi tavameetodil [17]. Kasutatud antikehad olid järgmised: Wnt4 (14371-1-AP, Proteintech, Chicago, USA), -kateniin (17565-1-AP,Proteintech, Chicago, USA), 1. tüüpi angiotensiin II retseptorid (AGTR1,{{ 7}}AP, Proteintech, Chicago, USA), p-tuumafaktori erütroid 2-seotud faktor 2 (p-Nrf2, ab76026, Abcam, Cambridge, UK), pc-Fos (ab27793, Abcam, Cambridge, UK ), sidekoe kasvufaktor (CTGF, GB11078, Service, Wuhan, Hiina). Sektsioone vaadeldi mikroskoobi all (Olympus, Tokyo, Jaapan).cistanche dosage redditMõõtke punakaspruuni avaldisega ala pindala ja integreeritud optiline tihedus (IOD), kasutades tarkvara Image-Pro Plus 6.0 ja arvutage välja keskmine optiline tihedus (MOD, MOD=IOD/pindala) -kvantitatiivne analüüs.

Western blot analüüs

Western blot test viidi läbi nagu on kirjeldatud eelmises uuringus [18]. Lühidalt, neerukuded homogeniseeriti lüüsipuhvris ja kvantifitseeriti, kasutades Bradford Protein Assay Kit (AR0197, Boster Biological Technology, Wuhan, Hiina). Seejärel allutati homogenaatidele naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geelelektroforees, kanti üle polüvinülideenfluoriidmembraanile ja blokeeriti blokeerimispuhvris (4% rasvavaba kuivpiim) 90 minutiks. Seejärel inkubeeriti neid primaarsete antikehadega (Wnt4; reniin; AGTR1; p-Nrf2; pc-Fos; Kelchi-sarnane ECH-ga seotud valk 1 (Keapl, GB11847, Service-bio, Wuhan, Hiina); -aktiiniga (AC026, Abclonal, Wuhan, Hiina) ja glütseraldehüüd-3-fosfaatdehüdrogenaas (GAPDH, AC033, Abclonal, Wuhan, Hiina)) üleöö temperatuuril 4 kraadi, millele järgneb inkubeerimine sobiva fluo-konjugeeritud sekundaarse antikehaga 1 tund toatemperatuuril. . Huvipakkuvaid valke skaneeriti Odyssey IR-skanneriga (LI-COR Biosciences, Nebraska, USA) ja signaali intensiivsused kvantifitseeriti Image Studio tarkvara abil. Valgu tase normaliseeriti -aktiini või GAPDH suhtes.

Neeruproovide UPLC-Q-TOF-MS analüüs

Neerukuded kaaluti ja homogeniseeriti jääkülmas füsioloogilises soolalahuses (mass/maht =1:1). Seejärel lisati 200 µl koehomogenaadi proovidele 1 ml atsetonitriili, seejärel ekstraheeriti ultraheliga 30 minutit. Ekstrakti tsentrifuugiti 12,000 g ja 4 kraadi juures 10 minutit. Supernatant viidi analüüsimiseks viaali. Kromatograafiline eraldamine viidi läbi üliefektiivse vedelikkromatograafia (UPLC) abil (Dionex UltiMate 3000 System, Thermo Scientific, Massachusetts, USA), kusjuures LC-süsteem sisaldas Acclaim RSLC 120 C18 kolonni (2,2 μm, 2,1 × 100 mm; Thermo Scientific).cistanche ekstrakti eelisedLiikuv faas koosnes lahustist A (atsetonitriil) ja veest koos {{0}},1 protsendi sipelghappega (B). Eraldamine viidi läbi gradientelueerimisega järgmiselt: 10-70 protsenti A alates 0 kuni 3 min, 70-78 protsenti A alates 4 kuni 13 minutit, 78-90 protsenti A alates 14 kuni 15 minutit, 90 protsenti -10 protsenti A 15–16 minutit ja 10 protsenti A 16–20 minutit. Uuritava proovi süstimismaht oli 2 μL. Massispektromeetria (MS) analüüs viidi läbi ESI allika abil järgmistel tingimustel: positiivses režiimis oli kapillaarpinge 3,5 kV ja negatiivses režiimis oli kapillaarpinge 3,2 kV. Nebulisaatori rõhk oli 2,0 baari, kuiva gaasi temperatuur 230 kraadi ja voolukiirus 8 l/min.

Statistiline analüüs

The acquired raw data from ultra-performance liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q/TOF-MS) analysis were first preprocessed using profile analysis(version 2.1, Bruker, Germany). The"bucket table" was obtained and imported into the SIMCA-P software(version13.0 Umetrics AB, Sweden)for principal component analysis (PCA). Other results were presented as mean±stand-ard deviation(SD). The data were processed using IBM SPSS Statistics 26.0. The normal distribution of the data used the Levene test, which required the average value, P>{{0}}.05; rühmadevaheliseks võrdlemiseks kasutati ühesuunalist dispersioonanalüüsi. AP väärtust alla 0,05 peeti statistiliselt oluliseks.

Tulemused

CF parandas SAMP8 hiirte neerude vananemist ja fibroosi

CF mõju uurimiseks SAMP8 hiirte neerudele mõõdeti SA- -gal aktiivsust neerudes. Joonisel la on SA- -gal aktiivsus neerukudedes M-rühmas märkimisväärselt suurenenud (sinine võimendus). CF-L ja CF-M manustamine inhibeeris oluliselt -galaktosidaasi aktiivsust SAMP8 hiirte neerudes, samas kui CF-H paranemine ei olnud märkimisväärne. Samuti oli mudelrühma neeruindeks oluliselt madalam kui kontrollrühmal (joonis 1b, P<0.05). after="" treatment="" with="" cf-m,="" the="" kidney="" index="" of="" samp8="" mice="" was=""><0.01). next,="" the="" results="" of="" masson's="" trichrome="" staining="" (fig.="" lc,=""><0.01)and the="" expression="" of="" fibrosis="" indicators="" col-i,="" α-sma,="" and="" fn="" revealed="" that="" m-group="" mice="" had="" more="" severe="" renal="" fibrosis="" than="" con-group="" mice,="" and="" cf-l="" and="" cf-m="" significantly="" attenuated="" renal="" fibrosis="" in="" samp8="" mice(fig.leg,=""><>

CF parandas SAMP8 hiirtel neerufunktsiooni, oksüdatiivset stressi ja põletiku taset

Lisaks testiti iga hiirte rühma neerufunktsiooni näitajaid, mis hõlmasid hiirte uriini mahtu 12 tunni jooksul, Cr ja uurea lämmastiku taset seerumis ning uriini valgu taset. Nagu on näidatud joonistel 2a-d, olid mudelrühma uriinivalgu, seerumi Cr ja seerumi uurea lämmastiku tasemed oluliselt kõrgemad kui kontrollrühmal (joonis 2a, P<0.01), while="" the="" urine="" volume="" of="" the="" model="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" of="" the="" control="" group(fig.2b-d,=""><0.01). cf="" supplementation="" down-regulated="" the="" levels="" of="" urine="" protein,="" serum="" cr="" and="" urea="" nitrogen="" in="" the="" model="" group(fig.2b-d,=""><0.05 or=""><0.01) while="" increasing="" the="" urine="" output="" of="" model="" mice.="" collectively,="" the="" results="" indicated="" that="" samp8="" mice="" had="" kidney="" damage="" associated="" with="" aging,="" and="" treatment="" with="" cf="" effectively="" ameliorated="" this="" injury.="">cistanche tšingis-khaanJärgmisena uuriti, kas CF moduleerib soodsalt oksüdatiivset stressi ja põletikku kiiresti vananevate hiirte neerudes. Nagu on näidatud joonisel 2e-h, olid SOD ja GSH-Pxin tasemed M-rühma neerudes oluliselt madalamad kui Con-rühma omad ja IL-i -1 tasemed olid oluliselt kõrgemad kui M-rühma neerudes. rühmitus Con. Pärast CF-ravi on ülaltoodud näitajad paranenud, eriti on parem CF-L ja CF-M parandav toime.

CF aktiveeris SAMP8 hiirte neerudes Nrf2 raja

P-Nrf2 ekspressioonitaset mõõdeti neerukudedes, et uurida, kas Nrf2 rada oli käesolevas uuringus seotud CF kaitsva toimega (joonised 3a-c). P-Nrf2 ekspressioonitase langes märkimisväärselt ainult SAMP8 rühmas (P<0.01, fig.="" 3c),="" and="" the="" downregulation="" was="" reversed="" to="" some="" extent="" by="" the="" treatment="" of="" cf="" crude="" extract.="" there="" was="" no="" significant="" change="" in="" the="" expression="" level="" of="" keapl="" among="" the="" groups(fig.="" 3b="" and="" d).="" further,="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" was="" detected="" and="" analyzed="" by="" immunohistochemical="" and="" western="" blot="" analyses.="" it="" was="" found="" that="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" mice="" in="" the="" m="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" con="" group;="" while="" cf="" treatment="" significantly="" reduced="" the="" expression="" levels="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" the="" mice="" (fig.3a-b="" and="">

CF nõrgestas Wnt / -catenin / RAS signaali aktiveerimist SAMP8 hiirte neerudes

Et täiendavalt uurida fibroosivastast toimet avaldavat CF potentsiaalset mehhanismi. Valgu lokaliseerimine viidi läbi immunohistokeemia abil. Nagu on näidatud joonisel 4a, ekspressioonitase Wnt4 ja

-kateniin indutseeriti peamiselt neerutorukeste rakkudes. Sarnaseid tulemusi täheldati ka AGTR1, Wnt signaalimise allavoolu raja sihtmärkide hindamisel (joonis 4a). Pärast seda kvantifitseeriti valgu ekspressioonitase ja tulemused näitasid, et Wnt4, -kateniini, reniini ja AGTR1 valgud kogunesid mudelrühma hiirte neerukoesse, samas kui CF inhibeeris neid muutusi oluliselt (joonis 4b-f). ). Lisaks määrati kindlaks ja kvantitatiivselt analüüsiti ka CTGF ekspressioonitase. Kooskõlas ülalmainitud tulemustega ekspresseeriti CTGF peamiselt neerutuubulites ja CF inhibeeris märkimisväärselt CTGF aktiivsust (joonis 4d g).

CF ja selle ühendid pärssisid D-gal indutseeritud NRK{0}}E rakkude vananemist

D-gal-indutseeritud NRK-52E-rakke kasutati teatud CF-i toimeainete skriinimiseks, et määrata materiaalne alus seniilsete neerude raviks CF-i ekstraktiga. Tulemused näitasid, et CF suurendas rakkude elujõulisust annusest ja ühenditest sõltuval viisil

CF-st eraldatud SDC-0-14,16 ja SDC-1-8 mõjusid rakkude proliferatsioonile paremini. Lisaks näitasid 25 ug/ml CF ja ühendid SDC-0-14,16 ja SDC-1-8 -galaktosidaasi aktiivsust pärssivat toimet (joonis 5).

CF parandas neerukoe PCA analüüsi SAMP8 hiirtel CF mõju uurimiseks SAMP8 hiirtel viidi läbi põhikomponentide analüüs (PCA). Nagu on näidatud joonisel 6a, oli kontroll- ja mudelrühmade vahel ilmne rühmitus (R2X=0.542; Q2=0.38), mis viitab sellele, et SAMP8 hiirte endogeensed metaboliidid erinevad SAMR1 omast. hiired, mis põhjustab nende kõrvalekaldumise SAMR1 rühmast. Nagu on näidatud joonisel 6b, koondusid erinevad CF-rühmad kontroll- ja mudelrühmadest erinevatesse klassidesse ning CF-rühmad liikusid kontrollrühmale lähemale, mis näitab, et

CF-ga sekkutud SAMP8 hiirte endogeensed metaboliidid olid sarnased SAMR1 hiirte omadega.

Arutelu

Vananemine mängib kroonilise neeruhaiguse progresseerumisel olulist rolli [19]. CKD fibroosi progresseerumisel ekspresseerivad ja sekreteerivad vananevad rakud profibrootilisi tegureid (TGF-, CTGF jne) ja põletikueelseid tegureid (IL-1, IL-6, TNF- jne. ), mis on vananemisega seotud sekretoorsed fenotüübifaktorid, kiirendades seeläbi neerufibroosi [20, 21]. Praegu on traditsiooniline hiina meditsiin saavutanud häid tulemusi neerufibroosi ravis vähemate kõrvalmõjudega [22]. Selles uuringus uuriti CF ekstrakti sekkuvat mõju neerufibroosile SAMP8 hiirtel. Selle uuringu jaoks valitud hiiretüvi oli SAMP8, mis töötati välja AKR / hiirte eluea, vananemise ja patoloogilise fenotüübi skooride põhjal ning oli ainult geneetilise päritoluga kiirendatud vananemismudel [23, 24]. Uuringud on näidanud, et SAMP8 hiirte (9 kuud) neerupatoloogia muutused hõlmavad tubulointerstitsiaalset fibroosi ja fokaalset segmentaalset glomeruloskleroosi [25]. Ja leiti, et SAMP8 hiirte neerufibroos oli vanusega seotud [6]. Seetõttu testisime -galaktosidaasi aktiivsust ja

neerufibroosi taset SAMP8 hiirtel ja leidis, et CF-L ja CF-M parandasid neerufibroosi ja -galaktosidaasi aktiivsust SAMP8 hiirtel (joonis 1). Ja testisime ka hiirte uriinieritust. Kooskõlas varem avaldatud uuringutega, mis näitavad, et kahe erineva protsessiga saadud CF-l oli diureetiline toime [13], suurendas ekstrakt märkimisväärselt SAMP8 hiirte uriini mahtu. Samuti näitas käesolev uuring, et CF-i lisamine parandas SAMP8 hiirte neerufunktsiooni, antioksüdantsete ensüümide aktiivsust ja põletikuliste tegurite taset (joonis 2).

Süsteem Keap{0}}Nrf2 pälvis viimastel aastatel paljude teadlaste tähelepanu oma antioksüdantsete ja põletikuvastaste omaduste tõttu. Selle farmakoloogilist potentsiaali neeruhaiguste ravis on põhjalikult uuritud mittekliinilistes ja kliinilistes uuringutes [26]. Nrf2 on redoksseisundi ja antioksüdantse toimega seotud geenide peamine transkriptsiooniregulaator [27]. Uuringud on näidanud, et Nrf2 aktiveerimiseks ja sihtgeeni induktsiooniks on vajalik fosforüülimine [28]. Nrf2 aktiveerimine parandas CKD progresseerumist, hoides ära oksüdatiivse stressi ja säilitades raku redoks-homöostaasi [29]. Peamise transkriptsioonifaktorina mängib Nrf2 olulist rolli kaitses oksüdatiivse stressi vastu, reguleerides selle allavoolu antioksüdante ja detoksikatsiooniensüüme [30]. Kim et al. teatas, et resveratrool kui tugev Nrf2 aktivaator leevendas vananemisega seotud progresseeruvat neerukahjustust [31]. Käesolevas uuringus parandas CF SAMP8 hiirte neerudes Nrf2 nõrgenemist, ilma et see mõjutaks Keapli ekspressioonitaset, mis viitab sellele, et CF toorekstrakt võib Nrf2 raja aktiveerimise kaudu parandada neerude oksüdatiivseid kahjustusi (joonis 3).

Neerufibroosi iseloomustab liigne ekstratsellulaarse maatriksi (ECM) ladestumine, mis põhjustab armide moodustumist neeru parenhüümis [32]. Arvatakse, et transformeeruv kasvufaktor (TGF-) on fibroblastide üleaktiveerimise võtmetsütokiin [33, 34]. Loomulikult ei piisa neerufibroosi vähendamiseks ainult TGF-i signaaliraja sihtimisest. Mõned uuringud näitasid, et CTGF, Wnt/-kateniin, reniin-angiotensiini süsteem, oksüdatiivne stress ja nii edasi olid seotud neerufibroosiga [35-37]. Wnt/-kateniin on evolutsiooniliselt konserveerunud signaalirada, mis on seotud kudede homöostaasi reguleerimise, elundite arengu ja vigastuste parandamisega[38]. Cisternas et al. arutas Wnt-i signaalimise pro-fibrootilist toimet nii skeletilihastes kui ka neerudes [39]. Üha enam on tõestatud, et Wnt/-kateniini signaalirada mängib vigastusjärgsete neerufibrootiliste kahjustuste tekke ja progresseerumise reguleerimisel otsustavat rolli [40-42]. Wnt/-kateniini signaal on tervete täiskasvanute neerudes suhteliselt vaikne ja aktiveerub siis, kui neerud saavad erinevat tüüpi kahjustusi [43].

Imetajatel on Wnt perekonnal vähemalt 19 pereliiget, kes on neerude arengu jaoks olulised. Ja vähemalt 15 neist pereliikmetest on vananevas neerus erinevalt ülesreguleeritud, sealhulgas Wnt4 [6]. Käesoleva uuringu tulemused näitasid, et Wnt4 valgu ekspressioonitase SAMP8 hiirte neerudes oli oluliselt kõrgem kui SAMR1 hiirtel, mida kinnitati nii Western blot kui ka immunohistokeemiliste analüüsidega (joonised 4a, d ja f). Juhuslikult reguleeriti üles ka -kateniini valgu ekspressioonitase. Samuti ekspresseeriti nii Wnt4 kui ka -kateniin neerutuubulite epiteelirakkudes, nagu näitas immunohistokeemiline analüüs (joonised 4a ja f). Wnt/-kateniin kutsus esile neerufibroosi, indutseerides mitmeid fibrogeenseid geene, nagu RAS-i komponendid, maatriksi metalloproteinaas-7 (MMP-7), plasminogeeni aktivaatori inhibiitor 1 (PAI-1) ja tigu [37 ]. Zhou et al. kirjeldas Wnt/-kateniini kui peamist ülesvoolu regulaatorit, mis kontrollib kõigi testitud RAS-i komponentide ekspressiooni neerudes [44]. Zhou jt kasutasid 5/6 nefrektoomia (5/6 NX) rotimudelit, et näidata RAS-i peamiste komponentide ekspressioonitasemeid ajus ja neerudes, nagu angiotensinogeen, angiotensiini konverteeriv ensüüm ja angiotensiin II AT{25 }}retseptor oli oluliselt ülesreguleeritud. Ülesreguleeritud ekspressioonitaset inhibeeris Wnt keskne blokaator, mis oli adeno-seotud viirusvektor, mis üleekspresseeris DKK1 geeni [45]. Samamoodi leiti käesolevas uuringus, et AGTR1 ekspresseeriti endiselt neerutorukeste epiteelis ning reniini ja AGTRl ekspressioonitasemed SAMP8 hiirte neerukudedes olid oluliselt kõrgemad kui SAMR1 hiirtel (joonised 4a ja dg). Need tulemused näitasid, et SAMP8 hiirte neerudes aktiveeriti Wnt / -catenin / RAS signaalirada ja CF inhibeeris tõhusalt selle raja aktiveerimist.

CTGF-il on mitmeid bioloogilisi funktsioone, sealhulgas kemotaktiliste rakkude mitoosi soodustamine, adhesiooni esilekutsumine ning rakkude proliferatsiooni ja ECM-i sünteesi soodustamine [35,46]. CCN2 (CTGF) moduleeris Wnt signaaliülekannet, seondudes madala tihedusega lipoproteiini retseptoriga seotud valguga 5/6 (LRP5/6), et vahendada fibroosi [39, 47]. Teised uuringud kasutasid geenide vaigistamist, et avastada ja kinnitada, et Nrf2 reguleeris Wnt rada, reguleerides CTGF ekspressioonitaset, mõjutades neerude interstitsiaalset haigust. Samuti reguleeris Nrf2 CTGF transkriptsiooni taset peamiselt CTGF transkriptsiooniregulaatori c-Fos kaudu [48]. Immunohistokeemiline analüüs näitas, et CTGF ja pc-Fos ekspresseerusid peamiselt neerutuubulite epiteelirakkudes ning pc-Fos jaotus ka glomerulites. Kvantitatiivne analüüs näitas, et CF inhibeeris mõlema valgu ekspressioonitasemeid (joonised 3b ja e ning 4a ja c). Lõpuks kasutati PCA analüüsi, et täiendavalt kontrollida, kas CF parandas SAMP8 hiirte neerukahjustusi (joonis 6). Käesolev uuring andis tõendeid selle kohta, et CF mitte ainult ei aktiveerinud Nrf2 signaaliülekannet, vaid tugines ka Nrf2-le, et tasakaalustada oksüdatiivset stressi ja põletikku, inhibeeris Wnt / -catenin / RAS signaaliülekannet ning parandas neerude vananemist ja neerude fibrogeneesi. Siiski leidsime selles katses ka ebajärjekindlat paranemist CF mõjus Massoni ja SA{27}}gal värvimisele. Spekuleeritakse, et see võib olla tingitud neerude vananemise ja neerufibroosi ebajärjekindlast progresseerumisest SAMP8 hiirtel. Selle katse hiirte neerude vananemise määr võib olla tõsisem kui fibroos. Seetõttu ei olnud CF-H parandav toime neerude vananemisele SAMP8 hiirtel nii ilmne kui neerufibroosi oma.

Redutseeriva monosahhariidina kasutatakse D-galaktoosi laialdaselt mitmesuguste vanusega seotud haiguste korral in vivo ja in vitro. Leiti, et D-gal põhjustab NRK-52E-rakkudes [49] vananemist ja vigastusi, indutseerib inimese neeru proksimaalsete tubulaarsete epiteelirakkude (HKC-8) vananemist ja suurendab kahe neeru ekspressioonitaset. fibroosimarkervalgud FN ja a-SMA [6]. Selles uuringus kasutati D-gal NRK-52E rakkude indutseerimiseks in vitro. Kasutades MTT testi ja -galaktosidaasi värvimist CF-st eraldatud ühendite tuvastamiseks, leiti, et SDC-0-14,16 ja SDC-1-8 suurendasid D-gal-i poolt indutseeritud rakkude elujõulisust ja inhibeerisid D-gal-indutseeritud rakkude elujõulisust. raku vananemine (joonis 5). Need viitasid sellele, et SDC-0-14,16 ja SDC-1-8 võivad olla CF-i materiaalseks aluseks, et aeglustada neerude vananemist. SDC-1-8 on üks fenüületanoidglükosiididest. Leiti, et fenüületanoidglükosiidid pikendavad Caenorhabditis Elegansi [50] eluiga, avaldades vananemisvastast, [51] ja neuroprotektiivset toimet [52-54]. Need annavad suuna meie CF farmakoloogiliste mõjude järeluuringule.

Järeldused

Kokkuvõtteks näitasid in vivo uuringud, et CF vähendas eakatel hiirtel neerufibroosi. Mõned potentsiaalsed toimeained leiti in vitro katsetes. Need leiud andsid farmakoloogilist tuge neeruhaiguste raviks CF-i abil ja suunasid CF toimeainete edasiseks uurimiseks.

See artikkel on välja võetud Cao et al. BMC täiendav meditsiin ja ravi (2022) 22:52