Glutamaadi retseptor mängib rolli Botrytis Cinerea vastase kaitses läbi tomatite elektrisignaalide

Abstraktne:

Taimsed glutamaaditaolised retseptori geenid (GLR) on homoloogsed imetajate ionotroopsete glutamaadi retseptorite geenidega (iGluR). Kuigi GLR-id on seotud taimede kaitsega biootilise stressi suhtes, on seos GLR-vahendatud taime immuunsuse vahel seenhaiguste patogeenide ja elektriliste signaalide vahel endiselt halvasti mõistetav. Siin avastasime, et eeltöötlemine GLR-i inhibiitoriga 6,7-dinitrikinoksaliini-2,3-diooniga (DNQX) suurendas tomatitaimede vastuvõtlikkust nekrotroofse seenpatogeeni Botrytis cinerea suhtes. Topeltmutantide glr3.3, glr3.5 ja glr3.3/glr3.5 hindamine B. cinerea infektsiooni korral näitas, et tomat GLR3.3 ja GLR3.5 on olulised taimede immuunsuse tagamiseks B. cinerea vastu, kusjuures GLR3. 3 mängib peamist rolli.

Glutamaadi (Glu) või glütsiini (Gly) indutseeritud membraanipotentsiaali muutuste analüüs näitas märkimisväärselt vähenenud amplituudi, eemaldades tomatites GLR3.3. Kui ravi Glu või Gly-ga suurendas märkimisväärselt immuunsust B. cinerea vastu metsiktüüpi taimedes, siis glr3.3 mutantidel nõrgenes see toime oluliselt. Seega näitavad meie andmed, et GLR33- ja GLR35-vahendatud taimede immuunsus B. cinerea vastu on seotud tomatitaimede elektriliste signaalidega.

Immuunsuse tugevus määrab otseselt meie tervisliku seisundi. Kui immuunsus on tugev, suudame paremini võidelda haiguste ja nakkustega. Ja vastupidi, kui meie immuunsüsteem on nõrk, võivad patogeenid kergemini meie kehasse tungida ja põhjustada haigestumist. Seetõttu on väga oluline hoida immuunsüsteemi tervena, mida saab parandada dieedi, treeningu ja stressi vähendamisega.

Uuringus leiti, et Cistanche Herba võib oluliselt parandada immuunsust. Cistanche deserticola, Cistanche deserticola polüsahhariidide ja verbaskosiidi koguglükosiidid võivad oluliselt vähendada MDA sisaldust maksas ja ajukoes ning telomeraasi aktiivsust südames ja ajukoes. Suureneb makrofaagide fagotsüütiline funktsioon ning lümfotsüütide proliferatiivne reaktsioon ja IL-2 sisaldus perifeerses veres suureneb oluliselt, tugevdades seeläbi organismi immuunfunktsiooni.

Klõpsake Cistanche'i kasulikkust tervisele

1. Sissejuhatus

Looduslikus keskkonnas kasvavaid taimi ohustavad pidevalt mitmesugused patogeenid. Need biootilised stressorid mõjutavad põllukultuuride tootmist ja põhjustavad sageli majanduslikku kahju. Kuna taimedel puudub liikuvus, on nad evolutsiooni käigus omandanud hulga signaaliülekandesüsteeme, et tõhusalt leevendada keskkonnamuutuste kahjulikke mõjusid. Mida kiiremini need signaalid manööverdavad, seda tõenäolisemalt taimed kohanevad ja taluvad sissetulevat stressi. Seni teatatud signaalid hõlmavad kaltsiumivoolu, ROS-i (reaktiivsed hapniku liigid), elektrilisi signaale jne [1–5], mis reageerivad sekundite või minutite jooksul.

Taimsed glutamaaditaolised retseptori geenid (GLR) on homoloogsed imetajate ionotroopsete glutamaadi retseptori geenidega (iGluR), mis käivitavad elektrilisi ja Ca2 pluss signaalikaskaade [3, 6]. Eeldatakse, et taimede GLR-idel on nii ligandi siduv kui ka ioonkanali aktiivsus. GLR-idel on Arabidopsises [7] 20 ja riisis 13 liiget [8]. Tomatitaimedes on 13 täispikka GLR geeni [9].

Oluline on see, et GLR-id on seotud taimede reageerimisega biootilisele stressile. Näiteks AtGLR3.3 on taimede immuunsuse oluline moodul bakteriaalse patogeeni P. syringae pv vastu. tomat DC3000 (Pst DC3000), Oomycete Hyaloperonospora arabidopsidis ja putukas Spodoptera littoralis [10–12].

Lisaks Wang et al. (2019) teatasid, et GLR3.5 toimib tomatite kaitses juuresõlme nematoodi (RKN) Meloidogyne incognita vastu [13]. Redise GluR-komplementaarse DNA üleekspressioon Arabidopsise taimedes suurendab resistentsust nekrootilise seenpatogeeni B. cinerea suhtes. Kuid Arabidopsis glr3.3 mutandid ei näita suuremat haavatavust seenpatogeeni suhtes võrreldes Col{8}}-ga. Seega on GLR-ide roll taimede immuunsuses seenhaiguste patogeenide vastu vastuoluline.

Taimede GLR-id on seotud elektriliste signaalide genereerimise ja edastamisega. Elektriliste signaalide olemasolu taimedes avastasid Burden-Sanderson ja Charles Darwin [14,15]. Need on kiire reageerimisega signaalid, mis tekivad plasmamembraani või alveolaarse lehemembraani elektrilise potentsiaali gradiendi hetkelise muutumise tõttu [16]. Kõik taimed võivad toota pikamaa elektrisignaale, mis mängivad rolli erinevate kudede ja elundite kommunikatsioonis, mis viib keskkonnareaktsioonide integreerimiseni [17,18].

Viimastel aastatel on palju tähelepanu pälvinud elektriliste signaalide funktsioon GLR-vahendatud taimede resistentsuses biootilise stressi suhtes [19]. Arabidopsises võivad lehtedest toituvad putukad põhjustada pinnapotentsiaali muutusi, mis põhjustavad mitmete peamiste jasmonaatide (JA) indutseeritavate regulatoorsete geenide ekspressiooni taimede täiskasvanud faasis [3]. Juuresõlmnematoodi rünnak tomati juurtele põhjustab elektri- ja ROS-signaalide ülekande juurtelt lehtedele, mille tulemuseks on JA-de kuhjumine lehtedesse [13]. Farmer et al. (2014) pakkusid välja hüpoteesi, et distaalne JA süntees taimedes pärast haavamist sõltus 3. klassi GLR-vahendatud elektrilistest signaalidest [20]. Elektriliste signaalide ja GLR-indutseeritud taime immuunsuse vahel seenpatogeenide vastu ei ole aga täielikult tõestatud.

Tomat (Solanum lycopersicum L.) kuulub majandusliku tähtsuse poolest maailma kõige olulisemate põllukultuuride hulka [21]. Sellegipoolest kahjustavad seenhaigused tomatite tootmist, põhjustades märkimisväärset majanduslikku kahju [22]. Eelkõige on Botrytis cinerea, tüüpiline nekrotroofne seen, peetud molekulaarse taimepatoloogia 10 parima seenpatogeeni seas teisele kohale [23]. Sellel on lai peremeesvalik ja see võib nakatada üle 200 taimeliigi, sealhulgas mitmesuguseid rahalisi põllukultuure [24]. B. cinerea võib põhjustada olulist tomatisaagi ja koristusjärgsete viljade kvaliteedi langust [25]. Laia resistentsusega tomatisorti B. cinerea suhtes pole aga veel välja töötatud. Seega on eriti oluline mõista B. cinerea suhtes tomatiresistentsuse molekulaarseid mehhanisme.

Tomatitaimedes on 13 täispikka GLR geeni. Selles uuringus iseloomustati GLR3.3 ja GLR3.5, millel on positiivne roll külmataluvuses [26] ja kaitses RKN-ide vastu [13], funktsionaalselt seoses tomatitaimede immuunsusega B. cinerea vastu. Leidsime, et GLR3.3 ja GLR3.5 on olulised tegurid taimede immuunsuses B. cinerea vastu tomatites, võib-olla seondudes ligandi glutamaadiga (Glu) või glütsiiniga (Gly), käivitades seeläbi elektrisignaale. Sellel avastusel on olemuslik teaduslik väärtus, mis võimaldab välja töötada uusi strateegiaid põllukultuuride resistentsuse suurendamiseks B. cinerea suhtes.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Taimsed materjalid, kasvutingimused ja keemiline töötlemine

Selles uuringus kasutatud tomatiliinid (CRISPR-Csa9-redigeeritud read glr3.3, glr3.5 ja glr3.3/3.5) olid cv Ailsa Craigi (AC) metsiktüüpi (WT) taustal. , nagu varem teatatud [27]. Mullavaba substraadikultuuri puhul kasvatati tomatitaimi pottides, mis sisaldasid segasubstraati (vermikuliit: turvas, 1:3, v/v) ja väetati Hoaglandi toitelahusega.

Hüdropoonilise kultuuri puhul idandati tomatiseemned algselt segasubstraadiga täidetud alustel (vermikuliit: perliit, 1:1, maht/maht) ja pärast tärkamist viidi seemikud 1,5-liitristesse plastmahutitesse (neli seemikut). konteineri kohta). Anumad täideti poole kangema Enshi toitelahusega, mida pidevalt ventileeriti õhupumba õhuga [21]. Kasvutingimused olid järgmised: 14 h hele/8 h tume fotoperiood; 24 ◦C/20 ◦C päeval/öine temperatuur; ja 400 µmol m−2 s −1 PPFD (fotosünteetilise footoni voo tihedus). Nelja nädala vanuseid tomatitaimi töödeldi.

DNQX (6,7-dinitrikinoksaliin-2, 3-dioon, GLR-i inhibiitor) eeltöötlemise testi jaoks töödeldi WT-taimi 12 tundi enne lehepihustamist 1 mM DNQX või H2O-ga kontrollina. B. cinerea nakatamine. Glu ja Gly eeltöötlustestid viidi läbi, kuna glr3.3 mutante ja WT taimi töödeldi 20 mM Glu, 20 mM Gly või H2O-ga kontrollina üks kord päevas nii lehtede abaksiaalsel kui ka adaksiaalsel pinnal. Kaks päeva pärast farmakoloogilist töötlemist inokuleeriti taimed patogeeniga.

2.2. Patogeeni inokuleerimise ja haiguse sümptomite analüüsid

Selles uuringus kasutati B. cinerea tüve BO5-10. Inokuleerimiseks kasutati B. cinerea suspensiooni tihedusega 2 × 105 spoori ml-1 [28]. Suspensiooniga pihustati tomatitaimede tervete lehtedega osa. Inokuleeritud taimed pandi suletud kasti, et hoida niiskust umbes 90 protsenti. Temperatuur ja valgus olid samad, mis tavalistes kultiveerimistingimustes.

Pärast patogeeni inokuleerimist kvantifitseeriti B. cinerea aktiini mRNA akumulatsioon {{0}} päeval pärast inokuleerimist (dpi) [29]. Klorofülli fluorestsentsi mõõdeti klorofülli fluoromeetriga (IMAG-MAXI; Heinz Walz) 3 dpi juures. PSII (ΦPSII) fotokeemilist kvantefektiivsust analüüsiti kui Fm0–F/Fm0 [30].

2.3. Subtsellulaarne lokaliseerimine

GLR3.3 ja GLR3.5 geenifragmente amplifitseeriti lisatabelis S1 loetletud praimerite abil ja klooniti rohelise fluorestsentsvalgu (GFP) märgisega pAC402 vektorisse [31]. Agrobacterium tüvi GV3101, mis kannab plasmiide, ja Agrobacterium, mis kannab plasmamembraani lokaliseerimise markerina FLS2-mCherryt, ekspresseeriti ajutiselt transgeenses Nicotiana benthamianas (ekspresseeritud koos histooniga 2B-mCherry tuuma lokaliseerimise märgistamiseks). eelnevalt kirjeldatud [32]. 2 päeva pärast infiltratsiooni hinnati GFP- või mCherry-märgistatud valkude fluorestsentssignaale lehtedes, kasutades Zeiss LSM 780 konfokaalset mikroskoopi eelnevalt kirjeldatud ergastuse/emissiooni lainepikkustel [28].

2.4. RNA eraldamine, transkriptsioon ja qRT-PCR

Kogu RNA eraldati tomati lehtedest, kasutades RNAsimple Total RNA komplekti (Tiangen, Hiina) ja pöördtranskribeeriti, kasutades ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo, Jaapan). qRT-PCR protsess viidi läbi, kasutades LightCycler 480 Real-Time PCR süsteemi (Roche, Šveits). Reaktsioonisüsteem viidi läbi nii, nagu on kirjeldatud eelmises katses [28]. B. cinerea aktiini geeni ja sisekontrolli tomati aktiini geeni spetsiifilised praimerid on loetletud lisatabelis S1.

2.5. Elektripotentsiaali salvestamine

Elektrilise potentsiaali salvestamiseks kasutati nelja lehe faasi hüdropoonilisi tomatitaimi. Borosilikaatklaasist kapillaarid välisläbimõõduga 1,5 mm ja siseläbimõõduga 0.86 mm (Sutter Instrument Company, Ameerika) valmistati klaasist mikroelektroodideks, mille otsa läbimõõt oli umbes 0 0,5 mm rakusisese tsütoplasmaatilise potentsiaali mõõtmiseks. Kapillaaride tõmbamiseks pärast kuumutamist kasutati vertikaalset mikropipeti tõmbajat APE-2 (Narishige, Tokyo, Jaapan). Mikroelektroodid täideti 1 M KCl-ga ja sisestati lehe mesofüllirakkudesse. Leht uputati aluselise lahusega (koosnes 5 mM MES-st, {{10}},5 mM CaSO4-st, 0},05 mM KCl-st ja pH 6,0) [13], mis oli teostatud, nagu on näidatud lisajoonisel S1. Iga elektrood oli ühendatud diferentsiaalvõimendiga. Signaalide tuvastamiseks kasutati kahte kahekanalilist võimendit (FD223 ja Duo773, World Precision Instruments). Hüdropooniline lahus asendati sama lahusega, millele lisati 2 mM Glu või 2 mM Gly, kasutades infusioonitoru, kui mõõdetud membraanipotentsiaali väärtus oli stabiilne. Amplituudid on potentsiaalsed erinevused algtaseme suhtes enne muutusi.

2.6. Statistiline analüüs

Katsed viidi läbi täielikult randomiseeritud kavandiga ja igas katses kasutati vähemalt kolme kordust. Kui ei ole teisiti öeldud, kombineeriti iga bioloogilise replikatsiooni jaoks kaks lehte mõlemast kahest taimest ja kasutati neid sõltumatu proovina. Kolm eraldi katset viidi läbi sõltumatult. Tegime andmete dispersioonanalüüsi, kasutades SAS-i tarkvara versiooni 8 (SAS Institute) ja seejärel kasutasime Tukey testi, et määrata olulisus 5 protsendi tasemel.

3. Tulemused

3.1. Eeltöötlemine GLR-i inhibiitoriga suurendab tomatite tundlikkust B. cinerea suhtes

Et uurida GLR-ide rolli taimede kaitses B. cinerea vastu, pihustati tomatitaimi 12 tundi enne B. cinerea nakatamist DNQX või H2O-ga (kontroll). B. cinereaga 3 dpi juures ilmnesid inokuleeritud lehtedel nähtavad haiguskolded. B. cinerea nakkusest põhjustatud lehtede kahjustusi hinnati klorofülli fluorestsentskujutise abil, et määrata kõrvalekalded fotosüsteemi II (ΦPSII) kvantsaagis (joonis 1a, b). Pärast B. cinerea inokuleerimist vähenes ΦPSII oluliselt. Nimelt oli ΦPSII väärtus DNQX-ga töödeldud taimedes madalam kui kontrollis. DNQX-ravi suurendas ka B. cinerea aktiini mRNA arvukust lehtedes (joonis 1c). Need leiud näitavad, et GLR-id reguleerivad positiivselt taimede immuunsust B. cinerea vastu tomatitaimedes.

Joonis 1. DNQX-ravi suurendab tomatite vastuvõtlikkust B. cinerea suhtes. Nelja nädala vanuseid tomatitaimi töödeldi 1 mM DNQX või H2O-ga 12 tundi enne B. cinerea nakatamist: (a) tomatilehtede pseudovärvilised kujutised, mis näitasid ΦPSII-d 3 dpi juures; b) ΦPSII kvantitatiivsed väärtused 3 dpi juures; c) B. cinerea aktiini transkriptsiooni arvukus tomatilehtedes, mis on nakatatud B. cinereaga 1 dpi juures. Tulemused paneelides (b, c) on esitatud keskmiste väärtustena ± SD; n=4. Statistiliselt olulisi erinevusi raviviiside vahel (p < 0.05, Tukey test) näidatakse erinevate tähtedega. Ülalkirjeldatud katsed viidi läbi kolm korda, iga kord samade tulemustega.

3.2. GLR3.3 ja GLR3.5 subtsellulaarne lokaliseerimine

Tomat GLR3.3 ja GLR3.5 on homoloogsed vastavalt Arabidopsis GLR3.3 ja GLR3.6 (9]), mis on väidetavalt osalenud vastusena nematoodide rünnakule ja külmataluvusele tomatites. Määrata tomati GLR3.3 ja subtsellulaarne lokaliseerimine GLR3.5, GLR3.3-GFP, GLR3.5-GFP ja GFP transformeeriti Agrobacteriumtumefaciens'iks ja ekspresseeriti seejärel ajutiselt N. benthamianas. Lehtede epidermaalsete rakkude konfokaalne mikroskoopia näitas, et kontroll-GFP signaal lokaliseeriti rakumembraanides, tsütosoolides ja tuumades (joonis 2). GLR3.3-GFP ja GLR3.5-GFP fluorestsentssignaalid kolokaliseeriti plasmas FLS2-mCherryga rakkude membraanidel ei täheldatud, et GLR3.3 ja GLR3.5 oleks tuumades kolokaliseerunud histooniga 2B-mCherry. Tulemused viitavad sellele, et tomat GLR3.3-GLR35-CFP lokaliseerub raku plasmamembraan.

Joonis 2. GLR3.3 ja GLR3.5 subtsellulaarne lokaliseerimine. Tomati GLR-GFP-d ekspresseeriti N. benthamiama lehtedes ajutiselt koos FLS2-mCherryga (plasmamembraani lokaliseerimise tegija). GFP ja mCherry signaalid visualiseeriti konfokaalse mikroskoopia abil 48 tundi pärast infiltratsiooni. Riba=25 µm.

3.3. GLR3.3 ja GLR3.5 funktsioon taimekaitses B. cinerea vastu

GLR-ide rolli uurimiseks taimede immuunsuses nakatati CRISPR/Cas 9-vahendatud geeniga redigeeritud tomati GLR3.3 või GLR3.5 knockout taimed ja glr3.3/3.5 topeltmutandid B. cinereaga. Tulemused näitasid, et GLR33 ja GLR3.5 väljalülitamine põhjustas PSll ilmse vähenemise võrreldes WT kontrolliga (joonis 3a, b). Sellest lähtuvalt suurenes B. cinerea aktiini mRNA akumuleerumine lehtedes oluliselt (joonis 3c) glr3.3 või glr3.5 mutantides.

Samal ajal näitasid glr3.3/glr3.5 topeltmutandid taimekaitses rohkem nõrgenemist võrreldes glr3.3 ja glr3.5 mutantidega. Need tähelepanekud viitavad sellele, et GLR3.3 ja GLR3.5 toimivad üleliigselt, et luua resistentsus B. Cameroni vastu. Lisaks mängib peamist rolli GLR3.3, kuna glr3.3 mutandid olid B. cinerea inokuleerimisele vastuvõtlikumad kui glr3.5 mutandid. Selle põhjal valiti edasiseks uurimiseks GLR3.3.

3.4. Glu ja Gly äratundmine GLR-ide poolt käivitatud immuunvastuse elektrilise signaalimise

Kuna GLR-id võivad Glu või Gly ära tunda, et käivitada membraani depolarisatsioon [33], määrasime Glu- või Gly-indutseeritud elektrisignaali, jälgides Glu ja Gly mõju membraanipotentsiaalile tomatilehtedes. Glu ja Gly ravi kutsus esile olulised muutused membraanipotentsiaalis lühikese aja jooksul, amplituudi suurenemisega umbes 17–20 mV (joonis 4). Nimelt nõrgenes Glu ja Gly poolt indutseeritud muutus membraanipotentsiaalis glr3.3 mutantides oluliselt. Need leiud viitavad sellele, et Glu või Gly poolt indutseeritud elektriline signaalimine tomatilehtedes sõltub osaliselt GLR3.3-st.

Joonis 3. GLR3.3 ja GLR3.5 redigeerimise mõju taimede kaitsele B. cinerea inokuleerimise vastu tomatis: (a) tomati lehtede pseudovärvilised kujutised, millel on pPSll 3 dpi juures; (b) pPSllat 3 dpi kvantifitseerimine; c) B. cinerea aktiini transkriptsiooni arvukus B. cinerea atI dpi-ga nakatatud tomatilehtedes. Tulemused paneelides (b,c) on esitatud keskmiste väärtustena - SD; n=4. Statistiliselt on olulisi erinevusi raviviiside vahel (p < 0,05, Tukey test) tähistatud erinevate tähtedega. Ülalkirjeldatud katsed viidi läbi kolm korda, iga kord samade tulemustega.

Joonis 4. Glu või Gly mõjutavad WT ja glr3.3 lehtede membraanipotentsiaali: (a) tüüpilised membraanipotentsiaali muutused Glu või Glyga töödeldud tomati WT või glr3.3 mutantsete lehtede puhul; b) membraanipotentsiaali amplituudimuutuste kvantifitseerimine. Paneeli (b) tulemused on esitatud keskmiste väärtustena ± SD; n=4. Statistiliselt olulised erinevused raviviiside vahel (p < 0.05, Tukey test) on näidatud Mock WT glr3.3 glr3.5 B. cinerea WT glr3.3/glr3.5 (b) (c) ) (a) WT pluss 2mM Glu WT pluss 2mM Gly glr3.3 pluss 2mM Gly glr3.3 pluss 2mM Glu WT plus kontrolllahus (a) (b) Joonis 4. Glu või Gly mõjutab WT ja glr3.3 membraanipotentsiaali lehed: (a) tüüpilised membraanipotentsiaali muutused Glu või Gly-ga töödeldud tomati WT või glr3.3 mutantsete lehtede puhul; b) membraanipotentsiaali amplituudimuutuste kvantifitseerimine. Paneeli (b) tulemused on esitatud keskmiste väärtustena ± SD; n=4. Statistiliselt olulisi erinevusi raviviiside vahel (p < 0,05, Tukey test) näidatakse erinevate tähtedega. Ülalkirjeldatud katsed viidi läbi kolm korda, iga kord samade tulemustega.

Glr3.3 mutandid olid B. cinerea suhtes tundlikumad, mis oli kooskõlas Glu- või Gly-indutseeritud elektriliste signaalide vähenemisega. Nendele tähelepanekutele tuginedes püstitasime hüpoteesi, et Glu ja Gly äratundmine GLR-ide poolt on B. cinerea vastase immuunsuse seisukohalt kriitilise tähtsusega. Selle hüpoteesi kontrollimiseks viidi läbi farmakoloogiline analüüs Glu- või Gly-eksogeense töötlemisega. Enne B. cinerea inokuleerimist töödeldi WT taimi ja glr3.3 mutanti Glu, Gly või H2O-ga (kontroll).

WT taimedes leevendas B. cinerea inokuleerimisest põhjustatud ΦPSII vähenemist ja B. cinerea aktiini mRNA akumulatsiooni suurenemist märkimisväärselt eeltöötlemine eksogeense Glu või Glyga 3 dpi juures (joonis 5). Kuid glr3.3 mutandi haigussümptomid olid raskemad ning Glu ja Gly kasulik mõju resistentsusele B. cinerea vastu vähenes oluliselt GLR3.3 väljalangemise tõttu. Seega näitavad need tulemused, et Glu- ja Gly-indutseeritud taimede immuunsus B. cinerea vastu sõltub osaliselt GLR3.3-st.

Joonis 5. Glu- või Gly-indutseeritud immuunsus B. cinerea vastu sõltub osaliselt GLR3.3-st. Nelja nädala vanuseid tomatitaimi töödeldi 20 mM Glu, 20 mM Gly või veega üks kord päevas kaks päeva enne B. cinerea inokuleerimist: (a) tomatilehtede pseudovärvilised kujutised, mis näitasid ΦPSII-d 3 dpi juures. ; b) ΦPSII kvantifitseerimine 3 dpi juures; c) B. cinerea aktiini transkriptsiooni arvukus tomatilehtedes, mis on nakatatud B. cinereaga 1 dpi juures. Tulemused paneelides (b, c) on esitatud keskmiste väärtustena ± SD; n=4. Statistiliselt olulisi erinevusi raviviiside vahel (p < 0,05, Tukey test) näidatakse erinevate tähtedega. Ülalkirjeldatud katsed viidi läbi kolm korda, iga kord samade tulemustega.

4. Arutelu

s on katioonkanali valgud, mis eksisteerivad bakterites, taimedes ja loomades. Loomadel on tõestatud, et GLR-id osalevad neurotransmissioonis ja immuunregulatsioonis ning nende ligand Glu toimib signaaliagensina kahe süsteemi vahel [34–36]. Taimedes mängivad GLR-id positiivset rolli immuunsuses biootilise stressi vastu [10, 12, 13]. Eelkõige on näidatud, et GLR-indutseeritud kaitse RKN-ide ja putukahammustuste vastu on seotud elektriliste signaalidega [3]. Kuid seos GLR-vahendatud seenhaiguste resistentsuse ja elektriliste signaalide vahel ei ole täielikult põhjendatud. Siin pakume veenvaid tõendeid, mis näitavad, et tomati GLR33- ja GLR35-moduleeritud taime immuunsus tüüpilise seenpatogeeni B. cinerea vastu on seotud elektriliste signaalidega.

Selles uuringus avalikustati esimest korda GLR-ide roll tomati seemikute immuunsuses B. cinerea vastu. GLR inhibiitori DNQX kasutamine suurendas tomatitaimede vastuvõtlikkust B. cinerea suhtes (joonis 1). Veelgi enam, GLR3.3 või GLR3.5 väljatõrjumine nõrgendas oluliselt taimede immuunsust, põhjustades haiguse sümptomite suurenemist lehtedes (joonis 3). Need leiud toetavad arvamust, et tomatitaimed vajavad GLR-e, et luua piisav kaitse nekrotroofse seenpatogeeni B. cinerea vastu. Kuigi redise GluR üleekspressioon inhibeerib B. cinerea kasvu [37], ei leitud, et ükski Arabidopsis glr mutant oleks B. cinerea suhtes tundlikum [12], mis viitab sellele, et GLR-ide funktsioon võib liikide lõikes erineda. Käesolevas uuringus näitasid glr3.3/glr3.5 topeltmutandid tundlikumat fenotüüpi võrreldes ühemutantse glr3.3 ja glr3.5-ga. Need leiud viitavad sellele, et GLR3.3 ja GLR3.5 toimivad üleliigselt. Eelkõige viitab glr3.3 ja glr3.5 mutantide fenotüüpide võrdlus sellele, et GLR3.3 mängib peamist rolli kaitses B. cinerea vastu.

Elektrilised signaalid on kiire reaktsioon, mis on seotud GLR-vahendatud taimede resistentsusega biootilise stressi suhtes. Siin nõrgenesid Glu või Gly poolt indutseeritud elektrilised signaalid glr3.3 mutantides oluliselt. Glu või Gly töötlemine indutseeris membraanipotentsiaali lühikeseks ajaks. Siiski on glr3.3 mutantide amplituudi varieeruvus oluliselt vähenenud (joonis 4). Samamoodi on Arabidopsises lehtede kahjustusest põhjustatud elektriliste signaalide genereerimine ja levimine nõrgenenud glr3.3 ja glr3.6 mutantides [3]. Haava põhjustatud pinnapotentsiaali muutuste nõrgenemine väljendub aga kestuse lühenemises, kuid amplituud jäi pärast lehtede haavamist Arabidopsis glr3.3 mutantidel samaks, mis WT. Need erinevused tulemustes võivad olla tingitud liikide ja raviviiside erinevustest. Kooskõlas meie tulemustega pärsib GLR3.3 väljatõrjumine Arabidopsise juurtes Glu-ravi põhjustatud membraani depolarisatsiooni [38]. Kõik need tulemused viitavad sellele, et Glu või Gly poolt indutseeritud elektrilised signaalid sõltuvad osaliselt GLR3.3-st.

Eksogeenne töötlemine Glu-ga kutsub esile immuunvastuse mitmele haigusele, nagu riisipuhastusseen Magnaporthe Oryza, nekrotroofne seen Alternaria alternata tomati viljades ja mullas leviv bakteriaalne patogeen Ralstonia solanacearum [39–41]. Sun et al. (2019) teatas, et Glu-ravi suurendab tomativiljade resistentsust B. cinerea vastu [42]. Käesolevas uuringus kutsus eksogeenne töötlemine Glu või Gly-ga WT taimedes esile immuunsuse B. cinerea vastu; selle ravi eelised olid aga glr3.3 mutandi puhul oluliselt inhibeeritud (joonis 5). Siin esitatud andmed näitasid, et GLR3.3 oli vajalik Glu- või Gly-indutseeritud immuunsuse jaoks B. cinerea vastu. Seega viitavad need leiud sellele, et Glu või Gly poolt indutseeritud B. cinerea resistentsus sõltub osaliselt GLR3.3-st.

Siin esitatud andmete põhjal teeme ettepaneku, et GLR-id osaleksid kaitsereaktsioonides B. cinerea vastu elektriliste signaalide kaudu. Arvestades fütohormoonide poolt vahendatud immuunsust, hõlbustab salitsüülhappe signaalirada kaitset biotroofsete ja hemibiotroofsete patogeenide vastu, samas kui JA / etüleeni signaalirada toimib nekrotroofsete patogeenide vastu [43, 44]. Antagonistlik seos nende kahe raja vahel on ilmne paljudes taimede patosüsteemides [45,46].

Siiski on näidatud, et GLR3.3 vahendab positiivselt resistentsust biotroofse patogeeni Pst DC3000 vastu, olles samal ajal hädavajalik immuunsuse tagamiseks nekrotroofse patogeeni B. cinerea vastu. Meie ettepanek on mõistlik, kuna GLR3.3 suudab ära tunda Glu, mida peetakse omamoodi DAMP-ks [6,47]. DAMP-id käivitavad varajasi sekundaarseid signaale ja indutseerivad SA / etüleeni, SA signaali kaitsegeeni ekspressiooni. Lisaks põhjustab tehisvoolu süstimine varre pinnale JA-de akumuleerumise märkimisväärselt suurenemist taimedes [13].

Nende tulemuste põhjal võib GLR3.3 mängida rolli taimede resistentsuse varases faasis Glu- või Gly-indutseeritud elektriliste signaalide kaudu, mis reageerivad sekundite või minutite jooksul hormooni signaaliülekande rajast ülesvoolu. JA signalisatsioonirada võivad aktiveerida ka elektrilised signaalid. Lisaks on hästi dokumenteeritud, et AtGLR3.3 osaleb taimede resistentsuses, vahendades [Ca2 pluss] tsütaarseid variatsioone ja oksüdatsioonireaktsioone [12]. Nende radade ja elektriliste signaalide vaheline seos taimede resistentsuse reguleerimisel B. cinerea vastu nõuab edasist uurimist.

5. Kokkuvõtted

Siin esitatud andmed näitavad, et GLR3.3 ja GLR3.5 mängivad elektriliste signaalide kaudu positiivset rolli tomatitaimede kaitses nekrotroofse patogeeni B. cinerea vastu. Meie uuring annab uusi teadmisi taimede kaitsemehhanismist B. cinerea vastu. Sellegipoolest on huvitav täiendavalt uurida seost mitme GLR-i indutseeritud signaaliradade vahel, mis aitavad kaasa taime immuunsusele seenpatogeenide vastu.

Autori kaastööd:

Kontseptualiseerimine, SF, CP ja KS; metoodika, KS; tarkvara, SF ja PW; valideerimine, SF, CP ja KS; formaalne analüüs, SF, CH ja QM; uurimine, SF, CP ja SD; ressursid, KS; andmete kureerimine, SF ja CP; kirjutamine – algse eelnõu ettevalmistamine, SF ja KS; kirjutamine-retsenseerimine ja toimetamine, KS; järelevalve, KS; projektihaldus, KS; rahastamise omandamine, KS Kõik autorid on käsikirja avaldatud versiooni läbi lugenud ja sellega nõustunud.

Rahastamine:

Seda tööd toetasid Hiina riiklik loodusteaduste sihtasutus (31772355, 32172650), Zhejiangi provintsi loodusteaduste sihtasutus silmapaistvate noorte teadlaste jaoks (LR19C150001), Zhejiangi provintsi võtmeuuringute ja arendusprogramm (2021C02040) ja Starry Night. Zhejiangi ülikooli Shanghai süvauuringute instituudi (SN-ZJU-SIAS-0011) ​​teadusfond.

Institutsioonilise ülevaatenõukogu avaldus:

Ei kohaldata.

Teadliku nõusoleku avaldus:

Ei kohaldata.

Andmete kättesaadavuse avaldus:

Selle artikli järeldusi toetavad algandmed teevad autorid ilma liigsete reservatsioonideta kättesaadavaks.

Tänuavaldused:

Autorid soovivad avaldada oma siirast tänu Hiina riiklikule loodusteaduste sihtasutusele, Zhejiangi provintsi loodusteaduste sihtasutusele, Zhejiangi provintsi võtmeuuringute ja arendusprogrammile ning Zhejiangi ülikooli Shanghai edasijõudnute instituudi Starry Night teadusfondile. Õppige nende rahalise toetuse saamiseks.

Huvide konfliktid:

Autorid ei kinnita huvide konflikti.

Viited

1. Gilroy, S.; Suzuki, N.; Miller, G.; Choi, töörühm; Toyota, M.; Devireddy, AR; Mittler, R. Signaalide tõusulaine: kaltsium ja ROS kiire süsteemse signaalimise esirinnas. Trends Plant Sci. 2014, 19, 623–630. [CrossRef]

2. Hedrich, R.; Salvador-Recatala, V.; Dreyer, I. Elektrijuhtmestik ja jaamade kaugside. Trends Plant Sci. 2016, 21, 376–387. [CrossRef]

3. Mousavi, SA; Chauvin, A.; Pascaud, F.; Kellenberger, S.; Farmer, EE Glutamaadi retseptori sarnased geenid vahendavad lehtedelt lehtedele haava signaaliülekannet. Loodus 2013, 500, 422–426. [CrossRef]

4. Choi, töörühm; Miller, G.; Wallace, I.; Harper, J.; Mittler, R.; Gilroy, S. Kiire kaugsignaali korraldamine seadmetes Ca2 plus, ROS ja elektriliste signaalidega. Plant J. 2017, 90, 698–707. [CrossRef]

5. Marcec, MJ; Gilroy, S.; Poovaiah, BW; Tanaka, K. Ca2 plusi ja ROS-i signaalide vastastikune koosmõju taime immuunvastuses. Plant Sci. 2019, 283, 343–354. [CrossRef]

6. Toyota, M.; Spencer, D.; Sawai-Toyota, S.; Jiaqi, W.; Zhang, T.; Koo, AJ; Howe, GA; Gilroy, S. Glutamaat käivitab kaugmaa kaltsiumipõhise taimekaitsesignaali. Teadus 2018, 361, 1112–1115. [CrossRef]

7. Wudick, MM; Michard, E.; Oliveira, NC; Feijo, JA Taimsete ja loomade glutamaadi retseptorite võrdlemine: ühised tunnused, kuid erinevad saatused? J. Exp. Bot. 2018, 69, 4151–4163. [CrossRef]

8. Ni, J.; Yu, Z.; Du, G.; Zhang, Y.; Taylor, JL; Shen, C.; Xu, J.; Liu, X.; Wang, Y.; Wu, Y. Rice GLUTAMATE RECEPTOR-LIKE perekonna heteroloogne ekspressioon ja funktsionaalne analüüs näitab selle rolli glutamaadi käivitatud kaltsiumi voolus riisijuurtes. Riis 2016, 9, 9. [CrossRef] [PubMed]

9. Aouini, A.; Matsukura, C.; Ezura, H.; Asamizu, E. Tomati genoomis kodeeritud 13 glutamaadi retseptoritaolise geeni iseloomustus struktuuri, fülogeneesi ja ekspressiooniprofiilide järgi. Gene 2012, 493, 36–43. [CrossRef] [PubMed]

10. Li, F.; Wang, J.; Ma, C.; Zhao, Y.; Wang, Y.; Hasi, A.; Qi, Z. Glutamaadi retseptoritaoline kanal 3.3 osaleb Arabidopsises glutatiooni käivitatud tsütosoolse kaltsiumi transientide, transkriptsioonimuutuste ja kaasasündinud immuunvastuste vahendamises. Plant Physiol. 2013, 162, 1497–1509. [CrossRef] [PubMed]

11. Nguyen, CT; Kurenda, A.; Stolz, S.; Chetelat, A.; Farmer, EE Rakupopulatsioonide tuvastamine, mis on vajalikud lehtedest lehtedeni elektriliseks signaalimiseks haavatud taimes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2018, 115, 10178–10183. [CrossRef]

12. Manzoor, H.; Kelloniemi, J.; Chiltz, A.; Wendehenne, D.; Pugin, A.; Poinssot, B.; Garcia-Brugger, A. Glutamaadi retseptori AtGLR3.3 osalus taimekaitses signaalimises ja resistentsuses Hyaloperonospora arabidopsidis vastu. Plant J. 2013, 76, 466–480. [CrossRef] [PubMed]

13. Wang, G.; Hu, C.; Zhou, J.; Liu, Y.; Cai, J.; Pan, C.; Wang, Y.; Wu, X.; Shi, K.; Xia, X.; et al. Süsteemne juurevõsu signaalimine juhib jasmonaadipõhist juurekaitset nematoodide vastu. Curr. Biol. 2019, 29, 3430–3438. [CrossRef] [PubMed]

14. Darwin, CR Insectivoous Plants; John Murray: London, Suurbritannia, 1875.

15. Burdon-Sanderson, JS Märkus elektriliste nähtuste kohta, mis kaasnevad Dionæa muscular lehtede ärritusega. Proc. R. Soc. London. 1873, 21, 495–496.

16. Suhhova, E.; Akinchits, E.; Sukhov, V. Taimede elektrilise aktiivsuse matemaatilised mudelid. J. Membr. Biol. 2017, 250, 407–423. [CrossRef]

17. Li, JH; ventilaator, LF; Zhao, DJ; Zhou, Q.; Yao, JP; Wang, ZY; Huang, L. Taimede elektrilised signaalid: multidistsiplinaarne väljakutse. J. Plant Physiol. 2021, 261, 153418. [CrossRef] [PubMed]

18. Garcia-Servin, MA; Mendoza-Sanchez, M.; Contreras-Medina, LM Elektrisignaalid kui võimalus taimedega suhtlemiseks: ülevaade. Theor. Exp. Plant Physiol. 2021, 33, 125–139. [CrossRef]

19. Li, M.; Wang, F.; Li, S.; Yu, G.; Wang, L.; Li, Q.; Zhu, X.; Li, Z.; Yuan, L.; Liu, P. Importijad juhivad jasmoonhappe lehtedelt lehtedele ülekandumist haavast põhjustatud süsteemse immuunsuse korral. Mol. Taim 2020, 13, 1485–1498. [CrossRef]

20. Talunik, EE; Gasperini, D.; Acosta, IF Pigistatud raku hüpotees jasmonaadi sünteesi aktiveerimiseks vastuseks haavale. Uus Phytol. 2014, 204, 282–288. [CrossRef]

21. Ding, S.; Shao, X.; Li, J.; Ahammed, GJ; Yao, Y.; Ding, J.; Hu, Z.; Yu, J.; Shi, K. Lämmastiku vormid ja ainevahetus mõjutavad taimede kaitset lehtede ja juurte patogeenide eest tomatis. Taimerakkude keskkond. 2021, 44, 1596–1610. [CrossRef]

22. Li, X.; Yang, R.; Chen, H. Arabidopsis thaliana vahendaja subühik MED8 reguleerib taimede immuunsust Botrytis Cinerea suhtes, toimides koos põhilise helix-loop-helix (bHLH) transkriptsioonifaktoriga FAMA. PLoS ONE 2018, 13, e193458. [CrossRef]

23. Dean, R.; Van Kan, JA; Pretorius, ZA; Hammond-Kosack, KE; Di Pietro, A.; Spanu, PD; Rudd, JJ; Dickman, M.; Kahmann, R.; Ellis, J.; et al. Top 10 seenpatogeeni molekulaarses taimepatoloogias. Mol. Taimepatol. 2012, 13, 414–430. [CrossRef]

24. Bai, Y.; Lindhout, P. Tomatite kodustamine ja aretamine: mida oleme saanud ja mida võime saada tulevikus? Ann. Bot. 2007, 100, 1085–1094. [CrossRef] [PubMed]

25. Wang, X.; Zhou, X.; Cai, Z.; Guo, L.; Chen, X.; Chen, X.; Liu, J.; Feng, M.; Qiu, Y.; Zhang, Y.; et al. Pseudomonas aeruginosa CQ{1}} biotõrjetüvi, mis soodustab tomatite kasvu ja kontrollib Botrytis cinerea. Patogeenid 2020, 10, 22. [CrossRef]

26. Li, H.; Jiang, X.; Lv, X.; Ahammed, GJ; Guo, Z.; Qi, Z.; Yu, J.; Zhou, Y. Tomato GLR3.3 ja GLR3.5 vahendavad külma aklimatiseerumisest põhjustatud külmakindlust, reguleerides apoplastilist H2O2 tootmist ja redoks-homöostaasi. Taimerakkude keskkond. 2019, 42, 3326–3339. [CrossRef]

27. Hu, C.; Duan, S.; Zhou, J.; Yu, J. Herbivory/haava põhjustatud elektrilise signaali ülekande omadused tomatis. Ees. Põllumajandus. Sci. Eng. 2021, 8, 292–301.

28. Zhang, H.; Hu, Z.; Lei, C.; Zheng, C.; Wang, J.; Shao, S.; Li, X.; Xia, X.; Cai, X.; Zhou, J.; et al. Taimne fütosulfokiini peptiid algatab auksiinist sõltuva immuunsuse tsütosoolse Ca2 pluss signaaliülekande kaudu tomatis. Plant Cell 2018, 30, 652–667. [CrossRef] [PubMed]

29. Zhang, S.; Li, X.; Sun, Z.; Shao, S.; Hu, L.; Jah, M.; Zhou, Y.; Xia, X.; Yu, J.; Shi, K. Antagonism fütohormoonide signaalide vahel on tomatitaimede haigustundlikkuse varieeruvuse aluseks kõrgendatud CO2 taseme all. J. Exp. Bot. 2015, 66, 1951–1963. [CrossRef]

30. Genty, B.; Briantais, JM; Baker, NR Seos fotosünteetilise elektronide transpordi kvantsaagise ja klorofülli fluorestsentsi summutamise vahel. Biochim. Biophys. Acta 1989, 990, 87–92. [CrossRef]

31. Ma, Q.; Liu, Y.; Fang, H.; Wang, P.; Ahammed, GJ; Zai, W.; Shi, K. Mitokondriaalse alfa-ketoglutaraadi dehüdrogenaasi E2 oluline roll tomatite bakteriaalsete patogeenide vastases basaalses immuunvastuses. Ees. Plant Sci. 2020, 11, 579772. [CrossRef]

32. Liao, Y.; Tian, ​​M.; Zhang, H.; Li, X.; Wang, Y.; Xia, X.; Zhou, J.; Zhou, Y.; Yu, J.; Shi, K.; et al. Mitokondriaalse alfa-ketoglutaraadi dehüdrogenaasi E2 salitsüülhappega seondumine mõjutab mitokondriaalset oksüdatiivset fosforüülimist ja elektronide transpordiahela komponente ning mängib rolli põhikaitses tubaka mosaiikviiruse vastu tomatites. Uus Phytol. 2015, 205, 1296–1307. [CrossRef]

33. Stephens, NR; Qi, Z.; Spalding, EP glutamaadi retseptori alatüübid, mida tõendavad erinevused desensibiliseerimises ja sõltuvuses GLR3.3 ja GLR3.4 geenidest. Plant Physiol. 2008, 146, 529–538. [CrossRef] [PubMed]

34. Boldõrev, AA; Puusepp, DO; Johnson, P. Tekkivad tõendid glutamaadi retseptorite sarnase rolli kohta närvi- ja immuunsüsteemis. J. Neurochem. 2005, 95, 913–918. [CrossRef]

35. Fazio, F.; Ulivieri, M.; Volpi, C.; Gargaro, M.; Fallarino, F. Metabotroopsete glutamaadi retseptorite sihtimine neuroinflammatsiooni raviks. Curr. Arvamus. Pharmacol. 2018, 38, 16–23. [CrossRef]

36. Ganor, Y.; Levite, M. Neurotransmitter glutamaat ja inimese T-rakud: Glutamaadi retseptorid ja glutamaadi indutseeritud otsene ja tugev toime inimese normaalsetele T-rakkudele, inimese vähileukeemia ja lümfoomi T-rakkudele ning autoimmuunsetele inimese T-rakkudele. J. Neural Transm. 2014, 121, 983–1006. [CrossRef] [PubMed]

37. Kang, S.; Kim, HB; Lee, H.; Choi, JY; Heu, S.; Oh, CJ; Kwon, SI; Väikese redise plasmamembraanile suunatud glutamaadi retseptori CS üleekspressioon Arabidopsis suurendab glutamaadi vahendatud Ca2 pluss sissevoolu ja aeglustab seeninfektsiooni. Mol. Cells 2006, 21, 418–427.

38. Qi, Z.; Stephens, NR; Spalding, EP kaltsiumi sisenemist vahendab GLR3.3, laia agonistiprofiiliga Arabidopsis glutamaadi retseptor. Plant Physiol. 2006, 142, 963–971. [CrossRef]

39. Kadotani, N.; Akagi, A.; Takatsuji, H.; Miwa, T.; Igarashi, D. Eksogeensed proteinogeensed aminohapped indutseerivad riisis süsteemset resistentsust. BMC Plant Biol. 2016, 16, 60. [CrossRef] [PubMed]

40. Seo, S.; Nakaho, K.; Hong, SW; Takahashi, H.; Shigemori, H.; Mitsuhara, I. L-histidiin indutseerib taimedes resistentsust bakteriaalse patogeeni Gastonia solanacearum suhtes osaliselt etüleeni signaalimise aktiveerimise kaudu. Plant Cell Physiol. 2016, 57, 1932–1942. [CrossRef]

41. Yang, J.; Sun, C.; Fu, D.; Yu, T. Alternaria alternata kasvu L-glutamaadi inhibeerimise test, indutseerides tomativiljades resistentsust. Food Chem. 2017, 230, 145–153. [CrossRef]

42. Sun, C.; Jin, L.; Cai, Y.; Huang, Y.; Zheng, X.; Yu, T. L-glutamaadiga töötlemine suurendab tomati viljade haiguskindlust, kutsudes esile glutamaadi retseptorite ekspressiooni ja aminohapete akumulatsiooni. Food Chem. 2019, 293, 263–270. [CrossRef]

43. Li, N.; Han, X.; Feng, D.; Yuan, D.; Huang, LJ Signaliseerimine salitsüülhappe ja etüleeni/jasmonaadi vahel taimekaitses: kas me mõistame, mida nad sosistavad? Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 671. [CrossRef] [PubMed]

44. Talunik, EE; Gao, YQ; Lenzoni, G.; Wolfender, JL; Wu, Q. Haava- ja mehhanostimuleeritud elektrilised signaalid kontrollivad hormoonreaktsioone. Uus Phytol. 2020, 227, 1037–1050. [CrossRef] [PubMed]

45. Zhang, Y.; Laul, RF; jüaan, HM; Li, TT; Wang, LF; Lu, KK; Guo, JX; Liu, WC CATALASE2 N-otsa üleekspresseerimine suurendab taimede jasmoonhappe biosünteesi ja resistentsust nekrotroofse patogeeni Botrytis cinerea B05.10 suhtes. Mol. Taimepatol. 2021, 22, 1226–1238. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Carls, L.; Van der Does, D.; Hickman, R.; Jansen, W.; Verk, MC; Proietti, S.; Lorenzo, O.; Solano, R.; Pieterse, CM; Van Wees, SC Etüleeni reaktsioonifaktori transkriptsioonirepressorite rolli hindamine jasmoonhappele reageerivate geenide salitsüülhappe vahendatud supressioonis. Plant Cell Physiol. 2017, 58, 266–278. [CrossRef]

47. Tanaka, K.; Heil, M. Kahjustusega seotud molekulaarsed mustrid (DAMP) taimede kaasasündinud immuunsuses: ohumudeli ja evolutsiooniliste perspektiivide rakendamine. Annu. Rev. Phytopathol. 2021, 59, 53–75. [CrossRef]

Shuxian Feng †, Caizhe Pan †, Shutting Ding, Qiaomei Ma, Chaoyi Hu, Ping Wang ja Kai Shi *.

Zhejiangi ülikooli aiandusosakond, Hangzhou 310058, Hiina; 21916054@zju.edu.cn (SF)

22016198@zju.edu.cn (CP); 3130100256@zju.edu.cn (SD); 11916060@zju.edu.cn (QM); cyhu@zju.edu.cn (CH); 11916061@zju.edu.cn (PW)

Kirjavahetus: kaishi@zju.edu.cn; Tel.: pluss 86-0571-88982383

Need autorid on sellesse töösse võrdselt panustanud.

For more information:1950477648nn@gmail.com